CN103340839B - 蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,包含壳聚糖微球的制备,将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球以及胶囊制备几个步骤。本发明的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,通过壳聚糖载药微球的缓释效果,能够很好维持血药浓度水平,减少给药次数,降低毒副作用,且在肠道中溶解吸收,对胃无刺激,大大提高药物疗效等方面具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法。
背景技术
血栓病是严重危害人类健康的常见多发病,死亡率高,致残率高.当血栓发生后,最有效的治疗方法就是溶栓,近年来,以蚯蚓纤溶酶(earthwormfibrinolytic enzymes,EFEs)为主要活性成分的溶栓药在临床上发挥着重要作用,如百奥蚓激酶胶囊、普恩复胶囊等.EFEs是一组多组分的丝氨酸蛋白水解酶,其化学本质是蛋白质,不耐酸,多数组分不能耐受胃蛋白酶,目前EFEs剂型多为肠溶胶囊,虽能够有效避免胃液的破坏,但仍不能克服生物大分子药物生物利用度低的共有缺陷。
壳聚糖(chitosan,CS)是甲壳素脱乙酰基的产物,具有良好的生物降解性、生物相容性、生物黏附性和促进药物吸收的作用,可作为化学药物、多肽、蛋白质药物以及基因药物的载体,具有药物控释、组织靶向、提高药物稳定性等多方面优势,因而已成为近年来新型给药***研究的热点。以小分子药物为模型的壳聚糖载药微球报道较多,壳聚糖载蛋白类药物微球的研究多以胰岛素和牛血清白蛋白为模式药物。但对EFEs壳聚糖微球的研究国外文献中未见报道。
因此,开发出一种性能良好的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,将广泛造福于患者并具备良好的市场前景。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,通过壳聚糖载药微球的缓释效果,能够很好维持血药浓度水平,减少给药次数,降低毒副作用,且在肠道中溶解吸收,对胃无刺激,大大提高药物疗效等方面具有重要的作用。
本发明通过以下方案解决来解决上述技术问题:
一种蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备,包括如下步骤:
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成1%-3%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为1:10-1:15的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入1.5mL-3.0mL戊二醛溶液,继续搅拌20-45min。用1mol/L的NaOH溶液调节pH至8-10,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干。
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里10-15h小时,4-10℃下吸附药物,并不时搅动,按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.5%-0.8%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.1%-0.4%,于7℃-9℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥;
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.5-3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1400-1700U。
作为本发明的一个优选方案,本发明的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,具体包括如下步骤:
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成2%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为2:25的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入2mL戊二醛溶液,继续搅拌30min;用1mol/L的NaOH溶液调节pH至9,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干;
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里12个小时,8℃下吸附药物,并不时搅动按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.6%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计为0.2%,于8℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥。
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.5-3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1400-1700U。
其中,在壳聚糖微球的制备之前还需要对采用的医药级壳聚糖原料进行纯化,所述纯化步骤为:将壳聚糖产品溶于5%醋酸中,过滤除去不溶物,再用10%的NaOH溶液析出胶体物,过滤,洗涤至中性,干燥得浅黄色壳聚糖产品,脱乙酰度达90%以上。
优选地,蚯蚓纤溶修饰酶是通过蚯蚓纤维蛋白溶酶经蛋白修饰后获取,该修饰过程包括如下步骤:
PEG的活化:将三聚氰氯4.4g,无水碳酸钠8g,分子筛5A(5g)及PEG(4000)35g加入到400mL无水苯中,常温下搅拌15小时后,过滤,滤液再离心除去无水碳酸钠,分子筛5A悬浮物。液体用600mL的***沉淀,再用400mL的无水苯溶解沉淀,如此沉淀、溶解反复多次,去除没有反应的三聚氯氰,直至在258nm波长下检测无光吸收,真空干燥,得白色粉末,即为活化的PEG;
修饰过程:加入纯酶和活化的PEG到15mL,pH9.2,0.1mol/L的硼酸缓冲液中,纯酶与PEG的重量比是1:50,在30℃下,保温反应1小时,反应物对0.1mol/L,pH7.3的磷酸缓冲液透析过夜,透析液再以10000r/min,4℃离心l0min,取上清液过柱Sephadex G-75,收集活性成分,即为纯修饰酶。
其中,步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
优选地,步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
相比于现有技术,本发明实施例的技术方案至少具有如下有益效果:
