CN103338786A - 用于治疗淀粉样斑块相关症状的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖用于有效治疗Aβ斑块相关症状的至少一种症状或症候、或用于降低淀粉样斑块负荷的组合物和方法。所述方法包括对活哺乳动物生物***(如对人)施用有效量的抗ApoE抗体。

Description

用于治疗淀粉样斑块相关症状的组合物和方法
政府支持
本发明是在政府资助(NIH授予号AG013956)下完成的。政府对本发明享有特定权利。
发明领域
本发明涉及用于延迟或预防受试者中的Aβ斑块相关症状的组合物和方法，所述Aβ斑块相关症状如那些与阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease，AD)相关的。具体地，本发明涉及调控受试者脑中淀粉样-β(Aβ)的浓度。
发明背景
阿尔茨海默氏病(AD)是痴呆的最普遍的起因，也是一种日趋增多的公共健康问题。目前估计其影响着美国境内500万人口，预期到2050年将增加至1300万人口。阿尔茨海默氏病导致记忆、认知功能的丧失，并最终导致完全失去独立性。它给受试者和家庭带来沉重的个人和财政代价。由于该疾病在人群中的严重性和渐增的流行性，迫切需要开发出更好的治疗。
生化、遗传和动物学模型证据暗指淀粉样-[β](Aβ)是AD中的致病肽。AD的神经病理学和神经化学标志包括突触丧失和选择性神经元死亡、某些神经递质的减少、以及异常蛋白质性沉积物在神经元内(神经原纤维(neurofibrillary)缠结)和胞外空间内(脑血管的、弥散的和神经炎斑块)的存在。这些斑块的主要组分是Aβ，一种从淀粉样前体蛋白质(APP)切割的38-43个氨基酸序列的肽。
在整个生命过程中，可溶性Aβ主要由神经元分泌，但也由其它细胞类型分泌。过多的Aβ沉积可能起因于脑中增加的Aβ合成(如在家族性早期发作型AD中发生的)或降低的Aβ清除。对于Aβ的生成发生在更常见的AD的后期发作形式中缺乏具有说服力的证据，这表明不充分的Aβ清除可能驱动Aβ沉积以及淀粉样斑块形成。
载脂蛋白E(ApoE)基因仍然是后期发作型AD的最广泛复制的遗传风险因子，E4等位基因的携带者的风险高3-15倍，且疾病发作时的年龄更低。在脑中，ApoE主要由在淀粉样斑块周围发现的星形胶质细胞和小胶质细胞合成和分泌。本发明提供能有效降低AD小鼠模型中淀粉样斑块负荷的ApoE抗体。
发明概述
本发明的一个方面涵盖一种有效治疗至少一种临床可检测的Aβ斑块相关症状的方法，其包括对活的人受试者施用有效量的抗ApoE抗体。在另一个方面，本发明涵盖可用于这类治疗的抗体。例如，治疗性减轻Aβ肽在活的哺乳动物中的毒性影响的抗体。
本发明的另一个方面涵盖包含至少一种抗ApoE抗体的组合物。在一个方面，本发明涵盖一种组合物，其包含至少一种从杂交瘤HJ6.1,HJ6.2,HJ6.3,HJ6.4或其组合生成的抗ApoE抗体。在一个方面，本发明涵盖包含至少一种抗ApoE抗体的药物组合物(medicinal composition)。在一个方面，本发明涵盖一种药物组合物，其包含至少一种从杂交瘤HJ6.1,HJ6.2,HJ6.3,HJ6.4或其组合生成的抗ApoE抗体。
本发明的又一个方面涵盖可用于治疗至少一种临床可检测的Aβ斑块相关症状的药物组合物。所述组合物包含药物有效量的抗ApoE抗体，其适于对活的人受试者施用。在一个方面，可用于这类治疗的抗体包括治疗性减轻Aβ肽在活的哺乳动物中的毒性影响的抗体。在一个方面，将所述药物组合物有效施用给活的受试者。
本发明的再一个方面涵盖一种包含有容器和任何将用于施用的医学装置的药物试剂盒，所述容器含有药物有效量的抗ApoE抗体的功能性的治疗性药物组合物，其适于施用给活的人受试者。在一个方面，可用于这类治疗的抗体包括治疗性减轻Aβ肽在活的哺乳动物中的毒性影响的抗体。
本发明的其它方面和重述在下文详述。
附图简述
图1图示了抗ApoE抗体在来自PS/APP小鼠的海马(hippocampus)样品中降低淀粉样斑块负荷的强效果，所述小鼠从3月龄时开始至7月龄时每周一次用10mg/kg抗Aβ抗体(HJ3.4)或两种抗ApoE抗体之一(HJ6.2或HJ6.3)进行腹膜内处理。对照组用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。所评估的动物数量为N=7(PBS),N=16(HJ3.4),N=16(HJ6.2),N=16)。
图2图示了抗ApoE抗体在来自PS/APP小鼠的脑皮质(cortex)样品中降低淀粉样斑块负荷的强效果，所述小鼠每周一次用10mg/kg抗Aβ抗体(HJ3.4)或两种抗ApoE抗体之一(HJ6.2或HJ6.3)进行腹膜内处理。对照组用PBS处理。所评估的动物数量为N=7(PBS),N=16(HJ3.4),N=16(HJ6.2),N=16)。
图3图示了使用ELISA测定法测定的，抗apoE抗体HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4对人apoE的结合。
图4图示了(A)抗apoE抗体HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4对血浆中人apoE的结合，以及(B)在接受HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4抗体的相同小鼠中的胆固醇水平。
图5图示了外周施用后，中枢神经***中抗apoE抗体HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4的存在。
图6图示了对小鼠短期施用HJ6.2和HJ6.3(抗apoE抗体)、和HJ3.4(抗Aβ抗体)10天时小胶质细胞的活化。
图7图示了以下区域的氨基酸序列：(A)HJ6.1重链可变区和第一恒定区(SEQ ID NO:4);(B)HJ6.1轻链可变区和恒定区(SEQ ID NO:2);(C)HJ6.2重链可变区和第一恒定区(SEQ ID NO:8);(D)HJ6.2轻链可变区和恒定区(SEQ IDNO:6);(E)HJ6.3重链可变区和第一恒定区(SEQ ID NO:12);(F)HJ6.3轻链可变区和恒定区(SEQ ID NO:10);(G)HJ6.4重链可变区和第一恒定区(SEQ IDNO:16);(H)HJ6.4轻链可变区和恒定区(SEQ ID NO:14)。突出显示包含CDR的区域。
发明详述
申请人已经发现用于有效治疗Aβ斑块相关症状的抗体及其使用方法。所述方法包括对活的受试者有效施用药理学有效量的抗ApoE抗体。本发明涵盖以下发现，即抗apoE抗体为患有Aβ斑块相关症状的受试者提供治疗。由此，本发明提供了Aβ斑块相关症状的症候和症状可能至少部分是由于ApoE的有害影响的证据。在一个方面，所述受试者呈现出至少一种临床前或临床症状或症候。在一个方面，可用于这类治疗的抗体包括治疗性减轻Aβ肽在活的哺乳动物中的毒性影响的抗体。在一个方面，可用于这类治疗的抗体包括那些结合ApoE内表位的抗体。
