CN103338855B

CN103338855B - 用于生成分子微阵列的装置和方法

Info

Publication number: CN103338855B
Application number: CN201280007767.6A
Authority: CN
Inventors: 金特·罗特; 尤根·布格尔
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Bio Replication Ltd
Priority date: 2011-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-02-03
Also published as: ES2897738T3; US9623394B2; WO2012104399A2; CA2824221A1; EP2670525A2; CN103338855A; JP2014505883A; CA2824221C; WO2012104399A3; DE102011010307A1; EP2670525B1; DK2670525T3; US20140038854A1; JP5977259B2

Abstract

本发明涉及用于生成分子微阵列的装置和方法。本发明因此涉及通过经由酶促和化学处理来从模板分子微阵列生产输出分子且将输出分子转移到期望的分子微阵列上的用于生成蛋白质微阵列、DNA微阵列和RNA微阵列（通常核酸微阵列）的普遍的方法。

Description

用于生成分子微阵列的装置和方法

技术领域

本发明涉及用于生成分子微阵列的装置和方法。因此，本发明涉及用于生成蛋白质微阵列、DNA微阵列和RNA微阵列（通常是核酸微阵列）的普遍的方法，通过经由酶促和化学处理来从模板分子微阵列生产输出分子且将输出分子转移到期望的分子微阵列上。

背景技术

DNA到蛋白质阵列复制的研究现状

在“传统的设置”中的蛋白质微阵列的生产是在细胞中合成蛋白质，随后纯化来自溶解细胞的蛋白质且将蛋白液转移到微阵列上。这通常针对每个蛋白质单独进行。如果所有的蛋白液是纯化的，则分配***被用于生成蛋白质微阵列。尽管该技术已经被使用超过十年，但是它仍是难以处理的且在时间和金钱方面需要很大的努力，尤其维持细胞培养和细胞中的蛋白质表达。这通常导致针对每个蛋白质微阵列的超过1000欧元的成本。

芯片上蛋白的化学原位合成由于与天然的细胞生成的蛋白质相比与产品的不足的纯度结合的贫乏的合成产量而尚未成功。仅短的蛋白质片段（所谓的肽）可适用于原位合成。但是为了信息值和显著性，需要使用优选地天然表达的全长蛋白质来实施最好的生化试验。

已经开发了针对基于微阵列的全长蛋白质的合成方法来直接地从DNA生产蛋白质。2010年2月发表的综述[2]示出了不同的方法和变型。它强调这些方法中的哪个已经被实现，以便于从作为模板源的DNA阵列生成蛋白质阵列。一个基本的信息是只有当DNA已经编码几个功能的“信息”单元（像核糖体、结合位点、启动子等）时可以合成蛋白质。可以这样说DNA必须“准备好表达”以被无细胞表达混合物识别且处理，其然后转录DNA且将mRNA翻译为相应的蛋白质。

在2001年，He和Taussig公开了PISA***[3]（WO02/14860）。这里在分配之前将DNA和无细胞表达混合物混合。随后小的液滴被转移到表面上。液滴中的每个根据所加入的DNA来生成蛋白质。在蛋白质序列内编码组氨酸标签。该组氨酸标签与所谓的镍NTA表面特异性结合。在生成足够的蛋白质之后使用液体冲洗且因此清洗整个表面。这移除所有的DNA和所有的蛋白质，其不包括组氨酸标签。仅包括组氨酸标签的蛋白质将粘着该表面且因此被“纯化”且与所有其它蛋白质分离。该微阵列可以直接地用于蛋白质-蛋白质相互作用结合测量。在2006年，经由该方法制成的包括13000个不同的蛋白质或蛋白质片段的蛋白质微阵列[4]被公开。

PISA***避免了繁重的、单个蛋白质纯化的努力（与重组蛋白质合成的传统方法相比），但是在转移到微阵列表面之前将每个模板DNA序列和无细胞表达***直接混合的努力仍然是极大的。并且其应当在精确地相同的条件下，尤其是浓度和时间参数方面，对微阵列上的每个点进行。这仅可以在某些情况下，在某下实例中具有极大的困难地，使用移液机器人来实现。

在2004年，LaBear公开了用于从DNA阵列制造蛋白质阵列的NAPPA***（核酸可编程的蛋白质阵列）（US6800453B2）[5]。这里需要负载两个粘合剂分子的表面。使用链酶亲和素和针对组氨酸标签的抗体。在该双粘合剂表面上用含有与所述表面结合的标签的DNA打印DNA微阵列。生物素化的DNA用于概念验证。这些DNA微阵列可以被存储多达2年。全部的NAPPA微阵列的保存期受限于抗体和DNA的保存期。就在使用之前，用无细胞表达***覆盖整个微阵列。在由点的DNA本身限定的每个点上，合成不同的蛋白质，其自由地扩散。但是每个蛋白质包括与抗体结合的特定序列。因此，抗体以纯统计可能性结合到表面。由于在DNA点上直接地生成蛋白质，大部分的蛋白质将结合在点上或者在其邻近。在清洗步骤之后，仅DNA和期望的蛋白质保留在表面上且具有新近合成的蛋白质的微阵列可以用于实验。在2008年，公布了具有大约1000个蛋白质的蛋白质微阵列[6]。

与PISA相比的NAPPA的优点是将DNA微阵列制备与蛋白质合成分离。在制造微阵列期间或之后，在PISA中直接地且固有地合成蛋白质的同时，NAPPA***能够制作大量的DNA微阵列且存储它们很长时间。蛋白质是新鲜合成的在实验性用途中是重要的。因此NAPPA***可以描述为“按需”蛋白质微阵列。缺点是表面上的双粘合剂***（其导致了增加的成本），像链酶亲和素和抗体，而且它们与DNA一起保留在表面（较高机会是非特异性结合）上。

在2008年，He等（来自MichaelTaussig集团）公开了DAPA***[1]（WO2006/131687），该方法允许采用DNA微阵列原本且生成几个蛋白质微阵列拷贝。在该***中，蛋白质编码DNA作为DNA微阵列被分配到商业的可获得的环氧功能化表面上。其如传统的DNA微阵列生成来进行。

对于DAPA***，经由放置在其间的膜使得DNA阵列与第二表面接触。该膜已经预先使用无细胞表达***浸润，其立即开始与DNA模板接触以基于来自微阵列的每个点的DNA来生产蛋白质（像PISA设置）。蛋白质扩散通过该膜且结合至第二表面。用这种方法生成蛋白质微阵列。使用镍NTA表面作为捕获器表面且在DNA内编码作为针对该捕获器表面的特异性结合序列的相应的His标签。在大约3小时之后，打开夹层且清洗DNA微阵列以及蛋白质微阵列。然后可以将蛋白质微阵列用于实验且DNA微阵列可以被存储直到制作下一个蛋白质拷贝或者可以立即再次再使用以制作下一个蛋白质微阵列。

扩散将使蛋白质点大于NDA点，且还导致模糊不清的边界，其正是在处理过程中固有的扩散的表征。边界的扩散模糊与膜的薄度和所得到的从DNA阵列到蛋白质捕获表面的扩散距离关联较少。

与PISA和NAPPA相比，DAPA***的最明显的优点是几个蛋白质微阵列拷贝可以仅从一个单一的DNA微阵列原本生成。额外的优点是在蛋白质微阵列上不存在干扰DNA（像在NAPPA***中一样），且在蛋白质微阵列表面上总共仅需要一个捕获。但是该***首先允许从一个DNA微阵列制作几个蛋白质微阵列复制。相对于所有其它***这是完全新的。

