CN103361277B - 一株溶磷白地霉p14及其应用方法和制备的菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株溶磷白地霉P14及其应用方法和制备的菌剂,属于微生物肥料技术领域。本发明的目的是采用筛选的溶磷真菌,从生物学角度实现高效溶磷。其制备的菌剂具有将土壤中多种难溶性的磷酸盐高效转化为水溶性形态,从而供植物吸收利用。此菌剂适合红土壤、潮土、褐土等多种土壤类型,具有释放土壤难溶磷、防止磷的土壤化学固定,提高磷肥利用效率,改善作物农艺性状和提高产量的效果。
Description
技术领域
本发明属于土壤微生物菌剂领域,具体地是涉及一株溶磷白地霉P14(Galactomycesgeotrichum P14)、含有该菌的溶磷菌剂的制备和应用。
背景技术
目前,农业生产对磷肥的需求日益增大,据统计我国土壤缺磷的面积约占总耕地面积的2/3。主要方法是依靠施用化学磷肥,但是造成了土壤土质恶化,肥力下降,产生土壤板结,引起土壤酸化,有害物质对土壤污染等现象。尤其《第一次全国污染源普查公报》结果显示,农业对自然环境的破坏程度达到了历史最高点,主要为化肥和农药等泛滥使用。要想解决农业污染的问题,在大力提高农业的生产效率基础上,同时也要大程度地限制化肥和农药的用量,这些有赖于微生物菌肥技术。
我国磷肥资源比较缺乏,靠大量进口满足农业生产的方式提高了生产成本。土壤本身含有丰富的磷元素,但90%以上是矿物磷形态存在,其不能让作物直接利用,而施用能够分解土壤中难溶态磷的溶(解)磷菌肥料,使其在作物根际形成一个磷素供应区,改善作物有效磷的供应,是一个有效地将土壤中磷利用的重要途径,对我们目前和未来的粮食安全意义重大,同时应用前景十分可观。
首先Staltrom和Sachett发现土壤溶(解)磷微生物,1950年Menkina从土壤中分离出降解有机磷和溶解磷酸三钙的巨大芽孢杆菌。Jonson最早研究了真菌Aspergillus niger的溶磷作用。同时,科学家对溶(解)磷微生物活化土壤难溶解磷的能力进行了不懈研究。田间条件下,利用32P同位素稀释法研究发现,用拜莱青霉菌(Penicillium bilaii)接种的小麦所吸收的磷元素有18%来自于难溶性磷矿,对于没有接种的土壤则植物无法利用这种磷源。同时其溶磷特性不受土壤有效磷的抑制。同时,溶(解)磷微生物具有促进作物生长和改善作物农艺性状的作用(Freitas等,1997;Katiyar等,2003),还有促进作物吸磷、提高作为产量效果(Chabot,1996;Peix等,2001),例如溶磷青霉菌接种小麦能够提高产量15~18%(Wakelin等,2007)。上述结果表明溶(解)磷菌对于农业具有巨大应用潜力。
首先,前苏联开展了解磷巨大芽孢杆菌的大面积应用(Cooper,1959),同时其它国家也引进用于生产。印度自20世纪70年代以来生产和应用了解磷微生物肥料,产品有Phosphobacterin(Sharma and Singh,1971)、Microphos(Tomar,1994)、Phosphotika(Ahlawatand Rai,1997)和Azophos(premalatha等,2004)。加拿大的Philom Bios公司使用溶磷青霉菌生产溶磷微生物菌肥(商品名Jumpstart)平均增产6~9%(Gleddie等,1991)。我国目前应用最多的还是上个世纪50~60年代筛选的溶(解)磷菌株(葛诚,吴薇1995;姜瑞波,2005)。虽然溶(解)磷微生物肥料进入商业化生产和较大规模的使用,但是真正用于农业生产的菌株很少。
据不完全统计,全世界共筛选出36属,92种溶(解)磷微生物,其中细菌60个种,放线菌4个种,真菌28个种。环境中丰富的溶(解)磷微生物菌种资源与目前较少的用于生产使用形成了对比。因此筛选高效溶(解)磷、环境适应能力强的优良菌株仍是核心,尤其是能够显著溶解土壤难溶磷,提高磷肥利用效率、适应不同地域的土壤类型的高效溶(解)磷菌株。本发明涉及的溶磷白地霉P14的溶解磷能力显著高于拜莱青霉菌和溶磷草酸青霉菌P8(Penicillium oxalicum P8)。溶磷白地霉P14菌株能够溶解土壤多种难溶磷如磷酸三钙、磷酸八钙和磷酸十钙,其促进作物吸磷和生长的效果。在土壤条件下稳定,亦不受磷肥施用的影响。同时,它能够增强外源难溶磷的生物利用率,减少土壤对磷的化学固定。在溶解磷酸三钙、磷酸八钙等过程中,其分泌有机酸、多肽和酸性磷酸酶,分泌量高低与水溶性磷浓度呈高度负相关。溶磷白地霉P14溶解磷的作用是有机酸、多肽和酸性磷酸酶共同参与的结果。其诸多特征具有优越性。