在一个方面，将抗ApoE抗体与至少一种合适的相容性佐剂或赋形剂混合，从而得到治疗性药物组合物，其能够有效地施用给(给予)活的受试者，如患有Aβ斑块相关症状的人。通常它是一种具有高纯度的水性组合物。
如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”包括预防、减轻、逆转或改善Aβ斑块相关症状的至少一种症状或症候。
如本文中使用的，术语“治疗性减轻”包括引起变化或因此具有有益的正面效果。
Aβ斑块相关症状的一种定义指任何由淀粉样斑块的形成所导致的症状，所述淀粉样斑块由称为淀粉样原纤维的规则排列的纤维状聚集物构成。具有Aβ斑块相关症状的例示性病症包括但不限于，阿尔茨海默氏病、Lewy小体痴呆(Lewy body dementia)、和脑淀粉样血管病。
例示性Aβ斑块相关症状可以包括受损的认知功能、改变的行为、情绪失调、发作(seizure)、受损的神经***结构或功能、或形成阿尔茨海默氏病的风险增加。受损的认知功能可以包括但不限于，记忆力、注意力、专心、语言、抽象思考、创造力、执行功能、计划和组织方面的困难。改变的行为可包括但不限于，身体或语言攻击(physical or verbal aggression)，冲动性，抑制降低(decreased inhibition)，情感淡漠，启动减少(decreased initiation)，人格变化，酒精、烟草或药物滥用，以及其他成瘾有关行为。情绪失调可以包括但不限于，抑郁、焦虑、躁狂、易怒、和情绪不能节制。发作可以包括但不限于，全身强直阵挛性发作(generalized tonic-clonic seizure)、复杂部分发作(complex partial seizure)、以及非癫痫性的心因性发作(non-epileptic,psychogenic seizure)。受损的神经***结构或功能可以包括但不限于脑积水(hydrocephalus)、帕金森病(Parkinsonism)、睡眠障碍(sleep disorder)、精神病、平衡和协调受损。这可以包括运动受损如单肢轻瘫(monoparesis)、轻偏瘫(hemiparesis)、四肢轻瘫(tetraparesis)、共济失调(ataxia)、舞蹈病(ballismus)和震颤(tremor)。这还可以包括感官损失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这可以包括自主神经***受损，如肠和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和温度失调。最后，这可以包括由下丘脑和垂体腺功能障碍所产生的激素受损，如生长激素、甲状腺刺激激素、***(lutenizing hormone)、促卵泡激素、***释放激素、促乳素、和许多其他激素和调控物的缺陷和失调。阿尔茨海默氏病形成的风险增加包括给定了受试者年龄、家族史、遗传状态和其它已知的风险因子，风险相对于预期的风险提高。
Aβ肽是从称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大蛋白质的羧基末端中的区域衍生的那些肽。编码APP的基因位于第21号染色体上。有许多可能具有毒性影响的Aβ形式：Aβ肽通常长为38-43个氨基酸序列，尽管它们可以具有改变其总体大小的截短和修饰。可以在可溶性和不可溶性区室中，胞内或胞外地，发现它们的单体、寡聚和聚集形式，并且可以与其它蛋白质或分子复合。Aβ的不良或毒性影响可由上文所记载的形式中的任一或所有、以及未具体记载的其它形式产生。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低受试者脑中淀粉样斑块负荷的方法。所述方法包括对受试者施用治疗有效量的特异性结合ApoE的抗体。合适的抗体包括那些在本文中披露的。在一个例示性实施方案中，合适的抗体包含在下表A中描述的抗体。本发明的方法可以降低受试者海马中的淀粉样斑块负荷。本发明的方法还可以降低受试者脑皮质中的淀粉样斑块负荷。在上文每一个实施方案中，所述淀粉样斑块负荷与未经治疗或经阴性对照治疗的受试者相比可以降低至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20%。在一些实施方案中，所述淀粉样斑块负荷与未经治疗或经阴性对照治疗的受试者相比可以降低至少20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90或95%。在其它实施方案中，所述淀粉样斑块负荷与未经治疗或经阴性对照治疗的受试者相比可以降低至少100,125,150,200,250,300,350,400或450%。测量淀粉样斑块的方法是本领域中已知的。
可用于本文中的抗apoE抗体包括治疗性减轻Aβ的不良或毒性影响的所有抗体。可用抗体包括但不限于那些特异性结合ApoE编码序列内的表位的抗体。可用于本文中的抗apoE抗体还包括减轻Aβ的不良或毒性影响并且结合ApoE的特定区域和其它形式的ApoE的抗体。ApoE的特定区域包括但不限于，C末端、N末端和其它中部域。其它形式的ApoE包括但不限于截短的、经修饰的、可溶的、不可溶的、胞内的、胞外的、单体ApoE、寡聚ApoE、纤维状的聚集的ApoE或与其它蛋白质或分子复合的ApoE。
在一个方面，可用于本发明的抗体包括那些已经被分离、表征、纯化、为功能性的且已经被回收(获得)以用在功能性治疗组合物中的抗体，所述组合物施用给具有Aβ斑块相关症状的活的受试者。
“单克隆抗体”指自单拷贝或克隆物(包括例如任何真核的、原核的或噬菌体克隆物)衍生的抗体。“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术生成的抗体。可以使用例如本领域中公知的杂交瘤技术以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术、或这类技术的组合以及本领域中容易地已知的其它技术来生成单克隆抗体。此外，可以依照本领域中已知的方法用可检测标记物标记单克隆抗体，固定化于固相上和/或与异质化合物(例如酶或毒素)偶联。
另外，“抗体”意指功能性单克隆抗体或其免疫学有效片段；如其Fab、Fab'、或F(ab')2片段。在本文一些上下文中，述及一些片段是为了具体强调；然而，应理解不管具体说明哪种片段，术语“抗体”都包括这类片段以及单链形式。只要蛋白质保留特异性结合其预定靶物的能力，那么其就包含在术语“抗体”内。还包括在定义“抗体”中的是例如单链形式，一般称为具有此特异性的抗体的Fv区。优选但不必要地，重组生成可用于本发现的抗体，因为需要对具有适当特异性的通常为鼠或其它非人的抗体进行操作以将其转变为人源化形式。抗体可以是或不是糖基化的，尽管优选糖基化抗体。如已知的，经由二硫键适宜地交联抗体。