然而，所描述的DAPA生成蛋白质微阵列的工作流持有几个不利的特性，其主要是固有的或与膜自身有关的。

第一，膜和两个阵列表面之间存在真实的物理“硬性”接触，其随着时间和使用导致划痕和/或物理磨损。这将损害蛋白质阵列表面且限制其之后的使用。此外还损害DNA阵列，就在复制过程变性或脱落DNA之前制作的蛋白质阵列的总数来说，其限制它们的寿命。

第二，膜通常是非均质的材料，其将不可预料地将蛋白质传送到蛋白质阵列拷贝上。该膜自身未限定，因为其是非编织的且因此是随机的材料。在该材料内，生成的分子的扩散不是全方向的，也被描述为各向异性的，其意味着存在优选的或不那么优选的方向。由于在该材料内使用的纤维，沿着纤维或在由纤维随机或半随机的队列支持的特定的方向的扩散可以发生。这导致生成的蛋白质模式的非均质，其是原始DNA图像和膜非均质的数学上的卷积。由于每个拷贝过程需要新的膜时，每个拷贝由于膜精细的结构中的差异而固有地不同于下一个。越小的DNA阵列的结构尺寸，该影响变得更强。因为这种经由膜的不可预测的且不可再生的转移的因素限制了该复制过程的最小的分辨率和该方法的再现性。

第三，在将膜与DNA接触之后，立即开始蛋白质生产的生化反应。因此，堆DNA阵列、膜和第二表面的组装与反应的开始自动地偶联。这避免几个反应器的组装和微阵列生产的同时启动。不存在被限定的反应起点，尤其当同时实施多个组装件时。这也减少了再现性。

第四，膜的安装由于其薄度是有挑战的且因此很难处理。这被该膜越薄蛋白质阵列的质量变得越来越好如下的事实所强调，但是越薄，湿的膜变得更易碎的且该膜的处理变得更困难，可能在其自身重量下破碎、下垂或者捕获气泡。这也减少了再现性。

在组装DNA阵列、膜和第二表面期间，没有气泡应该被膜捕获。这只能被熟练的且有经验的人员避免。

此外，根据最近的出版物，DAPA装置是复杂的且因此与较不复杂的安装相比容易出错。

另外的缺点是生成一个蛋白质微阵列需要超过3个小时，主要由于受限的反应效率，其归因于活性组分（无细胞的酶混合物）主要结合在膜中或与膜相互作用，因此在某种程度上使得模板DNA与转录和翻译酶分离。此外，蛋白质产物扩散通过膜需要额外的时间。这导致蛋白质拷贝的生成的延长的表达时间。

所有的这些缺点导致DAPA***固有的不良再现性，大体上归因于处理依赖于膜介导的反应***和输出分子转移。通过组装将获得膜的接触以及由此无细胞的表达***以及立即生产的蛋白质。在所描述的DAPA设置中不可能分离组装和反应起点。这特别的缺点使得整个***无法具有再现性。

考虑到这些缺点，存在一些使用无细胞表达从DNA合成蛋白质的微流体方法。然而，微流体领域的这些出版物[7-10]仅专注于用较少的无细胞表达混合物的获取更多蛋白质而不是制造蛋白质微阵列。

DNA到DNA/RNA阵列复制的研究现状

由于DNA微阵列的广泛的商业可获得性，非常少的研究小组的目的是采取DNA微阵列并且制作关于DNA微阵列或RNA微阵列的拷贝。然而，在微阵列的DNA到DNA拷贝上已经取得一些进步。

在2001年，Kumar等[11,12]使用接触印刷技术来生成“系列稀释的微阵列”。因此DNA微阵列被印刷在具有可逆化学键的表面上。该DNA微阵列以紧密共形引入以与丙烯酰胺表面接触。该丙烯酰胺表面的化学特性可逆地从主微阵列打开了DNA化学键且将模板（主）的一些DNA解体到新的阵列上。之后DNA共价结合到丙烯酰胺上。该步骤可以被重复几次且用尽主阵列直到所有的DNA被移除。可以两种模式制得所生成的DNA微阵列拷贝。

如果总是应用相同的分解时间，则生成系列稀释的DNA，产生每个随后的拷贝包括较少DNA的DNA微阵列。如果施加到实验确定的逐渐增加的分解时间，则所有拷贝包含大约相同数量的DNA。同样地使用该技术，可能生成DNA主微阵列的拷贝，但是DNA主微阵列随时间被用尽。初始的DNA数量仅分布在所有制作的拷贝上。所以它是复制，而不是扩增。

Yu等在2005年提出DNA微阵列的类同拷贝[13]。这里印刷了初级DNA微阵列。将所述初级DNA微阵列与DNA的混合物一起孵育，其包括与初级微阵列上相应的DNA结合的硫醇修饰的cDNA。同样地，cDNA精确地杂交在初级的微阵列的不同点上。然后金涂层以紧密共形被引入与初级微阵列接触。由于该紧密共形，硫醇基团与金表面相互作用且共价结合。通过加热且裂开两个表面，制造初始DNA微阵列的反相拷贝。

这仅能够创建反相拷贝。由于使用硫醇-金-结合***，不可能制作反相的反相，且这将加工限制为仅制作反相。此外，两个硬性表面之间的紧密共形的接触是不利的，因为导致非常强的机械应力以及由此的划痕和机械磨损，尤其涂有薄金的表面。再者DNA不直接地在微阵列上扩增；它被预先合成且然后应用于杂交。

在2006年，S.Kim等[14]通过使用垫片以“孔掩模”的形式回避不同表面之间的共形接触。它们印刷微阵列且在微阵列的不同点上杂交cDNA。然后在精确地点位置上的具有孔的掩模被放置在其上且充满液体。尼龙膜施加在该夹层上。通过施加热处理和吸引电场，cDNA从初级表面释放且转移到尼龙膜。生成反相DNA微阵列拷贝。在封闭之后，该表面可以用于实验。

该设置使反相微阵列拷贝再次成为可能，但是正确的封闭该反相拷贝的表满将允许重复来自该反相拷贝的这一过程，使得反相的反相拷贝和同样地正相拷贝将是可能的。再次cDNA不在阵列上原位合成；其作为准备好的混合物在初级表面上孵育。附加的缺点是孔掩模。其格式上必须是精确的且尤其是在初级DNA微阵列的点的网格中并且其必须被精确地定位。给定的显微镜载玻片的长度是75mm且点尺寸是100um，该掩模必须以小于0.08°的偏向放置且针对新格式的微阵列，必须制作新的孔掩模。

在同一年（2006）,Y.Kim等[15]提出用于微阵列的DNA到DNA拷贝的高级的复制技术。首先初级DNA微阵列被印刷在基板上。然后DNA聚合酶直接地被用在该表面上以生成cDNA。聚合酶的引物已经包含生物素修饰。在由聚合酶扩增之后，每个点包括生物素标记的其相应的cDNA。然后涂有链酶亲和素的第二表面被引入与初级表面强烈接触。由于邻近，生物素与链酶亲和素结合。通过热处理，DNA和cDNA之间的结合强度被降低且两个表面被彼此分离开。这导致反相拷贝保留在第二表面上。

