CN103355730B - 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法。防腐剂包括乳酸链球菌发酵液，以及，按重量百分比计，占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：壳聚糖2～6‰，竹叶抗氧化物1～2‰，六偏磷酸钠１～5％、纳他霉素0.5～1％、大蒜素1～2‰、抗坏血酸钠0.05～0.1％、麦芽糊精1～3％和NaCl0.5～2％。本发明的防腐剂不添加任何化学防腐剂成分，克服了单纯的乳酸链球菌素抗菌谱窄和低PH值依赖性的局限，具有高效、广谱、稳定性好、安全性高的特点，极大的提高了乳酸链球菌素的防腐效果和应用范围，具有较高的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种复合生物防腐剂及其制备方法。
背景技术
乳酸链球菌素（Nisin）亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌产生的一种的多肽物质，它能有效抑制引起食品腐败的嗜热脂肪芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。1969年，***粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会认定乳酸链球菌素为安全的生物食品添加剂。1990年3月29日中国***将其列入GB2760—86的1990年增补品种中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品，目前在食品领域已被60多个国家和地区广泛应用。
乳酸链球菌素的局限性在于它的抑菌普窄使它的应用范围受限，它只能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，不能抑制酵母菌和霉菌等。并且乳酸链球菌素具有低PH值依赖性，一旦pH值超过6.5，活性降低；经115℃高压灭菌后在pH值为2时仍然是稳定的，但在pH值为5时失去40%活性,pH值为6.8时失去90%的活性。另外以乳酸链球菌素为主要成分的复合防腐剂一般采用乳酸链球菌素冻干粉复溶而成，因其本身的溶解度低，而使其有效浓度较低，而且增加了工艺成本，有一定的局限性。而且目前市场上已有的复配防腐剂都是将几种不同的化学防腐剂和乳酸链球菌素进行复配，具有一定的健康危害性，如何研制零添加化学试剂的复配防腐剂，绝对安全的食品防腐剂，是食品行业面临的一个难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了确服乳酸链球菌素抑菌范围窄和稳定性差的缺陷，提供一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂。
本发明还提供了该乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：
一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂，包括乳酸链球菌发酵液，以及，按重量百分比计，占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2～6‰，竹叶抗氧化物1～2‰，六偏磷酸钠１～5％、纳他霉素0.5～1％、大蒜素1～2‰、抗坏血酸钠0.05～0.1％、麦芽糊精1～3％和NaCl 0.5～2％。
本发明利用乳酸链球菌的发酵液制备复合生物防腐，经过发酵液的粗处理、添加生物活性物质、科学配比得到的复合生物防腐剂，其中不添加任何化学防腐成分，通过以上生物活性物质的进行科学配比，利用天然产物本身具有的抗氧化性能，使之与发酵液的抑菌总用协同增效，达到使食品抗氧化保鲜、抑菌防腐、延长食品保质期、提高食品品质和安全性的目的。经抑菌实验和稳定性实验检测具有高效、广谱、稳定性好、安全性高的特点。
优选的，所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2～3‰，竹叶抗氧化物1～1.5‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1～1.5‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.5～0.8％。
优选的，所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2‰，竹叶抗氧化物1‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.5％。
优选的，所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖3‰，竹叶抗氧化物1.5‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1.5‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.8％。