可用于本文中的抗体的基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由等同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110或更多个氨基酸序列的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。
可用于本文中的抗apoE抗体包括那些被分离、表征、纯化、为功能性的且已经从其制备过程回收(获得)，并由此可以以治疗和药物充足的量、以有用的形式用在本文中的抗体。
轻链分为γ、μ、α和λ。重链分类为γ、μ、α、σ或ε，并且分别将抗体同种型定义为IgO,IgM,IgA,IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12或更多个氨基酸序列的“J”区连接，重链还包含约10个以上氨基酸序列的“D”区。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。由此，完整的抗体具有2个结合位点。链展现出相同的一般性结构，相对保守的框架区(FR)由3个高可变区(也称为互补决定区(下文中称为“CDR”))连接。来自两条链的CDR由框架区联配，使得能结合特定表位。从N末端至C末端，两条轻链和重链均分别包含域FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。将氨基酸序列按照已知常规分配到各个域(参见Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991;Chothia等,J.Mol.Bio.(1987)196:901-917;Chothia等,Nature(1989)342:878-883)。
在一个方面，通过标准的哺乳动物免疫技术生成具有适宜的特异性的单克隆抗apoE抗体，其从所述哺乳动物的生成抗体的细胞形成杂交瘤或者使其无限增殖化，并培养所述杂交瘤或无限增殖化的细胞以评估它们的适宜的特异性。在本发明的情况中，能通过例如用代表表位(涵盖ApoE蛋白编码序列的一个区域或其合适子区域)的肽免疫人、家兔、大鼠或小鼠来生成这类抗体。用于重组操作的材料可以通过从杂交瘤或生成期望抗体的其它细胞取回编码期望抗体的核苷酸序列来获得。然后，可以对这些核苷酸序列进行操作和分离、表征、纯化和回收，从而以人源化形式提供它们以用在本文中(若期望的话)。
如本文中使用的，“人源化抗体”包括部分或全部由自人抗体种系衍生的氨基酸序列构成的抗ApoE抗体，所述衍生通过改变具有非人互补决定区(“CDR”)的抗体的序列得到。最简单的这类改变可以简单地由将人抗体的恒定区取代为鼠恒定区组成，由此得到可能具有足够低的免疫原性从而可被药学用途接受的人/鼠嵌合体。然而，优选地，抗体的可变区甚至CDR也可以通过本领域目前公知的技术进行人源化。可变区的框架区被相应的人框架区取代，而剩下的非人CDR基本上保持完整，或甚至用自人基因组衍生的序列替换CDR。还可以随机突变CDR，从而使得在全人种系框架区或基本上人的框架区的背景中维持或增强对ApoE的结合活性和亲和力。基本上的人框架与已知的人框架序列具有至少90%,95%或99%的序列同一性。在经遗传修饰的小鼠中生成全部有用的人抗体，所述小鼠的免疫***已经过改变以对应于人免疫***。如上文所提及的，采用抗体的免疫学特异性片段(包括代表单链形式的片段)足以用在本发明的方法中。
此外，如本文中使用的，术语“人源化抗体”指抗ApoE抗体，其包含人框架、至少一种来自非人抗体的CDR，且其中任何存在的恒定区与人免疫球蛋白恒定区实质性等同，即至少约85-90%，优选至少95%等同。因此，除了可能的CDR之外，人源化抗体的所有部分与一种或多种天然人免疫球蛋白的相应序列对实质性等同。
若期望的话，可以如下实施人源化免疫球蛋白的设计。当氨基酸序列落入以下类别中时，将待使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸序列用来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸序列替换：(a)受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸序列对于该位置处的人免疫球蛋白是不寻常的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸序列对于该位置处的人免疫球蛋白是典型的；(b)氨基酸序列的位置紧接于其中一个CDR；或(c)框架氨基酸序列的任何侧链原子在三维免疫球蛋白模型中在CDR氨基酸序列的任何原子的约5-6埃(中心到中心)以内(Queen等,op.cit.,和Co,ct al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2869)。当受体免疫球蛋白的人框架区中的每条氨基酸序列和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸序列对该位置处的人免疫球蛋白不寻常时，这类氨基酸序列被该位置处人免疫球蛋白的典型氨基酸序列所替换。
在所有情况下，本发明的抗体特异性结合ApoE。在例示性实施方案中，本发明的抗体特异性结合人ApoE。短语“特异性结合”在本文中意指抗体以至少10-4-10-6M-1，优选10-7-10-9M-1的结合常数结合蛋白质。来自多个物种的ApoE序列是本领域中已知的，且测定抗体是否结合ApoE的方法是本领域中已知的。例如，见实施例。本发明的抗体可以识别ApoE2,ApoE3,ApoE4或其等位变体。在一个实施方案中，本发明的抗体可以识别人ApoE4。
优选的抗体是自指配为HJ6.1(ATCC专利保藏名称PT-11805),HJ6.2(ATCC专利保藏名称PT-11806),HJ6.3(ATCC专利保藏名称PT-11807),或HJ6.4(ATCC专利保藏名称PT-11808)的杂交瘤衍生的小鼠抗体的人源化形式。如本文中使用的，术语“自…衍生”意指所“衍生的”抗体包含由HJ6.1,HJ6.2,HJ6.3,或HJ6.4生成的抗体的至少一个CDR区。换言之，所“衍生的”抗体包含至少一种由选自下组的氨基酸序列构成的CDR区：SEQ ID NO:17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38和39。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.1衍生，并且可以由包含与SEQ ID NO:1的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码，或可以由包含与SEQ ID NO:2的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.1衍生，并且可以包含与SEQ IDNO:3的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列，或可以包含与SEQ ID NO:4的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列。在上文各实施方案中，所述抗体可以是人源化的。