该设置的优点是DNA在微阵列上直接被原位扩增，所以不需要预先合成。由于生物素和链酶亲和素之间的特异性结合，该转移也是高度特异的。缺点是表面之间的紧密共形接触导致阵列的机械损伤以及可以仅获取反相拷贝。使用链酶亲和素-生物素***可以不重复该处理，所以如果应保留正相拷贝则其它的结合对需要被评估。

关于阵列复制的现有技术的总结

仅针对DNA到DNA拷贝，Y.Kim等[15]推断使用酶促DNA扩增***作为有利的复制过程。这将固有地传送“DNA油墨”来制作拷贝，而与DNA序列无关，同时S.Kim等[14]意识到避免表面之间的紧密共形接触，以避免机械磨损以及转移液体内的DNA。他们都没有实现初始DNA的正相拷贝。

针对DNA到蛋白质拷贝，存在两个关键的生成***（PISA和NAPPA），其允许将DNA微阵列转变为蛋白质微阵列。然而，两个***使用且消耗DNA微阵列。Taussig等[1]改善其自己的PISA***到DAPA布局，其允许在不用尽原始模板DNA微阵列的情况下制作几个蛋白质微阵列副本。但是该***由于组装和反应开始是偶联的这一事实从而固有地未明确其开始的条件。这限制了再现性且由于不同的表面之间的硬性接触，该阵列因机械磨损在质量和再现性上再度受损。

发明内容

本发明的目的是提供用于生成分子微阵列的装置和方法，其克服了现有技术中已知的问题。本发明的又一个目标是提供统一方法以能够在相同的设置（装置、方法和***）中经由同一工作流程来生产DNA、RNA和蛋白质微阵列。根据现有技术，本发明潜在的技术问题可以看作为提供用于使得分子（例如，蛋白质、DNA或RNA）的从模板到捕获表面能够快速、可控制且可再现的传输的改进的或选择性的装置和方法。进一步的技术问题是提供模板和捕获阵列表面的组装与导致生产输出分子和所述输出分子的转移的反应的起始彻底去偶联，优选地在明确的条件下并且具有对原始模板阵列的最小的机械应力。

该问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选的实施方案由从属权利要求提供。

本发明的各个方面（例如，本文所描述的方法、阵列、装置和***）代表统一的发明，因为全部由新颖且发明性的特征根据所引用的现有技术来定义。在提交日未知的情况下，可以经由输出分子（例如，蛋白质、DNA或RNA）的生产和从模板表面到捕获微阵列表面的转移来生产分子微阵列而无需位于所述两个表面之间的膜层的协助。不存在这种膜层使得能够从将反应起始与装置的组装去偶联从而提供各种优点，如本文所描述的。在模板和捕获表面之间使用微流体缺口和孵育室以前被认为不合适于本文所描述的精确的分子转移。因此在不需要膜支持的情况下输出分子的转移可以小的流体体积可靠地发生是令人惊讶的。本发明的所有方面基于且利用这最新地发现的原理，因此向本发明的各个方面提供统一的概念，例如方法、装置、阵列和***。

因此，本发明的目标是提供用于产生分子微阵列的方法，包括：

a)提供第一支撑表面（模板表面），其展示固定在其表面上的一个或多个模板分子，和相对的第二支撑表面（捕获或微阵列表面），

b)经由无细胞酶促和/或化学反应***从所述的模板分子生产输出分子，

c)经由第一和第二支撑表面之间的流体将所述输出分子转移到第二支撑表面，第一支撑表面上的模板分子位置和第二支撑表面上的相应输出分子的沉积之间具有相关性，

其特征在于，

d)组装的支撑表面与步骤b）的起始去偶联，由此步骤b)的起始由可移除的限制性装置阻止。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，所述可移除的限制性装置是

-第一支撑表面和第二支撑表面之间的空间分离，避免两个表面的直接物理接触，

-阻碍无细胞酶促和/或化学反应***的化学的或含能的环境，例如限制或阻碍所述***的活动的pH值和/或温度，和/或

-内力场或外力场，借助于电场或磁场和/或电势，其阻碍无细胞酶促反应***。

至今用于生产微阵列的类似的***和方法还受限于模板表面和捕获表面之间的膜层。令人惊讶的是在不需要诱导/起始无细胞酶促和/或化学反应***的情况下可以完成模板层和捕获层的组装。将可移除的限制装置添加到如上所述的方法允许组装在没有损害微阵列生产的组件或即时起始的风险的情况下可靠地发生，其例如在销售包括已经安装的模板和捕获表面的制作好的套件或装置是重要的缺点。这种具有已安装的模板和捕获表面的制作好的套件或装置还是本发明的主题。

在优选实施方案中，本发明的方法的特征在于，支撑表面之间的空间分离是在相对的分离的第一和第二支撑表面之间形成的微流体孵育室（微流体缺口）。

在优选实施方案中，本发明的方法的特征在于，微流体孵育室不包括位于第一和第二支撑表面之间的膜。

在提交日未知的情况下，可以经由输出分子（例如，蛋白质、DNA或RNA）的生产和从模板表面到捕获微阵列表面的转移来生产分子微阵列而无需位于所述两个表面之间的膜层的协助。在模板和捕获表面之间使用微流体缺口和孵育室以前被认为不合适于本文所描述的精确的分子转移。因此，在不需要膜支持的情况下输出分子的转移可以小的流体体积可靠地发生是令人惊讶的。

术语微流体指的是以小量纲（例如，亚毫米级别、小至几纳米、或数百纳米、或几个微米或数百微米）分布的流体。所获得的液体体积是非常小的，通常以微升、纳升、皮升或毫微微升计，且允许在生产分子阵列的过程中酶促试剂非常节省的使用。

在优选实施方案中，本发明的方法的特征在于，通过将无细胞酶促和/或化学反应***引入到微流体孵育室而发生的限制性装置的移除，由此引起所述输出分子的生产且使得能够将所述输出分子转移到所述第二支撑表面。

在优选实施方案中，本发明的方法的特征在于，在根据权利要求1的步骤b)经由无细胞酶促和/或化学反应***起始所述输出分子的生产之前，第一支撑表面和第二支撑表面彼此相对保持在固定位置，优选地经由机械张力或弹簧***。

先前的实施方案澄清了本发明和现有方法（例如，DAPA）之间的本质差别，现有方法中，在没有方法起始的情况下，支撑表面的定位是不可能的。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，可以多次使用单个第一支撑表面来重复本方法，以生产多个微阵列。

移除膜特征并用微流体***替换已经使得单个模板表面，优选地具有点样在其表面上的DNA文库，可多次使用用于生产分子阵列。尽管这看起来是较小的改进，但避免了必须再生作为模板的DNA阵列节约了大量的花费和精力，尤其是就需要处理具有数百或数千阵列的蛋白质-蛋白质结合阵列或其他分子相互作用研究的大规模项目。本方法因此能够极大的节约花费且为高通量方法提供较大的再现性。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，可移除的限制性装置包括存在于第一和/或第二支撑表面上的化学封闭剂（其阻碍无细胞酶促和/或化学反应***和/或阻碍输出分子与第二支撑表面的结合，其可以如所需的被修饰和/或移除以起始本方法）或耗尽或限制用于无细胞酶促反应***的基本的化合物。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促和/或化学反应***的阻碍涉及使用与反应组分的必需的OH基团连接的光可裂解的化学取代基，借此采用光照处理释放反应组分并使得反应可以开始，或将必需的反应组分结合和/或捕获到第一或第二表面，例如ATP，必需的盐或辅酶例如维生素或金属离子，使得反应起始仅在填充或外部脉冲时发生。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，可移除的限制性装置涉及分子从活动状态到非活动状态或从非活动状态到活动状态的分子开关，通过-pH改变，包括pH敏感分子中的功能性改变，例如，通过对涂有二氧化钛的表面的光照处理导致生成H+离子和随后的pH改变，