本发明提供的乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌株发酵
将乳酸链球菌进行液体发酵，生产乳酸链球菌素；
（2）发酵液预处理
a.将发酵液用10mol/L的盐酸在搅拌状态下调PH=2-3，80-90℃加热30-60分钟，将乳酸链球菌素完全释放于发酵液中，经板框过滤去除培养基颗粒和菌体，收集滤液；
b.滤液经孔径为15-30万的滤膜去除大分子蛋白和杂质；
（3）发酵液复配
a.将处理后的发酵液添加六偏磷酸钠和麦芽糊精和壳聚糖，调PH值为6.5，充分溶解后，10-25M帕高压均质15-30分钟；
b.向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物、纳他霉素、大蒜素、抗坏血酸钠和NaCl充分混和均匀。
优选的，步骤（1）中发酵条件为：1%-3%接种量，发酵培养基以发酵培养基的总重量计，包括复合氮源2%-4%（其中复合氮源为脱脂牛乳、酵母粉、大豆蛋白胨、牛肉膏任意比的混合物）、复合碳源2-4%（其中复合碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉任意比的混合物）、K2HPO4为1.0-1.5%，MgSO4·7H2O 0.01-0.02%、维生素C0.5%，余量为水，调pH=6.2-7.0，罐压0.1MPa，30-35℃发酵培养13-20h，乳酸球菌为对数生长期末期时停止发酵。
优选的，所述复合氮源为：脱脂牛乳0.8-1%、酵母粉0.8-1%、大豆蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%；所述复合碳源为葡萄糖0.5%、蔗糖1%、可溶性淀粉0.5%。
优选的，所述防腐剂采用液体剂型，使于添加使用，能与不同材质食品混溶，提高防腐效果。
本发明将乳酸链球菌进行发酵，是将乳酸链球菌接种于改良的液体发酵培养基进行发酵产生乳酸链球菌素，其发酵液经过初步处理，利用发酵液的体系与其他生物活性物质进行复配后制成的复合生物防腐剂。
本发明直接利用处理后的发酵液进行复配，发酵液只经过粗略处理，利用发酵液里残存的部分大分子物质和其他无机盐等构成的复杂体系，提高了乳酸链球菌素的抑菌效果，复配后体系稳定，产品稳定性能较好。
本发明的发酵液经板框过滤和无机滤膜超滤进行预处理，工艺简单、发酵液利用率高并减少了污水排放。
复合防腐剂经过抑菌试验和稳定性试验证明增大了单纯的乳酸链球菌素的抑菌范围，并且对热和酸的稳定性较高，解决了乳酸链球菌素抑菌范围窄和稳定性差的局限。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不能理解为对本发明的限制。
本实施方式所使用的乳酸链球菌是：乳酸乳球菌乳酸亚种T0625(Lactococcus lactis subsp．LacfisT0625)，由沈阳农业大学赠送。
复合防腐剂的效价测定采用琼脂扩散法，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，以培养基的总重量计，胰蛋白胨O．8％，酵母膏O．5％，葡萄糖O．5％，NaC10．5％，K2HPO40．5％，Tween20 1％，琼脂1．8％，余量为水，pH6．8。
实施例1
1、菌株发酵
将乳酸链球菌以1%的接种量接种于液体发酵培养基，进行液体发酵。发酵培养基包括：以发酵培养基的总重量计，复合氮源（脱脂牛乳0.8%、酵母粉0.8%、大豆蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%）、复合碳源（葡萄糖0.5%、蔗糖1%、可溶性淀粉0.5%）、K2HPO4为1.0%，MgSO4·7H2O 0.01%、维生素C0.5%，余量为水，调pH6.5，罐压0.1MPa，30℃培养培养20h，停止发酵。
2、发酵液预处理
（1）将发酵液用10mol/L的盐酸在搅拌状态下调PH=2.5，90℃加热30分钟，将乳酸链球菌素完全释放于发酵液中，经板框过滤去除培养基颗粒和菌体，收集滤液。
（2）滤液经孔径为15万的滤膜去除大分子蛋白和杂质。
3、发酵液复配
（1）将处理后的发酵液添加，以乳酸链球菌发酵液总重量计，1％六偏磷酸钠和3％麦芽糊精和壳聚糖2‰，调PH值为6.5，充分溶解后，10-25M帕高压均质15-30分钟。
（2）向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物１‰（产品名：竹叶抗氧化物；规格：8:1；购自润泽生物有限公司，竹叶抗氧化物已列入国标GB-2760，被***批准作为天然食品抗氧化剂使用）、纳他霉素0.5％、大蒜素1‰、抗坏血酸钠0.05％和NaCl0.5％充分混和均匀，得乳酸链球菌素复合生物防腐剂。
本实施例得到的一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂，包括乳酸链球菌发酵液，以及，按重量百分比计，占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2‰，竹叶抗氧化物1‰，六偏磷酸钠1％、纳他霉素0.5％、大蒜素1‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.5％。