在又一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.2衍生，并且可以由包含与SEQ ID NO:5的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码，或可以由包含与SEQ ID NO:6的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.2衍生，并且可以包含与SEQ IDNO:7的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列，或可以包含与SEQ ID NO:8的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列。在上文各实施方案中，所述抗体可以是人源化的。
在一个另外的实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.3衍生，并且可以由包含与SEQ ID NO:9的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码，或可以由包含与SEQ ID NO:10的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.3衍生，并且可以包含与SEQID NO:11的轻链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:12的重链可变区具有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列。在上文各实施方案中，所述抗体可以是人源化的。
在再一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.4衍生，并且可以具有与SEQ ID NO:13的轻链可变区有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列，或与SEQ ID NO:14的重链可变区有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以自杂交瘤HJ6.4衍生，并且可以具有与SEQ ID NO:15的轻链可变区有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:16的重链可变区有90,91,92,93,94,95,96,97,98或99%同一性的氨基酸序列。在上文各实施方案中，所述抗体可以是人源化的。
在本发明的结合抗apoE的抗体的一个例示性实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:1的轻链核酸序列和SEQ ID NO:2的重链核酸序列[即本文中称为HJ6.1的单克隆抗体]。在本发明的结合抗apoE的抗体的另一个例示性实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:3的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的重链氨基酸序列[即本文中称为HJ6.1的单克隆抗体]。在本发明的结合抗apoE的抗体的再一个例示性实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:5的轻链核酸序列和SEQ ID NO:6的重链核酸序列[即本文中称为HJ6.2的单克隆抗体]。在本发明的结合抗apoE的抗体的又一个例示性实施方案中，所述抗体包含SEQ IDNO:7的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:8的重链氨基酸序列[即本文中称为HJ6.2的单克隆抗体]。
在某些实施方案中，本发明的抗体由SEQ ID NO:9的轻链核酸序列和SEQ ID NO:10的重链核酸序列编码[即本文中称为HJ6.3的单克隆抗体]。在其它实施方案中，本发明的抗体由SEQ ID NO:11的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO:12的重链氨基酸序列编码[即本文中称为HJ6.3的单克隆抗体]。在另一个实施方案中，本发明的抗体由SEQ ID NO:13的轻链核酸序列和SEQ IDNO:14的重链核酸序列编码[即本文中称为HJ6.4的单克隆抗体]。在又一个实施方案中，本发明的抗体由SEQ ID NO:15的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO:16的重链氨基酸序列编码[即本文中称为HJ6.4的单克隆抗体]。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含轻链CDR1，如表A的抗体1,49,97和145。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含轻链CDR2，如表A的抗体4,52,100和148。在再一个实施方案中，本发明的抗体可以包含轻链CDR3，如表A的抗体6,54,102和150。在备选的一个实施方案中，本发明的抗体可以包含2种或3种轻链CDR的组合，如表A的抗体2,3,5,50,51,53,98,99,101,146,147和149。
类似地，在一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR1，如表A的抗体7,55,103和151。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR2，如表A的抗体10,58,106和154。在又一个实施方案中，本发明的抗体可以包含重链CDR3，如表A的抗体12,60,108和156。在备选的一个实施方案中，本发明的抗体可以包含2种或3种重链CDR的组合，如表A的抗体8,9,11,56,57,59,104,105,107,152,153和155。
或者，本发明的抗体可以包含一种或多种轻链CDR和一种或多种重链CDR，如表A的抗体13-48,61-96,109-144和157-192。
表A
Figure BDA00003614459600111
Figure BDA00003614459600121
Figure BDA00003614459600141