-静态的和/或动态的电场和/或磁场的改变，包括带电的、电介质或磁性分子或表面性质的改变，

-温度的改变，导致分子结构或动力学的改变，例如降低的温度导致DNA或RNA聚合酶失活，由此一旦加温，反应起始发生，

-照明，通过光诱反应（例如使用与必需的反应组分连接的光可裂解的化学取代基，借此采用光照处理释放反应组分并使得反应可以开始）和/或笼锁组分的释放（例如，光诱导的笼锁的生物素或其它分子的释放）诱导封闭的、感光的或笼锁的分子的改变，

-或其组合。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，模板分子是核酸或核酸样的分子，例如，DNA、RNA、基因组DNA、克隆的DNA片段、质粒DNA、cDNA或cDNA文库、PCR产物、合成的DNA或DNA寡核苷酸、mRNA或合成的RNA。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促反应***是

-DNA聚合酶或DNA扩增酶或酶***，

-RNA聚合酶或RNA扩增酶或酶***，

-逆转录酶或RNA到DNA转录酶或酶***，

-蛋白质合成***或无细胞表达混合物，例如将DNA转录为RNA和将RNA翻译为蛋白质所需的酶混合物，例如选自原核或真核的***，例如大肠杆菌、细菌来源、兔网织红细胞、昆虫来源、人类或小麦胚芽的无细胞溶解物。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促反应***是DNA聚合酶，输出分子是DNA且DNA微阵列生成在第二支撑表面上。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促反应***是RNA聚合酶，输出分子是RNA且RNA微阵列生成在第二支撑表面上。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促反应***是逆转录酶，输出分子是DNA且DNA微阵列生成在第二支撑表面上。

在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于，无细胞酶促反应***是蛋白质合成***或无细胞表达混合物，例如将DNA转录为RNA和将RNA翻译为蛋白质所需的酶混合物，输出分子是蛋白质且蛋白质微阵列生成在第二支撑表面上。

本发明还涉及由本文所描述的方法生产的分子阵列。

本发明还涉及用于生产分子微阵列，优选地用于实施根据前述权利要求中的任一项的方法实现所述方法的装置，包括：

a）第一支撑表面（模板表面），其展示固定在其表面上的一个或多个模板分子，

b）第二支撑表面（捕获或微阵列表面），其与所述第一支撑表面组装，

c）由此微流体孵育室（微流体缺口）在用于无细胞酶促和/或化学反应***的物理地分离且相对的第一和第二支撑表面之间形成，由此将支撑表面的组装与无细胞酶促和/或化学反应***的起始去偶联，

d）进入孵育室的流体入口和/或出口，

e）用于将两个相对的支撑表面保持在固定位置的装置，以及

f）用于将孵育室维持为两个相对的支撑表面之间的空间的装置。

本发明的装置展示上述方法的所有那些发明特征，其提供超越现有技术的新颖且发明性的发展。该装置允许经由在模板和捕获表面之间形成的微流体室将无细胞酶促和/或化学反应***的组装和起始去偶联。这些表面保持物理分离，使得在用反应组分充满时能够起始该方法。在现有技术中，考虑到微流体未被认为适于为输出分子转移提供足够的分辨率，构建这种装置是令人惊讶的发展。令人惊讶的是例如来自DNA模板的蛋白质生产导致与使用膜的DAPA***相比可比的，如果未改进，使用本发明装置的转移。本文公开的装置还导致用于转移的时间显著减少，具有可比的，如果未改进，蛋白质的精确度和分辨率和微流体室中的转移。

在优选实施方案中，本发明的装置的特征在于，微流体孵育室不包括位于第一和第二支撑表面之间的膜。

在一个优选实施方案中，本发明的装置的特征在于，用于将孵育室维持为两个相对的支撑表面之间的空间的装置是第一和第二支撑表面之间的垫片。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，用于将孵育室维持为两个相对的支撑表面之间的空间的装置是一个或多个三维结构（3D）流通池，优选为合成聚合物的，例如薄膜聚合物材料或聚二甲硅氧烷（PDMS）。术语合成聚合物指的是任何合成聚合物或可以应用或适于构建流通池的其它材料。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，流体入口和/或出口适合于无细胞酶促和/或化学反应***以被泵入或吸入和/或泵出或吸出孵育室。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，模板分子是选自核酸或核酸样的分子的任意分子，例如DNA、RNA、基因组DNA、克隆的DNA片段、质粒DNA、cDNA或cDNA文库、PCR产物、合成的DNA或DNA寡核苷酸、mRNA或合成的RNA。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，支撑表面之间的空间分离的高度小于100微米，优选小于80微米，例如65微米，优选小于60微米，或更优选小于40微米，例如20微米或更小。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，所述第一和第二支撑表面是玻璃、塑料、尼龙或其它类型的天然或合成聚合物或膜，例如聚二甲硅氧烷（PDMS）。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，第一和/或第二支撑表面是适用于显微镜使用的标准玻璃片，例如大小为76×26×1mm³。作为本领域技术人员的公知常识，这些尺寸的小偏差也落入本发明的范围。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，装置在长度上具有手持型的尺寸，优选60-140mm、80-120mm或更优选为105mm，以及宽度上优选30-90mm、40-80mm或更优选60mm。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，用于将两个相对的支撑表面保持在固定的位置的装置包括安装支架（支撑器），位于上部、下部或侧面的支架，与两个支撑表面相关定位。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，支撑表面或者安装支架（支撑器）通过机械张力、磁力、弹簧***被固定就位，引导表面的轨道由此将两个支撑表面保持在固定的位置。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，所述第二个支撑表面预先涂有配置为将输出分子与所述表面共价或非共价连接的固定剂。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，固定剂是蛋白质固定剂例如抗体，被配置为与所表达的蛋白质，多组氨酸序列例如六聚组氨酸，共价或非共价连接，由此所述蛋白质固定剂是螯合剂例如镍NTA、肽、结构域或蛋白质，由此所述蛋白质固定剂是对所述标签和/或生物素结合分子特异性的抗体，例如抗生物素蛋白。

在一个实施方案中，本发明的装置的特征在于，第一支撑表面是：

-核酸或核酸样的分子的微阵列，

-展示核酸的序列芯片，

-表面上的空间限定的核酸分布，

-微珠阵列或结构表面上空间限定的核酸分布，

-含有核酸的液体或固体材料的空间限定的分布。

本发明此外还涉及用于生产分子微阵列的***，包括

b）第二支撑表面（捕获或微阵列表面），其与所述第一支撑表面组装，由此微流体孵育室（微流体缺口）在物理分离且相对的第一（模板）和第二（捕获或微阵列）支撑表面之间形成，

c）进入孵育室的流体入口和/或出口，

d）用于将两个相对的支撑表面保持在固定的位置的装置，以及

e）用于将孵育室维持为两个相对的支撑表面之间的空间的装置，

由此

f）微阵列通过在将无细胞酶促和/或化学反应***引入到微流体孵育室之后从模板分子生产输出分子并将所述输出分子转移到所述第二支撑表面的表面来形成，由此引起所述输出分子的生成和向所述第二支撑表面的转移。