4、复配防腐剂的抑菌谱实验
（1）乳酸链球菌标准品用0.02mol/L的盐酸溶液配制成100 IU/mL的标准液，发酵液用无菌水稀释100倍备用。
（2）将金黄色葡糖球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、假单孢杆菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养基（配方是蛋白胨 10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，最终pH=7.5），将酵母菌和黑曲霉分别接种于PDA培养基进行摇菌培养，菌悬液用无菌生理盐水稀释为107cfu/mL。
(3)取1mL指示菌菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，涂布均匀晾干后放置牛津杯（内径6mm，高8mm），静置10分钟，滴加复合防腐剂和乳酸链球菌素标准品，37℃培养48小时后，用游标卡尺测量抑菌圈直径并计算效价。
结果显示复合防腐剂对以上受试菌株均具有较强的抑菌效果，抑菌谱明显拓宽。经计算复合防腐剂的效价为15000IU/mL。
5、复合防腐剂的稳定性检测
（1）将复合防腐剂调PH=5，115℃加热30分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（2）将复合防腐剂调PH=5，121℃加热20分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（3）将复合防腐剂调PH=7，115℃加热30分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（4）将复合防腐剂调PH=7，121℃加热20分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
结果显示，经加热复合防腐剂抑菌效果无变化，具有较强的稳定性。
实施例2
1、菌株发酵
将乳酸链球菌LY103以1%的接种量接种于液体发酵培养基，进行液体发酵。发酵培养基包括：以发酵培养基的总重量计，复合氮源（脱脂牛乳1%、酵母粉1%、大豆蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%）、复合碳源（葡萄糖0.5%、蔗糖1%、可溶性淀粉0.5%）、K2HPO4为1.0%，MgSO4·7H2O 0.01%、维生素C0.5%，余量为水，调pH6.5，罐压0.1MPa，30℃培养培养20h，停止发酵。
2、发酵液预处理。
（1）将发酵液用10mol/L的盐酸在搅拌状态下调PH=2.5，90℃加热30分钟，将乳酸链球菌素完全释放于发酵液中，经板框过滤去除培养基颗粒和菌体，收集滤液。
（2）滤液经孔径为15万的滤膜去除大分子蛋白和杂质。
3、发酵液复配
（1）将处理后的发酵液，以乳酸链球菌发酵液总重量计，添加1％六偏磷酸钠和3％麦芽糊精和壳聚糖3‰，调PH值为6.5，充分溶解后，10-25M帕高压均质15-30分钟。
（2）向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物１.5‰（产品名：竹叶抗氧化物；规格：8:1；购自润泽生物有限公司，竹叶抗氧化物已列入国标GB-2760，被***批准作为天然食品抗氧化剂使用）、纳他霉素0.5％、大蒜素1.5‰、抗坏血酸钠0.05％和NaCl0.8％充分混和均匀，得乳酸链球菌素复合生物防腐剂。
本实施例得到的一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂，包括乳酸链球菌发酵液，以及，按重量百分比计，占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖3‰，竹叶抗氧化物1.5‰，六偏磷酸钠1％、纳他霉素0.5％、大蒜素1‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.8％。
4、复配防腐剂的抑菌谱实验
（1）乳酸链球菌标准品用0.02mol/L的盐酸溶液配制成100 IU/mL的标准液，发酵液用无菌水稀释100倍备用。
（2）将金黄色葡糖球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、假单孢杆菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养基（配方是蛋白胨 10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，最终pH=7.5），将酵母菌和黑曲霉分别接种于PDA培养基进行摇菌培养，菌悬液用无菌生理盐水稀释为107cfu/mL。