Figure BDA00003614459600151
在各个实施方案中，本发明的抗体是人源化的。例如，在一个实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR2、和氨基酸序列LSP的CDR3，或可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:19的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:20的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:21的CDR3。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR2、和氨基酸序列LSP的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:19的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:20的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:21的CDR3。在一个例示性实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR2、和氨基酸序列LSP的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:20的CDR2、和氨基酸序列SEQ ID NO:21的CDR3。本发明还涵盖SEQ ID NO:17,18,19,20和21的相应核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地测定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子如染色体中以表达本发明的抗体。
在另一个实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:22的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR3，或可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ IDNO:25的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR3。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:22的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR3，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR3。在一个例示性实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR2、和氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR2、和氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR3。本发明还涵盖SEQ ID NO:22,23,24,25,26和27的相应核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地测定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子如染色体中以表达本发明的抗体。
在再一个实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR3，或可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR3。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR3，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR1、具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR2、和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR3。在一个例示性实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR2、和氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR2、和氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR3。本发明还涵盖SEQ ID NO:28,29,30,31,32和33的相应核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地测定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子如染色体中以表达本发明的抗体。
在又一个实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:35的CDR2，和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR3，或可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ IDNO:37的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR2，和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:39的CDR3。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:35的CDR2，和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:37的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR2，和具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:39的CDR3。在一个例示性实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO:35的CDR2，和氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR3，可以包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR2，和氨基酸序列SEQ ID NO:39的CDR3。本发明还涵盖SEQ ID NO:34,35,36,37,38和39的相应核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地测定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子如染色体中以表达本发明的抗体。