本发明的详细说明

本文所述的装置和方法除去了本领域现有状态的几个缺点且能够优选地用于制造DNA、RNA和蛋白质阵列。

本发明代表对于从DNA微阵列原本生成蛋白质阵列拷贝的“DAPA***”（DNA阵列到蛋白阵列***）的改进[1]。本发明允许以相同的方式将原本DNA阵列复制到复制的DNA阵列（通过使用DNA聚合酶或任何其它DNA复制或扩增酶），到RNA阵列（通过使用RNA聚合酶）或到蛋白质阵列（通过使用与DAPA***相似的酶促***）。本发明使得能够将原本RNA阵列复制到DNA阵列（通过使用逆转录酶）或者到蛋白质阵列（通过使用与DAPA***相似的酶促***）。

本发明特别涉及提供装置的独特的结构和布局以及新的工艺。第一，第一支撑表面（包括原本微阵列）和第二支撑表面（其随后“捕获”拷贝）被薄的所谓微流体缺口所分离。在起始该方法之前该微流体缺口优选地含有空气，其避免反应开始，并且当用扩增混合物充满时所述方法起始。同样地该布局具有超过现有领域状态的两个优势。第一，不存在两个表面之间的物理接触，这避免机械应力或磨损。第二，它允许在不开始反应的情况下组装该装置。像这样组装和反应开始被去偶联，其允许更详细地工艺指导，例如相比于根据现有技术的方法和装置平行反应可以更容易地同时开始。

根据不同的布局，第一支撑表面（模板表面、DNA微阵列）和/或第二支撑表面（捕获或微阵列表面、蛋白质微阵列拷贝）还可以包括微结构以生产微流体缺口自身（完全地或部分地或协助它）或者可在初级表面和次级表面之间设置垫片以生产微流体缺口。在一个表面上的这种结构或垫片将允许以标准显微镜载片的形式来应用至少一个微阵列。

此外，微流体结构可以展示在DNA阵列上以及在捕获表面上高度限定的位置上的接触，且以限定的方式定义作为这种限制扩散的微腔。随着这种微流体引导，输出分子的扩散也可以被引导并且创建与DAPA***相比更加高度限定的、更小且更灵敏的结构是可以实现的。

与本领域众所周知的那些（例如DAPA）相比，本发明的又一个优势是减少实施本方法所需的无细胞酶促和/或化学反应***的数量和/或体积。用无细胞酶促反应混合物浸润膜（像在DAPA中一样）需要大体积的所述混合物且因此花费昂贵。本发明的装置的小体积反应室能够显著降低所需的一次性反应混合物的量且因此导致显著的花费减少。

附图说明

附图示出了本发明的方法和装置的各种应用。

在优选布局中，通过夹紧阵列（第一和第二表面）之间的垫片来实现组装。

根据填充微流体缺口的酶促***，可能生成DNA或RNA微阵列代替蛋白质微阵列。使用相应的酶促***（像核酸聚合酶），可能生成来源于初级阵列上的核酸的DNA或RNA。

图1：本发明的DAPA、设计1和设计2的布局（侧视图和俯视图）显示了相对于垫片和支撑表面的入口和/或出口的各种位置。

图2：用于手持型装置的设计1（透视图）除了第一支撑表面和第二支撑表面之间的垫片之外还包括上部、下部和侧面的安装支架（支撑器）。

图3：用于手持型装置的设计2（透视图）包括具有螺栓元件的安装支架。

图4：原型1（侧视图和俯视图）显示封闭/密封元件，填充经由一个表面发生。

图5：原型2（侧视图、俯视图和透视图）说明了支撑表面、垫片、室、入口和/或出口的结构和组装，由此填充经由侧面在表面之间发生。

图6：原型3（侧视图），使用珀耳帖元件和视窗；类同于原型1，但是兼容于自动填充站或手持筒。

图7：原型4（侧视图和透视图）显示用PDMS建造的合并了集成微结构（作为1和4（第一支撑表面和垫片）的组合）的结构，由此显示DNA阵列，且装置包括合成（塑料）材料的强化的载体和用于密封装置的凸起的边缘（密封边缘或边界，其还可以经由粘合剂连接）。

图8：原型5（侧视图和透视图）显示除了***框架之外的入口和/或出口元件的可替换的布置，以微流体结构化的垫片为特征。

图9：流体室的另外的设计（俯视图）显示可替换的入口和/或出口布置，PDMS支撑、用于均匀且快速填充的多分支流体通道。

图10：根据本发明的装置的流通池结构的透视图，指示用于将两个支撑表面与微流体室固定在一起的铰链结构，包括用于入口/出口的供应线。

图11：用于将两个支撑表面固定在可靠的和稳定的结构中且密封微流体室的夹持结构的透视图和俯视图。螺栓（机械张力）***被显示为除了螺栓元件之外上面、下面和侧面的安装支架（支撑器）的组装，由此还示出与供应线集成的流细胞。

图12：铸造站设备，（a）具有TMMF微结构的晶圆；（b）放置在离心铸造框架中的晶圆，（c）分离的铸件。

图13：生产第一支撑表面的模板核酸，（a）指定使用来自Qiagen的线性模板套件的即时表达DNA；具有启动子序列的接头引物，RBS，开始-/终止-密码子和具有与编码序列的重叠序列的标签。（b）凝胶电泳来源于各种即时表达扩增的DNA序列。道1、9和16显示梯带，道2、3和4表示阴性对照，道5、2、8和10-14表示在用于微阵列的蛋白质的生产中用作模板DNA的各种扩增的编码序列。

图14：蛋白质阵列：蛋白质微阵列根据PDMS流通池（a-d）和环氧载玻片（e+f）上的erDNA模板构建，经由gesim绘图仪（分别在原始DAPA***（e+f）中的手持型装置（a-d））点样。允许无细胞表达发生，且随后将蛋白质片用Cy3和Cy5标记抗体标记。于37℃的孵育次数如下文中所描述的。

附图图标：

1第一支撑表面（模板表面，携带一个或多个模板分子，例如核酸）

2第一支撑表面和第二支撑表面之间的空间分离，其优选地含有无细胞酶促和/或化学反应***

2aDPA***中的膜

2b（微）流体孵育室（微流体缺口）

3第二支撑表面（捕获或微阵列表面），所生成的分子排布于其上

4第一支撑表面和第二支撑表面之间的垫片，避免两个表面的直接物理接触，其被放置在1或3之间或集成在其中

5用于填充、排空和/或移除空气的流体入口和/或出口

6具有用于流体的微信道的微流体结构

7上部安装支架（支撑器）

8下部安装支架（支撑器）

9侧面安装支架（支撑器）

10用于密封和/或扣紧的封闭

11螺栓元件

12珀耳帖元件

13作为1和4的组合的集成的微结构

14供应线

15PDMS

16检测窗口

17用于固定和/或锁定构造的加紧装置（夹持器）

18具有连接管的开口（钻孔）

19DNA阵列

20合成（塑料的）材料的强化的载体

21用于密封的卷边（密封边或边框）

22用于密封表面的***框

23减少弹性PDMS塌陷的风险的PDMS中的支撑物

24用于均匀且快速地填充的多分支流体通道

25铰链

26安装支架

27引起用于密封的张力的装置

具体实施方式

用于DNA到蛋白质拷贝的应用实施例

已经构建原型，其使用微流体缺口代替膜。这一微流体缺口可以经由毛细力用液体填充。65um厚的垫片在原型1（设计1）或2（设计2）（图1到图5）中第一和第二表面之间确定的距离和在将无细胞表达***填充到其中时对其的流体引导可行。该手持型的设备允许容易的且快速地将将两个显微镜载片相互组装和固定。在完成组装后，无细胞表达混合物可以经由表面（原型1）（设计1）中的孔口或垫片一侧的（原型2）（设计2）小开口注入。与DAPA***和将膜放置在该表面上相比，该实现的手持型允许确定的反应开始，尤其针对反应开始的时间，以及膜自身中不容易被确定的准确的浓度和体积。