本发明的技术方案中,壳聚糖载药微球有较好的缓释效果,能够很好维持血药浓度水平,减少给药次数,降低毒副作用,且在肠道中溶解吸收,对胃无刺激,大大提高药物疗效等方面具有重要的作用;并且,壳聚糖微球作为药品载体不具有任何副作用,且对人体有保健作用,也提高了修饰酶的稳定性。同时,蚯蚓纤维蛋白溶酶经过修饰,也能延长在体内半衰期,抗蛋白酶水解能力提高,免疫原性减小。另外,本发明的方案中通过在制备胶囊是加入营养成分丰富的银杏叶提取物,银杏叶子提取物主要含黄酮苷和银杏内酯两类活性成分,其标准是总黄酮含量>24%,银杏内酯含量>6%。黄酮可以改善血液循环,降低胆固醇,其中含有一种抗凝因子,能延长血液凝固的时间,这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率,也可改善心脑血管疾病的症状。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的原理,本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
实施例1
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成2%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为2:25的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入2mL戊二醛溶液,继续搅拌30min;用1mol/L的NaOH溶液调节pH至9,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干。
本实施例中,在制备壳聚糖微球前还需要对采用的医药级壳聚糖原料进行纯化,所述纯化步骤为:用50%NaOH,在300-500W的微波下提纯5min,并采用间歇式中间水洗、多次微波处理的方法来多次提纯,获取脱乙酰度90%以上的壳聚糖。在配制壳聚糖抗菌成膜喷剂之前需要对所采用的医药级壳聚糖原料进行质量控制,以保证成品符合国家药典的规定。当然也可以直接购买市售且符合标准的壳聚糖产品。在本实施例及下列的实施例中壳聚糖为济南海得贝海洋生物工程有限公司购得,其脱乙酰度90%,分子量51200,银杏叶提取物徐州恒凯银杏制品有限公司购得,批号N120918)。
需要说明的是,在蚯蚓纤溶修饰酶是通过蚯蚓纤维蛋白溶酶经蛋白修饰后获取,其中,蚯蚓纤维蛋白溶酶是由广州润虹医药科技有限公司提供,批号20121219。该修饰过程包括如下步骤:
PEG的活化:将三聚氰氯4.4g,无水碳酸钠8g,分子筛5A(5g)及PEG(4000)35g加入到400mL无水苯中,常温下搅拌15小时后,过滤,滤液再离心除去无水碳酸钠,分子筛5A悬浮物。液体用600mL的***沉淀,再用400mL的无水苯溶解沉淀,如此沉淀、溶解反复多次,去除没有反应的三聚氯氰,直至在258nm波长下检测无光吸收,真空干燥,得白色粉末,即为活化的PEG;
修饰过程:加入纯酶和活化的PEG到15mL,pH9.2,0.1mol/L的硼酸缓冲液中,纯酶与PEG的重量比是1:50,在30℃下,保温反应1小时,反应物对0.1mol/L,pH7.3的磷酸缓冲液透析过夜,透析液再以10000r/min,4℃离心10min,取上清液过柱Sephadex G-75,收集活性成分,即为纯修饰酶。
未经修饰的酶在体内易被其它蛋白水解,酶分子上的游离氨基会引起过敏反应,由于酶是生物大分子,也不易进入细胞,这样疗效不高,还会引起其他不适应反应。我们曾以PEG-4000修饰蚯蚓纤溶酶,EFE-PEG的酶学性质较原酶(EFE)有了部分改变,朝着有用方面转变(表1)。从表1中可见,EEF-PEG在体内半衰期提高了1.62倍,它对底物亲和力也提高了4.1倍。实验还证明,用EFF、EFE-PEG分别静注猪后,前者体温升高,不进食;后者生理、生活表现正常。
表1.EFE和EFE-PEG的部分性质比较
EFE | EFE-PEG | |
作用pH | pH5.0-10.0 | pH5.0-10.6 |
最适pH | pH7.8 | pH10.0 |
热稳性 | 20-55℃ | 20-60℃ |
最适温度 | 55℃ | 55℃ |
半衰期 | 4℃和常温下240d | 4℃和常温下280d |
体内分布相半衰期 | 0.60h | 0.97h |
Km/Kmapp(BAEE) | 1.24×10-3mol/L | 0.3×10-3mol/L |
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:
蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里12个小时,8℃下吸附药物,并不时搅动按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.6%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计为0.2%,于8℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥。
步骤三、胶囊的制备:
把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1700U。
步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
实施例2
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成1%-3%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为1:10的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入1.5mL戊二醛溶液,继续搅拌45min,用1mol/L的NaOH溶液调节pH至8,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干。
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里11h小时,5℃下吸附药物,并不时搅动,按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.5%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.2%,于7℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥;
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.6mg银杏总黄酮量,酶活力为1500U。
本实施例中,所用的主要原料壳聚糖、银杏叶提取物及蚯蚓纤溶修饰酶采用与上述实施例相同的方式获取或者通过直接购买而得到。
步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
实施例3
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成1%-3%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为1:15的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入3.0mL戊二醛溶液,继续搅拌20-45min。用1mol/L的NaOH溶液调节pH至10,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干。