在一个方面，将抗体以制药级别中优选的药理学有效量(包括免疫学活性片段)施用给受试者如待治疗Aβ斑块相关症状的活的受试者。使用标准的有效技术实施施用，包括外周地(即不施用到中枢神经***中)或局部地到达中枢神经***。所述外周施用包括但不限于，静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用。包括直接到达中枢神经***(CNS)的局部施用包括但不限于经由腰部(lumbar)、心室内或薄壁组织导管内(intraparenchymal catheter)或使用手术移植的受控释放的制剂。
用于有效施用的药物组合物有意设计为适于所选的施用模式，且药学可接受的赋形剂如相容的分散剂、缓冲物、表面活性剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等如适宜地使用。Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton Pa.,16Ed ISBN:0-912734-04-3，最新版(通过提述完整并入本文)，提供了技术人员一般已知的制剂技术的目录。改变本发现中可用的抗体的溶解度特征从而使它们更亲脂可能是特别有用的，例如通过将其包被于脂质体中或通过封闭极性基团。
通过静脉内或腹膜内或皮下注射的有效外周***性投递是对活的受试者进行施用的优选方法。用于这类注射的合适的媒介物是简单的。然而，另外，还可以经由粘膜通过鼻气雾剂或栓剂实现施用。用于这类施用模式的合适制剂是公知的，且通常包括促进跨膜转移的表面活性剂。这类表面活性剂经常自类固醇衍生或者是阳离子脂质，如N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或各种化合物如胆固醇半琥珀酸酯(hemisuccinate)、磷脂酰甘油等。
待施用的制剂中人源化抗体的浓度为有效量，且范围从低至按重量计约0.1%至按重量计多达约15或约20%，并且主要将基于流体体积、粘度等按照所选的特定施用模式(若期望的话)进行选择。用于注射给活受试者的典型组合物能制备成含有1ml无菌缓冲的磷酸盐缓冲盐水和约1-1000mg任意一种本发现的人源化抗体或其组合。所述制剂在配制后能无菌过滤，或使之微生物性可接受。用于静脉内输注的典型组合物可以具有1-250ml体积的流体(如无菌林格(Ringer)氏溶液)，且抗ApoE抗体浓度为1-100mg每ml或更高。本发现的治疗剂可以冷冻或冻干以储藏并在使用前在适宜的无菌载体中重建。冻干和重建可导致不同程度的抗体活性损失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体倾向比IgG抗体具有更高的活性损失)。施用的剂量是有效剂量且可能必须经调节来补偿。会对所述一般为药物级质量的制剂的pH进行选择以平衡抗体稳定性(化学和物理的)并在施用时使受试者舒适。一般地，耐受4至8的pH。剂量根据接受成功施用的个体的块头、重量、和其它生理生物学特征在个体间变化。
如本文中使用的，术语“有效量”意味着对施用某物质(如化合物)的受试者导致可测量且有益效果(即显著功效)的该物质的量。根据本发现施用的化合物的有效量或剂量会由病例周围情况决定，包括施用的化合物、施用路径、所治疗的症状状态、和类似的受试者和施用情形考虑等。在一个方面，典型剂量含有从约0.01mg/kg至约100mg/kg的本文中描述的抗ApoE抗体。剂量范围可以从约0.05mg/kg至约50mg/kg，更优选地从约0.1mg/kg至约25mg/kg。给药频率可以是每日一次或每周或每月一次、两次、三次或更多次，如有效治疗症状所需要的。
对疾病本身的治疗施用时间安排和治疗持续时间将由该病例相关情况决定。治疗可以立即开始，如由急诊医疗人员在损伤位点施用的。治疗可以在医院或诊所本身开始，或在更晚的时间在出院后或在门诊受试者(outsubject)诊所就医后。治疗持续时间可以从一次性基础上的单剂施用到终生治疗性处理时程。
尽管前述方法对于蛋白质如人源化抗体的施用似乎是最方便的且最适宜和有效的，但通过合适的改变，可以采用其它有效施用技术如心室内施用、透皮施用、和口服施用，只要本文中利用了合适的制剂。
另外，可以期望采用受控释放的制剂，其使用生物可降解膜和基质，或渗透微型泵，或基于右旋糖珠、藻酸盐/酯、或胶原的投递***。
典型剂量水平可以用标准的临床技术测定并优化，并且会取决于施用模式。
下列实施例用于证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应领会，下列实施例中披露的技术代表本发明人所发现的在本发明实践中较好地施行的技术。然而，根据本文公开的信息，本领域技术人员应当领会，可以在所披露的特定实施方案中进行许多改变而仍然获得类似或相似的结果，却不背离本发明的精神和范围，因此在附随实施例和附图中列出或显示的所有内容应解译为例示性的而非限制性的意义。
实施例
下列实施例举例说明本发明的各个方面。
使用杂交瘤技术生成对ApoE蛋白特异性的抗体，如记载于下文实施例1和2的。具体地，生成了4种杂交瘤且从杂交瘤获得ApoE抗体。对杂交瘤HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4已分别指配了ATCC专利保藏名称PTA-11805,PTA-11806,PTA-11807和PTA-11808。
实施例1：杂交瘤的制备
首先，将100μl盐水中的抗原肽(ApoE,1mg/ml)与等体积弗氏(Freund's)完全佐剂混合、乳化并接种至小鼠(Balb/c，6周龄)的背部。2周后，用50μl抗原肽盐水溶液(ApoE,1mg/ml)和弗氏不完全佐剂的混合物(通过超声处理乳化)再次免疫小鼠，然后每周实施额外的免疫。在免疫后40天时，取出脾，将淋巴细胞收获在PRM1640培养基(用青霉素和链霉素补充)中，并用0.17M氯化铵处理以除去红血球细胞。将分离的淋巴细胞与自小鼠骨髓肿瘤衍生的骨髓瘤细胞P3U1株通过聚乙二醇方法融合(PEG4000)以获得杂交瘤细胞。将由此获得的杂交瘤细胞悬浮在具有饲养细胞的HAT培养基中，然后分配到96孔板中并培养15天。
实施例2：单克隆抗体的筛选
从培养实施例1杂交瘤细胞的孔中回收培养上清液，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法选出与抗原肽反应的单克隆抗体。