蛋白质复制的反应同样地没有在装配处开始（如在DAPA***中）。其仅在细胞混合被注入时开始。在注入无细胞混合物之后，手持型设备被放置在孵育箱中25到45分钟。由于装置的小重量和因此低的热容量，其非常快速地达到期望的反应温度。在孵育时间之后，微阵列表面彼此分开且阵列被清洗。已经取得了积极的结果，显示与DAPA阵列相比可比较的且在许多情况中改进的阵列。

原型3（图6）是更复杂的筒，其可以被集成到流体通道设备中。它允许通过来自一侧的珀耳帖元件对流体进行热控制。这允许调整任何期望的温度或温度概况。此外生成阵列（蛋白质阵列）的一侧是可随意观看的，其意味着可能直接监视蛋白质合成。连接的原型可以经由注射泵填充，但也可以被排空或被清洗。

原型4（图7）由塑料制成（像PDMS）并且是将DNA微阵列点样在其上的结构。该结构由薄（微米高的十分之几）框加边框，其包围全部的反应体积。其还包括用于将液体引入和引出的入口线和出口线。第二表面（蛋白质微阵列）是显微镜玻璃载片。通过简单地“夹紧”在玻璃载片上，PDMS与该表面一起形成微流体缺口。经由入口和出口，全部的构造可以用流体填充。反应时简单地相互夹紧阵列。

相同的、类似的布局还可以在第二表面（蛋白质微阵列）的一侧实现。针对该布局，PDMS必须涂有“蛋白质捕捉器***”，其可以是优选地镍NTA。第一表面（DNA微阵列）将是平的显微镜载片。

原型5（图8）是PDMS结构，其中第二表面（蛋白质微阵列）以及第一表面（DNA微阵列）经由类似抽屉的机械部分滑入。PDMS和两个玻璃片一起形成微流体缺口。该原型是有利的，归因于入口和出口位于PDMS（导致较小的泄漏可能性）和两个表面之内，第一（DNA）和第二表面（蛋白质微阵列）以标准显微镜玻璃方式存在（不需要任何特定结构的DNA和/或蛋白质微阵列表面且因此更高地容纳实验室中的用户）的事实。

图9显示如何使用不同的垫片布局来实现微流体。实现微流体缺口的垫片引入额外的优点。

第一（DNA微阵列）和第二表面（蛋白质微阵列）被微流体缺口分离。不存在第一和第二表面之间的物理“硬性”接触，其防止机械应力、磨损和划痕。这确保DNA微阵列的延长的寿命且提升了蛋白质-微阵列拷贝的质量。

设备的组装和反应开始被去偶联。这允许在任意时间处的组装且反应开始于任何其它稍后时间点，其意味着精确的反应控制。处理和过程引导中的这些优点使得能够更好的重现反应条件以及按需开始反应。可以实现更容易的组装（与DAPA***相比），通过：

第一表面（DNA阵列）的微结构，

第二表面（蛋白质阵列）的微结构

或微结构化垫片，其被放置在两个表面之间（优选应用布局）。

在垫片的情况中，两个表面可以以标准的显微镜载片的形式存在且不需要额外的密封。这归因于一旦放置表面垫片自身可密封存在的事实。该简单的组装允许快速的处理时间。同样地这使得取得DNA阵列直到获得蛋白质阵列的整个处理过程的时间将从DAPA***中的大约3小时减少至使用本发明的手持型设备的大约30分钟。这是循环时间非常显著的减少。

所述装置和方法的优点是：在保留全部功能的情况下通过微流体缺口替代麻烦的膜，蛋白质生成、分别地RNA生成、分别地DNA生成且将这些分子转移到第二表面，尤其将蛋白质从第一DNA微阵列转移到第二蛋白质微阵列上，将组装的装置和反应开始去偶联。

已经避免了现有方法的状态的下列缺点：难处理的浸透且薄的膜，因将膜放置到表面上而来的膨胀和气泡，在膜和DNA微阵列之间的共形接触处直接开始反应，由于DNA微阵列和膜之间的机械接触的DNA微阵列的物理磨损。

DNA到DNA拷贝的应用实施例

如同DNA到蛋白质复制所使用的，可实现用于DNA到DNA拷贝的相应的设置。这里初级表面含有例如具有已知的开始和结束序列的DNA。第二表面将均匀涂覆来初级表面的DNA的相同的开始序列的引物（或具有特殊结构）。

通过用与DNA已知端相配的引物填充DNA扩增混合物（像DNA聚合酶），每个DNA链将被扩增到cDNA中，如在[15]中。通过加热***，该cDNA将被释放且将扩散远离初级阵列的点。通过冷却***，释放的cDNA粘贴回初始的点或者与第二表面的引物相互作用。在那里聚合酶将cDNA扩增到第二表面的引物上且生成共价结合的ccDNA，且同样地初始DNA的相同复制。因此初级DNA微阵列的正相DNA微阵列拷贝在第二表面上制得。

再次，像在DNA到蛋白质拷贝中一样，微流体缺口可以存在于第一和/或第二表面上和/或位于两个表面之间的垫片。来自DNA到蛋白质拷贝的所有优点也适用于此。此外，该布局允许可以从DNA微阵列实现正相拷贝。

通过选择第二表面上或酶促混合物中的不同的引物，还可能生成反相拷贝。这可以通过由结束序列交换第二表面上的表面引物且仅增加少量的末端引物到溶液中来实现，同时大量加入初始引物。

其它拷贝的应用实施例

根据使用的酶促混合物，可以实现不同的拷贝：

使用任何DNA扩增混合物例如重组酶-聚合酶-扩增（RPA）、等温DNA扩增***或NASBA的DNA到DNA拷贝；通过逆转录酶以及之后的与第二表面的连接步骤的RNA到DNA拷贝；使用任何RNA扩增像例如RNA聚合酶的DNA到DNA拷贝。

DNA到蛋白质拷贝的详细地实验性的描述

本文提供的实验性的实施例涉及实现用于从DNA微阵列生产分子微阵列（优选生产蛋白质微阵列）的简单的手持型装置。76x26x1mm(分别地75x25x1mm或其它类似的大小)的标准载玻片被用作DNA和蛋白质微阵列的载物片。在一个实施方案中，用于制造微阵列的装置包括约40微米厚的疏水性垫片。该垫片另外具有微流体输入和输出，且作为很低高度和容积的孵育室起作用。此外，除了使用可靠的布置来固定所述载玻片之外，最后调整的机械张力***还使得微阵列所用的载玻片能够快速交换。孵育室可以手动地经由移液管或通过常用泵送装置填充，由此无细胞蛋白表达***的混合物被填充至孵育室中。通过该方法，蛋白质微阵列可以以不复杂的快速且有成本效益的方法从DNA微阵列制得。这种蛋白质微阵列特别用于各种蛋白质分析，例如蛋白质-蛋白质或蛋白质-分子相互作用。