发明内容
本发明的目的是提供一株溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14)及其应用。
本发明的目的是提供一种含有溶磷白地霉P14的溶磷菌剂。
本发明的目的是提供一种溶磷白地霉P14的应用。
一株溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14),保藏号为:CGMCC No.7680。
所述的溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14)的应用方法,用于将难溶态磷转化为可溶态磷,或者用于制备将难溶态磷转化为可溶态磷的菌剂。
所述的难溶态磷包括:Ca3(PO4)2、Ca8H2(PO4)6·7H2O、CaHPO4、FePO4、骨粉和摩洛哥磷矿粉中的一种或几种。
一种溶磷菌剂,所述的溶磷菌剂包括如下重量份的组分:
溶磷白地霉P14CGMCC No.7680发酵培养物 1份
添加剂 8-16份
其中,所述添加剂为草炭或者硅藻土,吸附溶磷白地霉P14发酵培养物后,菌体含量不低于107cfu/g。
所述的溶磷菌剂的制备方法,包括以下步骤:
将溶磷白地霉P14菌株接种于土豆综合培养基PDA上,26℃~29℃培养24h~28h,然后接入500mL三角瓶,26℃~29℃,180rpm~200rpm下液体培养36h~40h;然后按体积比1%~2%接种量接入到装液量为60%的50L种子罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养24h~28h后,再按体积比5%~10%的接种量装入到装液量为65%的1000L的发酵罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养3d后含菌量达109CFU/mL;发酵完成后,按照1︰8~16的质量比例加入灭好菌的草炭或者硅藻土,混匀,烘干至含水分25~30%,细度为60目~80目。
发酵罐中培养基的组成:
可溶性淀粉10g/L;玉米粉5g/L;酵母粉5g/L;蔗糖10g/L;(NH4)2SO40.5g/L;KCl0.3g/L;NaCl0.3g/L;KH2PO40.1g/L;MgSO4·7H2O0.3g/L;FeSO40.03g/L;MnSO4·4H2O0.03g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4。
三角瓶液体培养基组成:去皮土豆150g/L,玉米粉10g/L,葡萄糖20g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L;加水定容至1L;pH自然。
种子罐中培养基组成:酵母粉0.5g/L;葡萄糖10.0g/L;KH2PO41.0g/L;(NH4)2SO40.5g/L;NaCl0.2g/L;MgSO4·7H2O0.03g/L;MnSO40.03g/L;FeSO40.003g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4。
本发明的一株溶磷白地霉P14,是2010年从湖南省长沙市浏阳磷矿周边的红壤磷矿土质中分离。
本发明所提供的溶磷白地霉P14,其具有如下微生物学特性:
1、溶磷白地霉P14菌落在PDA上28℃生长3天,直径20—30mm,丝状,产生大量的分生孢子结构,边缘近于白色,中间微黄色,无渗出液,反面淡黄色。
2、分生孢子圆柱形,通常3.5~5.4μm×2.2~3.0μm。
3、溶磷白地霉P14的生理生化特性如下:
表1 P14菌株的形态和生理生化特性
4、溶磷白地霉P14的同源性特征,见图1。
本发明的溶磷白地霉P14具有提高土壤溶解磷含量的作用,尤其具有溶解土壤中多种难溶磷的作用,可以防止磷的土壤化学固定,提高磷肥利用率的功能。适合红壤土、褐土、潮土等多种土壤类型。