首先，向96孔板的每个孔加入100μl10μg/ml抗原肽，在4℃过夜维持后固定化至固相并用200μl10%小牛血清于37℃过夜封闭。然后，向每个孔中加入100μl杂交瘤细胞的培养上清液，在37℃反应2小时，然后加入稀释1000倍的偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠抗体，并在37℃反应1小时。使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物显现颜色。
在通过加入100μl4N硫酸终止反应后，测量450至540nm处的吸光度，选出吸光度为约3的单克隆抗体并通过有限稀释方法克隆。
用生成选出的单克隆抗体的杂交瘤细胞腹膜内接种7天和3天前用0.5mlpristine腹膜内注射过的小鼠(Balb/c)，并在约10天后收集腹水。将收集的腹水在室温保持30分钟，4℃过夜，并以15,000x rpm离心10分钟，然后回收上清液。
通过ELISA方法测量所选择的单克隆抗体的滴度。将ApoE固定于微孔板上，加入单克隆抗体，并在反应后使用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体和TMB显色。结果指示所选单克隆抗体以浓度依赖性方式进行反应。
实施例3:抗apoE抗体导致斑块负荷的降低
使用PS/APP小鼠作为阿尔茨海默氏病的小鼠模型，该小鼠展现出与阿尔茨海默氏病患者中观察到的类似的年龄相关性淀粉样斑块形成。用10mg/kg抗Aβ抗体(HJ3.4)或两种抗ApoE抗体之一(HJ6.2或HJ6.3)每周一次腹膜内处理PS/APP小鼠。将用PBS处理的另一组用作对照。治疗从3-7月龄开始。发现了与Aβ斑块负荷降低有关的抗apoE抗体的强效果，如海马(图1)和皮质(图2)中所示。
实施例4:抗apoE抗体对人apoE的结合
使用ELISA夹心测定法来测量抗apoE HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4抗体对人apoE的结合。在ELISA板上首先包被结合人apoE的单克隆抗体WUE4。然后施加不同浓度的人apoE4。最后施加生物素化的抗apoE抗体HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4，并从板阅读器读出光密度(OD)(图3)。
这些结果显示抗apoE抗体HJ6.1,HJ6.2和HJ6.3在ELISA形式中以递减的效力结合人apoE。然而，抗ApoE抗体HJ6.4在此测定法中不结合人apoE。
实施例5:抗apoE抗体结合血浆中的人apoE但不影响血浆胆固醇
对于这些实验，使用人ApoE4敲入小鼠来测量血浆apoE/抗体复合物。ApoE4敲入小鼠腹膜内接受500微克生物素化的HJ6单克隆抗体。24小时后，稀释血浆(1:1000)并加载至用结合人apoE的5μg/ml WUE4包被的ELISA板。通过1:5000稀释的HRP40检测出ApoE/抗体复合物。在板阅读器上读出光密度(OD)(图4A)。这些结果显示HJ6.1,HJ6.2和HJ6.3抗体结合血浆中的人apoE，而HJ6.4不结合血浆中的人apoE。当在apoE-/-小鼠中实施此实验时未获得信号。
在同样地腹膜内注射了500微克HJ6系列单克隆抗体HJ6.1、HJ6.2、HJ6.3和HJ6.4的apoE4+/+小鼠中还测量血浆总胆固醇。相对于接受磷酸盐缓冲盐水的动物，血浆胆固醇未变化(图4B)。
实施例6：外周施用后在中枢神经***(CNS)中发现的HJ6系列抗人apoE抗体
对接受了HJ6系列单克隆抗体或PBS的ApoE4+/+或ApoE4-/-小鼠的脑脊液(CSF)(见图4)进行稀释(1:23)，并由WUE4捕获CSF中apoE4/生物素化抗体复合物，然后通过HRP40检测。结果显示，CSF中有apoE4与抗apoE抗体HJ6.1B,HJ6.2B或HJ6.3B的复合物(图5)，表明apoE单克隆抗体的一个级分能够进入CNS区室并结合apoE。OD650按照以下次序：HJ6.1B>HJ6.2B=HJ6.3B>HJ6.4B，这与在ELISA板上(图3)和血浆中(图4)对这些抗体结合apoE的能力所看到的模式是一致的。
实施例7：在施用HJ6系列抗体的小鼠中的小胶质细胞活化
将10mg/kg在PBS中稀释的HJ6.2,HJ6.3和HJ3.4抗体或等体积PBS在时间点0、第3天、第6天和第9天经腹膜内注射到PSAPP小鼠中。在第10天时，取出脑，固定并用标记活化的小胶质细胞的抗体CD45染色。在注射HJ6.3和HJ3.4的小鼠中，被活化的小胶质细胞覆盖的皮质的量增加。本实验中的PSAPP小鼠表达小鼠apoE。这些结果显示，在10天内对已经具有淀粉样斑块的6月龄PSAPP小鼠短期施用HJ6.3(抗ApoE抗体)和HJ3.4(抗Aβ抗体)导致小胶质细胞的活化，但有一种抗ApoE抗体(HJ6.2)似乎不具备此效果(图6)。
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Claims (19)

1.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性结合ApoE并且自选自下组的杂交瘤衍生：HJ6.1(ATCC专利保藏名称PT-11805),HJ6.2(ATCC专利保藏名称PT-11806),HJ6.3(ATCC专利保藏名称PT-11807)和HJ6.4(ATCC专利保藏名称PT-11808)。
2.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
3.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体由包含选自下组的核酸序列的核酸序列编码：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。
4.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体选自下组：单链抗体、抗体片段、嵌合抗体、或人源化抗体。
5.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性结合ApoE并且包含重链CDR3，所述重链CDR3包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
6.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性结合ApoE并且包含重链CDR3，所述重链CDR3包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