蛋白质微阵列技术有点落后已建立的DNA微阵列技术。蛋白质微阵列生产中的现存问题中的一个是经由重组表达来生成全长蛋白质，随后纯化重组蛋白质且在载玻片上点样。作为替换选择，肽的化学原位合成的各种方法是可用的，然而这种方法主要地适用于短肽而不代表全长蛋白质微阵列的生产的实际的选项。

本实验性的实施例说明经由稳健性微流体手持型装置来从DNA微阵列合成全长蛋白质微阵列。在一个实施方案中，已经生产简单的原型，其在图1a）和图1b）中说明。图中给出的原型表示在本领域已知的DAPA***之上的改进。除了该室的紧密密封以及提供很小容积的孵育室以便于最小化蛋白质的横向扩散之外，孵育室的无气泡填充已经被进一步开发且示出在进一步的实施例中。

DNA模板的生成

为了从任何给定的核酸序列生成即时表达的DNA模板（erDNA），来自Qiagen的线性模板套件（LTK）已经被应用。在第一PCR反应（聚合酶链反应），将显示与编码DNA模板具有约20个核苷酸的重叠区的内部构建的引物连同接头引物和检测序列（例如标签）一起经由扩增加至原本DNA链。第二PCR反应将第一PCR反应的产物用作模板且借由接头引物（优选地还与加入的标签例如His-或Strep-标签以及用于允许RNA聚合酶（T7引物）和核糖体起始端（RBS）（除了终止密码子之外）结合的序列一起）来延伸DNA产物。使用该套件，DNA模板已经表达准备好被扩增，且经由凝胶电泳实验（图13）示出该结果。PCR产物的序列分析确认期望的结果。这些实验示出经由来自Qiagen的LTK套件，DNA模板被延伸具有标签序列且生产为即时扩增的盒。

手持型装置的优化

本发明的实施方案中的一个涉及很低体积和低高度的微流体流通池，其基于大约100微米厚的自粘激光切割聚酯箔的使用，其经由粘合剂连接且随后用另一个载玻片或盖玻片覆盖。本发明的这种特殊形式运行很好，而且展示了一些其它小缺点。例如，自粘箔对于与DNA模板一起孵育是次佳的，该箔仅可以某些厚度使用，该箔不展示恒定的厚度，流通池的三维结构不允许无气泡填充且输入和输出需要提供通过载玻片（其对于玻璃来说是困难的）或通过构建的一侧的通路（其可以是难以密封的）。

为了克服这些小缺点，我们已经生产了手持型装置的两个另外的实施方案。两个另外的装置的结果提供了装置的改进的填充，完全可靠的密封和简单的可用性。变型中的一个专门地将玻璃制成的标准载玻片(76x25x1mm³)用作载体结构，由此其另一个实施方案基于从PDMS构建的三维结构的流通池，其中固定DNA阵列的孵育室。

具有结构PDMS流通池的手持型设备

该实施方案由微结构PDMS片（图7）组成，其被功能化以便用于使用PDITC固定DNA模板分子。使用涂有镍NTA的片覆盖PDMS片。孵育室的填充和/或排空经由PDMS片中的开口来发生。PDMS片的主片被打磨以形成正确的形状。手动流站允许PDMS片的填充和排空（图12）。

为了改善无气泡填充和密封能力，使用干膜光刻胶（TMMF，30/45微米厚度）或液体漆器SU-8经由光刻法（图12a）例如旋覆法来产生先前描述的结构。结构性晶圆被放置在用于浇注PDMS片的离心浇注模具（图12c）。

用于两个标准载玻片的手持型装置

根据该实施方案的装置旨在用于两种微阵列的两个标准载玻片。孵育室的填充经由微流体通道发生，其形成在具有疏水性和弹性的密封表面的垫片内。垫片由涂有25微米厚的（通常500nm-15微米）不锈钢板的Teflon（替换直接使用30-80微米厚的Teflon箔）制成。该片需要用强力向疏水性垫片压紧，以便产生可靠的密封。快速替换载波片的装置允许各种载波片的快速且容易的交换。

蛋白质阵列的无细胞蛋白质表达

为了评估两个无细胞真核表达***，将EasyXPress（Qiagen）和RTS100（5PRIME）与PDMS流通池的手持型装置（孵育室大约60微米高，2×8mm（图6a和图6b）/2×5mm（图6c+图6d）和具有膜的原始DAPA***（图6e+图6f））一起使用。用Gesim点样仪将两个erDNA模板点样在PDMS流通池中和环氧涂有载玻片上且随后表达分别90/180分钟（RTS100）和40/90分钟（EasyXpress）。然后，将该载玻片用的抗Cy3-/Cy5标记的抗体标记。

实验性实施例的总结

使用来自Qiagen的LTK来生成erDNA已经被评估且说明可以使用已知的引物系列扩增任何给定的DNA模板。两个检查的无细胞表达***（EasyXpress和RTS100）还示出积极的结果。所开发的手持型设备和它们的制造过程已经被测试且被示出以提供有益的结果，显示蛋白质阵列的生产时间在某些情况中为15-20分钟。随着室高度的降低，期望生产时间的降低。

文献

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Claims

1.一种用于产生分子微阵列的方法，包括：

a)提供第一支撑表面，其展示固定在其表面上的一个或多个模板分子，和相对的第二支撑表面，所述第二支撑表面为捕获或微阵列表面，

c)经由所述第一和第二支撑表面之间的流体将所述输出分子转移到第二支撑表面，所述第一支撑表面上的模板分子位置和所述第二支撑表面上的相应输出分子的沉积之间具有相关性，

其特征在于，

d)在步骤b)起始之前，在步骤a)中发生支撑表面在固定位置的组装，由此步骤b)的起始的阻止由以下实现：以相对的分离的第一和第二支撑表面之间形成的微流体孵育室的形式的所述支撑表面之间的空间分离阻止，其中将无细胞酶促和/或化学反应***引入到所述微流体孵育室引起所述输出分子的生产且使得所述输出分子转移到所述第二支撑表面。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤b)的起始进一步被以下阻止

-在步骤b)起始之前含有空气的所述第一支撑表面和所述第二支撑表面之间的空间分离，避免两个表面的直接物理接触，

-阻碍无细胞酶促和/或化学反应***的化学的或含能的环境，和/或

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微流体孵育室不包括位于所述第一和第二支撑表面之间的膜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据权利要求1的步骤b)经由无细胞酶促和/或化学反应***起始所述输出分子的生产之前，所述第一支撑表面和所述第二支撑表面彼此相对被保持在固定位置。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可以多次使用单个第一支撑表面来重复所述方法，以生产多个微阵列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)的起始由存在于所述第一和/或第二支撑表面上的化学封闭剂，或者耗尽或限制用于无细胞酶促反应***的必需化合物来阻止，所述化学封闭剂阻碍所述无细胞酶促和/或化学反应***和/或阻碍所述输出分子与所述第二支撑表面的结合，其可以如所需的被修改和/或移除以起始所述方法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无细胞酶促和/或化学反应***的阻碍涉及使用与反应组分的必需的OH基团连接的光可裂解的化学取代基，借此采用光照处理释放所述反应组分并使得反应可以开始，或将必需的反应组分结合和/或捕获到所述第一或第二表面，使得反应起始仅在填充或外部脉冲时发生。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)的起始的阻止涉及分子从活动状态到非活动状态或从非活动状态到活动状态的分子开关，通过