本发明的溶磷白地霉P14在液体培养条件下,对其溶(解)磷机理研究得出:其分泌有机酸、多肽、酸性磷酸酶的含量受培养基中水溶磷浓度的显著影响,分泌量高低与水溶性有效磷浓度呈高度负相关。因此这些分泌物与溶磷密切相关。
本发明的溶磷白地霉P14及其溶(解)磷菌剂,具有如下效果:
①、本发明的溶磷白地霉P14,能溶解土壤难溶磷。在固体培养基上溶磷白地霉P14表现较强的溶解Ca3(PO4)2、Ca8H2(PO4)6·7H2O、CaHPO4、FePO4、骨粉和摩洛哥磷矿粉(MPR)的能力。
②、接种溶磷白地霉P14能够显著增加土壤的有效磷含量,减少磷肥用量,提高磷肥利用率。
③、土壤接种溶磷白地霉P14能够显著促进作物根系发育、提高作物的生物量。
本发明溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14)保藏编号为CGMCC No.7680;保藏时间2013年6月4日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
附图说明
图1为溶磷白地霉P14同源性特征;
图2为溶磷白地霉P14菌株形态。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。
实施例1溶磷白地霉菌株P14及其溶磷菌剂的制备
1、发酵罐培养基的组成(g/L)
可溶性淀粉10g/L;玉米粉5g/L;酵母粉5g/L;蔗糖10g/L;(NH4)2SO40.5g/L;KCl0.3g/L;NaCl0.3g/L;KH2PO40.1g/L;MgSO4·7H2O0.3g/L;FeSO40.03g/L;MnSO4·4H2O0.03g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4。
三角瓶液体培养基组成:去皮土豆150g/L,玉米粉10g/L,葡萄糖20g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L;加水定容至1L;pH自然。
种子罐中培养基组成:酵母粉0.5g/L;葡萄糖10.0g/L;KH2PO41.0g/L;(NH4)2SO40.5g/L;NaCl0.2g/L;MgSO4·7H2O0.03g/L;MnSO40.03g/L;FeSO40.003g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4。
2、培养过程
将溶磷白地霉P14菌株接种于土豆综合培养基(PDA)上,26℃~29℃培养24h~28h,然后接入500mL三角瓶,26℃~29℃,180rpm~200rpm下液体培养36h~40h。然后按体积比1%~2%接种量接入到装液量为60%的50L种子罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养24h~28h后,再按体积比5%~10%的接种量装入到装液量为65%的1000L的发酵罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养3d后含菌量达109CFU/mL。发酵完成后,按照1︰8~16的比例加入灭好菌的草炭或者硅藻土,混匀,烘干至含水分25~30%,细度为60目~80目。检测,包装。
实施例2溶磷白地霉P14的溶磷能力
1、固体培养条件下的溶磷效果
在选择性培养基——改良Pikovskaya培养基(培养基组成(g/L):(NH4)2SO4 0.5,NaCl 0.2,MgSO4·7H2O 0.03,KCl 0.2,MnSO4 0.03,FeSO4 0.003,酵母粉0.5,葡萄糖10.0,磷源5.0)——上,将在长沙浏阳磷矿周边的红壤磷矿土质中采集的土壤样品进行逐级稀释,以土壤溶液的10-4涂布平板,进行了溶(解)磷微生物的分离。根据溶磷圈的大小初步分离出解磷细菌和真菌30株。然后,在以磷酸三钙为唯一磷源的选择性培养基上,进一步比较了这些溶(解)磷菌株的溶磷能力,真菌溶磷能力大于细菌,最后获得一株溶磷能力较强的真菌P14。结合菌株P14形态、生理生化指标和18S rDNA序列分析,鉴定其属于白地霉属(Galactomyces geotrichum),命名为溶磷白地霉P14。其与溶磷草酸青霉菌P8、拜莱青霉菌ATCC20851和巨大芽孢杆菌ATCC14581在不同磷源琼脂培养基上溶磷圈和菌落生长直径进行了比较(表2)。结果显示溶磷白地霉P14和溶磷草酸青霉菌溶磷特性优于拜莱青霉菌和巨大芽孢杆菌。