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里15h小时,10℃下吸附药物,并不时搅动,按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.8%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.4%,于9℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥;
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1600U。
本实施例中,所用的主要原料壳聚糖、银杏叶提取物及蚯蚓纤溶修饰酶采用与上述实施例相同的方式获取或者通过直接购买而得到。
蚯蚓纤溶修饰酶的溶出率实验:
通过测量实施1-3中所制备的壳聚糖微球胶囊,分别置于人工肠液和人工胃液的模拟环境中,振摇(12r/min)间隔相应时间后离心分离,测定蚯蚓纤溶修饰酶的溶出率,其结果如下表2所示:
表2、蚯蚓纤溶修饰酶的溶出率
由表一的实验结果看出,通过本发明实施例中方案制备而成的蚯蚓纤溶修饰酶微球胶囊具有良好的缓释效果,能够很好维持血药浓度水平,减少给药次数,降低毒副作用,且在肠道中溶解吸收,对胃无刺激,大大提高药物疗效等方面具有重要的作用。
以上是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成1%-3%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为1:10-1:15的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入1.5mL-3.0mL戊二醛溶液,继续搅拌20-45min;用1mol/L的NaOH溶液调节pH至8-10,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干;
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里10-15h小时,4-10℃下吸附药物,并不时搅动,按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.5%-0.8%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.1%-0.4%,于7℃-9℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥;
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.5-3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1400-1700U。
2.根据权利要求1所述的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、壳聚糖微球的制备:
称取一定量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,配制成2%的壳聚糖醋酸溶液;
将体积比为2:25的span80和液体石蜡装入容器中,搅拌20min,使均匀分散;
将壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到油相混合溶液中,800r/min搅拌,乳化均匀,再超声波处理5min,加入2mL戊二醛溶液,继续搅拌30min;用1mol/L的NaOH溶液调节pH至9,60℃水浴保温4小时,静置冷却,弃去上层油相,依次用石油醚、异丙醇抽洗干净,最后再用蒸馏水抽洗,真空干燥,过80目筛,把干燥的壳聚糖微球放在0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液浸泡24小时,抽干;
步骤二、将蚯蚓纤溶修饰酶固定于壳聚糖微球:蚯蚓纤溶修饰酶先在5倍体积的0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液里溶解,再把平衡后的壳聚糖微球放进溶液里12个小时,8℃下吸附药物,并不时搅动按给酶量为2.126mg/g壳聚糖微球载体混合;然后滴入体积分数为0.6%戊二醛溶液,使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.2%,于8℃交联2h后,用0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液,吸干水分干燥;
步骤三、胶囊的制备:把制好的固定有蚯蚓纤溶修饰酶的壳聚糖微球和银杏提取物粉末混匀装进明胶胶囊壳里,要求按照每粒胶囊所包含的壳聚糖微球和银杏提取物质量分别为500mg和15mg混匀;再用肠溶性胶液封口;其中,每粒胶囊含有3.5-3.8mg银杏总黄酮量,酶活力为1400-1700U。
3.根据权利要求1所述的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于:在壳聚糖微球的制备之前还需要对采用的医药级壳聚糖原料进行纯化,所述纯化步骤为:将壳聚糖产品溶于5%醋酸中,过滤除去不溶物,再用10%的NaOH溶液析出胶体物,过滤,洗涤至中性,干燥得浅黄色壳聚糖产品,脱乙酰度达90%以上。
4.根据权利要求1或2所述的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于,蚯蚓纤溶修饰酶是通过蚯蚓纤维蛋白溶酶经蛋白修饰后获取,该修饰过程包括如下步骤:
PEG的活化:将三聚氰氯4.4g,无水碳酸钠8g,分子筛5A及平均分子量4000的PEG35g加入到400mL无水苯中,常温下搅拌15小时后,过滤,滤液再离心除去无水碳酸钠,分子筛5A悬浮物;液体用600mL的***沉淀,再用400mL的无水苯溶解沉淀,如此沉淀、溶解反复多次,去除没有反应的三聚氯氰,直至在258nm波长下检测无光吸收,真空干燥,得白色粉末,即为活化的PEG;
修饰过程:加入纯酶和活化的PEG到15mL,pH 9.2,0.1mol/L的硼酸缓冲液中,纯酶与PEG的重量比是1:50,在30℃下,保温反应1小时,反应物对0.1mol/L,pH7.3的磷酸缓冲液透析过夜,透析液再以10000r/min,4℃离心l0min,取上清液过柱Sephadex G-75,收集活性成分,即为纯修饰酶。
5.根据权利要求1或2所述的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于,步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
6.根据权利要求5所述的蚯蚓纤溶修饰酶壳聚糖肠溶微球胶囊的制备方法,其特征在于,步骤三中肠溶性胶液的配方比例为:
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