(3)取1mL指示菌菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，涂布均匀晾干后放置牛津杯（内径6mm，高8mm），静置10分钟，滴加复合防腐剂和乳酸链球菌素标准品，37℃培养48小时后，用游标卡尺测量抑菌圈直径并计算效价。
结果显示复合防腐剂对以上受试菌株均具有较强的抑菌效果，抑菌谱明显拓宽。经计算复合防腐剂的效价为17000IU/mL。
5、复合防腐剂的稳定性检测
（1）将复合防腐剂调PH=5，115℃加热30分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（2）将复合防腐剂调PH=5，121℃加热20分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（3）将复合防腐剂调PH=7，115℃加热30分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
（4）将复合防腐剂调PH=7，121℃加热20分钟，用琼脂扩散法检测与未处理的复合防腐剂抑菌效果变化。
结果显示，经加热复合防腐剂抑菌效果无变化，具有较强的稳定性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂，其特征在于，包括乳酸链球菌发酵液，以及，按重量百分比计，占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2～3‰，竹叶抗氧化物1～1.5‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1～1.5‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.5～0.8％；
所述乳酸链球菌发酵液是由以下步骤制备的：（1）菌株发酵：将乳酸链球菌进行液体发酵，生产乳酸链球菌素；（2）发酵液预处理a.将发酵液用10mol/L的盐酸在搅拌状态下调pH=2-3，80-90℃加热30-60分钟，将乳酸链球菌素完全释放于发酵液中，经板框过滤去除培养基颗粒和菌体，收集滤液；b.滤液经孔径为15-30万的滤膜去除大分子蛋白和杂质。
2.根据权利要求1所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂，其特征在于，所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖2‰，竹叶抗氧化物1‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.5％。
3.根据权利要求1所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂，其特征在于，所述占乳酸链球菌发酵液重量的下列组分：
壳聚糖3‰，竹叶抗氧化物1.5‰，六偏磷酸钠１％、纳他霉素0.5％、大蒜素1.5‰、抗坏血酸钠0.05％、麦芽糊精3％和NaCl 0.8％。
4.权利要求1－3所述的乳酸链球菌素复合生物防腐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株发酵
将乳酸链球菌进行液体发酵，生产乳酸链球菌素；
（2）发酵液预处理
a.将发酵液用10mol/L的盐酸在搅拌状态下调pH=2-3，80-90℃加热30-60分钟，将乳酸链球菌素完全释放于发酵液中，经板框过滤去除培养基颗粒和菌体，收集滤液；
b.滤液经孔径为15-30万的滤膜去除大分子蛋白和杂质；
（3）发酵液复配
a.将处理后的发酵液添加六偏磷酸钠和麦芽糊精和壳聚糖，调pH值为6.5，充分溶解后，10-25MPa高压均质15-30分钟；
b.向均质后的发酵液加入竹叶抗氧化物、纳他霉素、大蒜素、抗坏血酸钠和NaCl充分混和均匀。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中发酵条件为：1%-3%接种量，发酵培养基以发酵培养基的总重量计，包括复合氮源2%-4%、复合碳源2-4%、K2HPO4为1.0-1.5%，MgSO4·7H2O 0.01-0.02%、维生素C0.5%，余量为水，调pH=6.2-7.0，罐压0.1MPa，30-35℃发酵培养13-20h，乳酸链球菌为对数生长期末期时停止发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复合氮源为：脱脂牛乳0.8-1%、酵母粉0.8-1%、大豆蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复合碳源为葡萄糖0.5%、蔗糖1%、可溶性淀粉0.5%。
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- 2013-08-06 CN CN201310337300.4A patent/CN103355730B/zh not_active Expired - Fee Related
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