表2溶磷白地霉在不同磷源琼脂培养基上菌落生长与溶磷圈直径(mm)
注:“—”表示无溶磷圈
以难溶磷酸盐为唯一磷源的Pikovskaya改良固体选择性培养基上,28℃培养3天后,菌株P14以及对照菌株溶磷草酸青霉菌P8、拜莱青霉菌ATCC20851和巨大芽孢杆菌ATCC14581,对骨粉、FePO4、CaHPO4、Ca3(PO4)2、磷酸八钙、摩洛哥磷矿粉(MPR)的溶磷能力进行了比较,P14表现出较强的溶解骨粉、FePO4、CaHPO4、Ca3(PO4)2、磷酸八钙、摩洛哥磷矿粉的能力(表3)。溶磷能力显著高于对照菌株溶磷草酸青霉菌P8、拜莱青霉菌和巨大芽孢杆菌。本发明菌株P14溶磷种类多、效率高、适应能力强,具有应用潜力。
表3接种溶磷白地霉平板培养基3d的溶磷量(P:mg/20mL)
注:“—”表示未检出有效磷
2、在液体培养条件下的溶磷效果
在以难溶磷酸盐为唯一磷源的液体培养基(培养基组成(g/L):(NH4)2SO4 0.5,NaCl0.2,MgSO4·7H2O 0.03,KCl 0.2,MnSO4 0.03,FeSO4 0.003,酵母粉0.5,葡萄糖10.0,摩洛哥磷矿粉(≤80目)5.0)中,28℃培养溶磷白地霉P14、溶磷草酸青霉菌P8和拜莱青霉菌以及不接菌的对照,180rpm,溶磷能力测定结果如表4所示。
表4液体培养条件下不同溶磷菌3d转化MPR为水溶磷的数量
溶磷白地霉P14、溶磷草酸青霉菌和拜莱青霉菌都有明显的溶磷效果,菌株间差异显著(P<0.05),铵态氮供应时,溶磷白地霉P14经过3d的培养,50mL培养基中的水溶磷为10.23mg,较溶磷草酸青霉菌和拜莱青霉菌分别提高0.99mg和5.09mg,差距显著。硝态氮供应时,溶磷白地霉P14的溶磷量高于铵态氮。50mL培养基中的水溶磷为12.11mg,占磷矿粉中总磷的48.1%,较溶磷草酸青霉菌和拜莱青霉菌分别提高2.94mg和4.27mg。在硝态氮和铵态氮条件下,溶磷白地霉P14的溶磷量都显著高于其它组。
实施例3溶磷白地霉P14对外源难溶磷的利用
在盆栽条件下,采用轻壤质潮土,玉米为供试作物,研究了溶磷白地霉P14对外源难溶磷的生物有效性影响的效果,试验用难溶磷包括磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸铁、磷酸铝、骨粉、氟磷灰石、摩洛哥磷矿石作为供试磷源,溶磷效果如表5所示。
表5不同磷源处理土壤有效磷随时间的变化
本试验条件下,结果显示溶磷白地霉P14对Ca3(PO4)2、AlPO4、MPR的活化能力较强,对FePO4活化作用较弱,表现了溶磷白地霉P14对难溶磷种类有一定选择性。溶磷白地霉P14作用下,磷酸三钙释放磷元素最快,骨粉、磷酸铝次之。不接种溶磷白地霉时几乎未显示增加生物产量的效果,因此溶磷白地霉P14对增强难溶磷的生物有效性具有显著性。
溶磷白地霉P14的溶磷效果主要表现在10~60d之间,超过60d溶磷效果下降。
实施例4溶磷白地霉P14对不同土壤溶磷的效果
在三种不同土壤环境(1号土壤为轻壤质潮土,有效磷13.5μg/g;2号土壤为中壤质潮土,有效磷4.7μg/g;3号土壤为中壤质脱潮土,有效磷5.2μg/g)中,接种本发明制备的溶磷白地霉P14菌剂180d后,其有效磷显著提高,具有高效溶磷作用。结果如表6所示。
表6接种溶磷白地霉P14菌剂的不同土壤有效磷随时间的变化(μg/g)
溶磷白地霉P14菌剂能够活化土壤中的磷酸八钙、磷酸十钙、磷酸铝等组分。以1号土壤为例,添加菌剂的土壤有效磷含量前30d增加速率最快,从13.5μg/g上升至65.3μg/g,然后速率变缓,在60d后达到稳定状态。此时土壤的有效磷含量已饱和,植物不断吸收利用可以促进该菌株继续降解难溶磷,提供持续的磷源。而未添加菌剂的土壤其有效磷含量基本上没变。2号和3号土壤也是类似情况。在不同土壤条件下,添加菌剂组的有效磷含量都显著高于未添加的。因此该菌剂适合多种类型的土壤。