-pH改变，导致pH敏感分子中的功能性的改变，

-温度的改变，导致分子结构或动力学的改变，由此一旦加温，反应起始发生，

-照明，通过光诱反应，借此采用光照处理释放反应组分并使得反应可以开始，和/或笼锁组分的释放，诱导封闭的、感光的或笼锁的分子的改变，

-或其组合。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

模板分子是核酸或核酸样的分子。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述无细胞酶促和/或化学反应***为

-DNA聚合酶或DNA扩增酶或酶***，

-RNA聚合酶或RNA扩增酶或酶***，

-逆转录酶或RNA到DNA转录酶或酶***，

-蛋白质合成***或无细胞表达混合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无细胞酶促反应***是DNA聚合酶，所述输出分子是DNA且DNA微阵列生成在所述第二支撑表面上。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无细胞酶促反应***是RNA聚合酶，输出分子是RNA且RNA微阵列生成在所述第二支撑表面上。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无细胞酶促反应***是逆转录酶，输出分子是DNA且DNA微阵列生成在所述第二支撑表面上。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无细胞酶促反应***是蛋白质合成***或无细胞表达混合物，所述输出分子是蛋白质且蛋白质微阵列生成在所述第二支撑表面上。

15.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阻碍无细胞酶促和/或化学反应***的化学的或含能的环境是限制或阻碍所述***的活动的pH值和/或温度。

16.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一支撑表面和所述第二支撑表面经由机械张力或弹簧***彼此相对被保持在固定位置。

17.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述被结合和/或捕获到所述第一或第二表面的必需的反应组分选自ATP、必需的盐、辅酶、维生素和金属离子。

18.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

-所述pH改变，导致pH敏感分子中的功能性的改变，通过涂有二氧化钛的表面的光照处理导致生成H+离子和随后的pH改变而发生，

-所述温度的改变，导致分子结构或动力学的改变，通过降低的温度导致DNA或RNA聚合酶失活而发生，

-所述照明，通过光诱反应诱导封闭的、感光的或笼锁的分子的改变，通过使用与必需的反应组分连接的光可裂解的化学取代基而发生，和/或

所述光照处理释放所述反应组分并使得反应可以开始，和/或笼锁组分的释放，通过光诱导的笼锁的生物素或其它分子的释放而发生。

19.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸或核酸样的分子为DNA、RNA、基因组DNA、克隆的DNA片段、质粒DNA、cDNA或cDNA文库、PCR产物、合成的DNA或DNA寡核苷酸、mRNA或合成的RNA。

20.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述蛋白质合成***或无细胞表达混合物是将DNA转录为RNA和将RNA翻译为蛋白质所需的酶混合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述将DNA转录为RNA和将RNA翻译为蛋白质所需的酶混合物是选自原核或真核***的无细胞溶解物。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述原核或真核***是大肠杆菌、细菌来源、兔网织红细胞、昆虫来源、人类或小麦胚芽。

23.由根据权利要求1所述的方法产生的分子阵列。

24.一种用于根据前述权利要求中的任一项的方法生产分子微阵列的装置，包括：

a)第一支撑表面，其展示固定在其表面上的一个或多个模板分子，

b)第二支撑表面，其与所述第一支撑表面组装，其中所述第二支撑表面是捕获或微阵列表面，其预先涂有配置为将所述输出分子与所述表面共价或非共价连接的固定剂，

c)由此微流体孵化室用于无细胞酶促和/或化学反应***的物理地分离且相对的所述第一和第二支撑表面之间形成，由此将所述支撑表面的组装与无细胞酶促和/或化学反应的起始去偶联，

d)进入所述孵育室的流体入口和/或出口，

e)用于在固定的位置保持两个相对的支撑表面的装置，以及

f)用于将所述孵育室维持为所述两个相对的支撑表面之间的空间的装置。

25.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述微流体孵育室不包括布置在所述第一和第二支撑表面之间的膜。

26.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，用于将所述孵育室维持为所述两个相对的支撑表面之间的空间的装置是第一和第二支撑表面之间的垫片。

27.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，用于将所述孵育室维持为所述两个相对的支撑表面之间的空间的装置是一个或多个三维结构(3D)流通池。

28.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述流体入口和/或出口适合于所述无细胞酶促和/或化学反应***以被泵入或吸入和/或泵出或吸出所述孵育室。

29.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述模板分子是根据权利要求9中的所述分子中的任何一个。

30.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述支撑表面之间的空间分离的高度小于100微米。

31.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第一和第二支撑表面是玻璃、塑料、尼龙或其它类型的天然或合成聚合物或膜。

32.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第一和/或第二支撑表面是适用于显微镜使用的标准玻璃片。

33.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述装置在长度上具有手持型的尺寸。

34.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，用于将所述两个相对的支撑表面保持在固定的位置的装置包括安装支架，位于上部、下部或侧面的支架，与所述两个支撑表面相关定位。

35.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述支撑表面或者所述安装支架通过机械张力、磁力、弹簧***或所述表面的引导轨道被固定就位，由此将所述两个支撑表面保持在固定的位置。

36.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第二个支撑表面预先涂有配置为将所述输出分子与所述表面共价或非共价连接的固定剂，其中所述固定剂是蛋白质固定剂。

37.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第一支撑表面是：

-核酸或核酸样的分子的微阵列，

-展示核酸的序列芯片，

-表面上的空间限定的核酸分布，

-微珠阵列或结构表面上空间限定的核酸分布，

-含有核酸的液体或固体材料的空间限定的分布。

38.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述用于将所述孵育室维持为所述两个相对的支撑表面之间的空间的装置是一个或多个合成聚合物的三维结构(3D)流通池。

39.根据权利要求38所述的装置，其特征在于，所述合成聚合物是薄膜聚合物材料或聚二甲硅氧烷(PDMS)。

40.根据权利要求30所述的装置，其特征在于，所述支撑表面之间的空间分离的高度小于80微米。

41.根据权利要求40所述的装置，其特征在于，所述支撑表面之间的空间分离的高度小于60微米。

42.根据权利要求33所述的装置，其特征在于，所述手持型的尺寸为60-140mm、80-120mm或105mm的长度，以及30-90mm、40-80mm或60mm的宽度。

43.根据权利要求36所述的装置，其特征在于，所述蛋白质固定剂选自被配置为与所表达的蛋白质共价或非共价连接的抗体，多组氨酸序列、整合剂以及对标签和/或生物素结合分子特异性的抗体。

44.一种用于产生分子微阵列的***，包括：

b)第二支撑表面，所述第二支撑表面是捕获或微阵列表面，其与所述第一支撑表面组装，由此微流体孵育室在物理分离且相对的第一和第二支撑表面之间形成，

c)进入孵育室的流体入口和/或出口，

d)用于将所述两个相对的支撑表面保持在固定的位置的装置，以及

e)用于将所述孵育室维持为所述两个相对的支撑表面之间的空间的装置，

由此

f)微阵列通过在将无细胞酶促和/或化学反应***引入到所述微流体孵育室之后从所述模板分子生产输出分子并将所述输出分子转移到所述第二支撑表面的表面来形成，由此引起所述输出分子的生成和向所述第二支撑表面的转移，由此所述支撑表面在固定位置的组装发生在将无细胞酶促和/或化学反应***引入到所述微流体孵育室之前。