7.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性结合ApoE并且包含重链CDR3，所述重链CDR3包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
8.一种治疗受试者中Aβ斑块相关症状的至少一种症状或症候的方法，其包括对该受试者施用有效量的至少一种抗ApoE抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述治疗包括预防、减轻、逆转、或改善受试者中Aβ斑块相关症状的至少一种症状或症候。
10.权利要求8的方法，其中Aβ斑块相关症状的症状或症候包括受损的认知功能、改变的行为、异常语言功能、情绪失调(emotional dysregulation)、发作(seizure)、受损的神经***结构或功能、以及形成阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)或脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy)的风险增加。
11.权利要求8的方法，其中所述抗ApoE抗体结合ApoE编码序列内的表位。
12.权利要求8的方法，其中所述施用包括有效的***性施用路径。
13.权利要求8的方法，其中所述施用包括有效的局部施用路径，所述局部施用路径包括直接进入中枢神经***。
14.一种降低受试者脑中的淀粉样斑块负荷的方法，所述方法包括对该受试者施用有效量的至少一种抗ApoE抗体。
15.权利要求14的方法，其中所述抗ApoE抗体结合ApoE编码序列内的表位。
16.权利要求14的方法，其中所述施用包括有效的***性施用路径。
17.权利要求14的方法，其中所述施用包括有效的局部施用路径，所述局部施用路径包括直接进入中枢神经***。
18.权利要求14的方法，其中在海马中所述淀粉样斑块负荷降低。
19.权利要求14的方法，其中在皮质中所述淀粉样斑块负荷降低。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013168174A1 (en) * 2012-05-08 2013-11-14 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Apoe4 antibodies for treatment of neurodegenerative conditions
CA2962969C (en) 2014-09-30 2023-03-21 Washington University Tau kinetic measurements
WO2017192711A1 (en) * 2016-05-03 2017-11-09 University Of South Florida Compositions and methods of modulating abeta protein
US11124562B2 (en) 2016-10-28 2021-09-21 Washington University Anti-ApoE antibodies
AU2018304173A1 (en) 2017-07-17 2020-01-30 Janssen Biotech, Inc. Antigen binding regions against fibronectin type III domains and methods of using the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1092525A (zh) * 1992-10-13 1994-09-21 杜克大学 早老性痴呆的检测方法
CN1890266A (zh) * 2003-11-28 2007-01-03 阿斯特拉曾尼卡有限公司 抗体
WO2007098417A2 (en) * 2006-02-21 2007-08-30 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of alzheimer's disease with inhibitors of apoe binding to apoe receptor
WO2011109246A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 The J. David Gladstone Institutes Antibody specific for apolipoprotein and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005094846A1 (ja) * 2004-03-30 2008-02-14 株式会社レノメディクス研究所 プリオン病治療剤およびその製造方法
US20100111852A1 (en) * 2006-12-14 2010-05-06 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin 3 Monoclonal Antibody and Treatment and Diagnosis of Cancer Using the Same
CL2008002775A1 (es) * 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1092525A (zh) * 1992-10-13 1994-09-21 杜克大学 早老性痴呆的检测方法
CN1890266A (zh) * 2003-11-28 2007-01-03 阿斯特拉曾尼卡有限公司 抗体
WO2007098417A2 (en) * 2006-02-21 2007-08-30 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of alzheimer's disease with inhibitors of apoe binding to apoe receptor
WO2011109246A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 The J. David Gladstone Institutes Antibody specific for apolipoprotein and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张芃等: "ApoE抗体阻断ApoE/Aβ1-42结合并减少Aβ1-42聚集、纤维化作用的研究", 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 *

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