实施例5溶磷白地霉P14对作物增产效果
通过实施例1的培养过程,制作菌剂,在盆栽条件下,种植玉米,花生,用菌剂(施用量1g/kg土壤)和无机磷肥(施用量为7.5kg/亩,以P2O5计)处理,结果如表7所示。结果显示无机磷肥、无机磷肥+灭活菌剂对增加生物量效果较低,无机磷肥+菌剂处理组优于上述两组。这说明活菌剂P14才能发挥增产作用。但不同作物稍有差异,菌剂在玉米上效果大于花生。
表7溶磷白地霉P14对玉米、花生生物量(mg/盆)的影响
作物 | 处理 | 有效磷(μg/g) | 生物量(kg/盆) |
P2O5 | 2.33 | 1.98 | |
玉米 | P2O5+灭活P14 | 2.45 | 2.04 |
P2O5+P14 | 3.92 | 2.36 | |
P2O5 | 2.42 | 1.84 | |
花生 | P2O5+灭活P14 | 2.37 | 2.01 |
P2O5+P14 | 3.84 | 2.24 |
Claims (5)
1.一株溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14),其特征在于,保藏号为:CGMCC No.7680。
2.权利要求1所述的溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14)的应用方法,其特征在于,用于将难溶态磷转化为可溶态磷;所述的难溶态磷包括:Ca3(PO4)2、Ca8H2(PO4)6·7H2O、CaHPO4、FePO4、骨粉和摩洛哥磷矿粉中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的溶磷白地霉P14(Galactomyces geotrichum P14)的应用方法,其特征在于,用于制备将难溶态磷转化为可溶态磷的菌剂。
4.一种溶磷菌剂,其特征在于,所述的溶磷菌剂包括如下重量份的组分:
溶磷白地霉P14CGMCC No.7680发酵培养物 1份
添加剂 8-16份
其中,所述添加剂为草炭或者硅藻土,吸附溶磷白地霉P14发酵培养物后,菌体含量不低于107cfu/g。
5.权利要求4所述的溶磷菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将溶磷白地霉P14菌株接种于土豆综合培养基PDA上,26℃~29℃培养24h~28h,然后接入500mL三角瓶,26℃~29℃,180rpm~200rpm下液体培养36h~40h;然后按体积比1%~2%接种量接入到装液量为60%的50L种子罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养24h~28h后,再按体积比5%~10%的接种量装入到装液量为65%的1000L的发酵罐中,在180rpm~200rpm,pH7.0~pH7.4,通气量0.3vvm~0.5vvm下,培养3d后含菌量达109CFU/mL;发酵完成后,按照1︰8~16的质量比例加入灭好菌的草炭或者硅藻土,混匀,烘干至含水分25~30%,细度为60目~80目;
接入三角瓶进行液体培养的培养基组成:去皮土豆150g/L,玉米粉10g/L,葡萄糖20g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L;加水定容至1L;pH自然;
发酵罐中培养基的组成:可溶性淀粉10g/L;玉米粉5g/L;酵母粉5g/L;蔗糖10g/L;(NH4)2SO40.5g/L;KCl0.3g/L;NaCl0.3g/L;KH2PO40.1g/L;MgSO4·7H2O0.3g/L;FeSO40.03g/L;MnSO4·4H2O0.03g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4;
种子罐中培养基组成:酵母粉0.5g/L;葡萄糖10.0g/L;KH2PO41.0g/L;(NH4)2SO40.5g/L;NaCl0.2g/L;MgSO4·7H2O0.03g/L;MnSO40.03g/L;FeSO40.003g/L;加水定容至1L;pH7.0~7.4。
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