发明内容
本发明涉及一种从甘草中同步分离甘草有效成分,即黄酮类、三萜类和/或多糖类的新方法,本发明可以通过以下技术方案实现:
第一项.一种同步分离甘草有效成分的方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1、将含有甘草总三萜、甘草总黄酮和/或甘草总多糖的甘草生物质材料,加入提取溶剂,采用温浸、渗漉、煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种方法提取,其中的提取溶剂为能够溶解甘草三萜、甘草黄酮和/或甘草多糖的试剂,优选A.碱性水溶液,优选溶液pH10-14;B.碱性甲醇溶液,优选混合溶液pH10-14;C.碱性乙醇溶液,优选混合溶液pH10-14,其中调解提取溶剂为碱性的试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水;D.水;E.甲醇与水的混合物,优选混合物中甲醇含量10~70wt%;F.乙醇与水的混合物,优选混合物中乙醇含量10~60wt%;G:丙酮与水的混合物,优选的混合物中丙酮含量10~50wt%;
步骤2、向含有甘草提取物的溶液中加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH6-8,体系静置分层为有机相和水相,其中含有甘草提取物的溶液指的是同时含有甘草黄酮、甘草三萜和甘草多糖的水溶液,有机试剂指的是易溶解三萜和黄酮而不易溶解多糖,优选正丁醇和/或乙酸乙酯,调节体系pH的试剂为能够影响体系pH的物质,碱性试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
申请人研究发现(参见图1),以正丁醇为有机溶剂通过调节pH进行萃取时,当pH大于等于9时,不仅在有机相中含有黄酮,在水相中也出现了很多黄酮类成分,当pH小于等于8时,黄酮类成分主要集中在有机相,在水相中骤然减少,当pH小于等于7.5时,水相中含很少量的黄酮,随着pH的减小,甘草黄酮在有机相中的含量(含有甘草黄酮的质量,不是指纯度)没有明显的变化,在水相中含微量的黄酮;而三萜类成分和糖类等水溶性成分在pH大于等于6.0时大部分在水相,当pH小于6.0时,三萜类成分逐渐分布在有机相,不能与黄酮类成分分开,由此可见,pH值对于分离黄酮的得率、纯度以及甘草三萜的得率、纯度具有重要的影响,即可以通过调解体系pH值,从而使得甘草黄酮在水相中的含量大大降低,这样不仅仅可以提高甘草黄酮的得率,也可以使得水相中甘草三萜的纯度有较大程度的提高。由此可见,为了获得纯度和得率更高的三萜和黄酮,调整获得更为合适的pH很有必要,基于此发现,步骤1中将pH调整为6-8,优选6.5-7.5,更优选pH7.0;
所述步骤2中加有机试剂并调节体系pH后静置分层,而专利CN1827613A用溶剂萃取法从甘草中分离甘草黄酮,发明人提出甘草浸取液用酸碱调节至5-9,然后用有机溶剂萃取,静置或离心分层,但经过本专利申请人的研究发现(具体实例参见图2),尽管离心分层也会具有较好的分离效果,但萃取后体系分层优选静置,如果采用离心操作,会有部分黄酮类成分经离心沉降到下层水相,图2的薄层板为经过离心操作,转数4000,离心2分钟,图2(其中图1与图2,水相的上样量相同)中显示仅离心2分钟甘草苷(黄酮类)在pH9-1范围内在水相中均有分布,说明离心会对分离效果有很大的影响;而经过静置分层后,黄酮类成分基本上能够完全的进入有机相(见图1),因此,分层时,考虑到分层效果以及时间成本,优选静置12小时以上,更优选静置18小时以上,最优选24小时。
所述步骤2中调节体系pH加酸还是加碱,要看提取时加碱调节的pH,发明人通过研究发现,如果提取时调节溶剂pH等于12,时,提取出的溶剂经浓缩后再加水调整后的水溶液的pH在7左右,此时萃取时直接加有机溶剂萃取,不需要加任何酸碱调节试剂,可以更好的节约酸碱调解试剂。如果提取时溶剂调节pH大于12时,萃取时需加酸调节合适的pH,如果提取时溶剂调节pH小于12时,萃取时需加碱调节适合的pH;
步骤3、分离步骤2中的有机相和水相,甘草总黄酮类成分在有机相;
步骤4、将步骤3中的水相,加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH小于4大于1,优选范围pH2.5-3.5,更优选pH3.0,体系分层为有机相和水相,其中pH调节试剂为能够影响pH的物质,优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
申请人注意到,现有技术中CN1803789A,公开了一种将甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖分离开的方法,并且也取得很好的分离效果,但本申请与CN1803789A的思路有较大的差异,CN1803789A在分离黄酮时没有调节pH的步骤,在分离甘草酸和甘草三萜时,先醇沉甘草多糖,再酸沉甘草酸,最后采用了水或酸水对沉淀进行了洗涤。申请人研究发现,采用另外的方法,即通过添加有机溶剂进行萃取,同时调节pH,也可以将甘草三萜和甘草多糖分离开来,其中与CN1803789A中甘草酸酸沉相比,本申请中的甘草三萜却溶于了有机相中,并且也不需要将pH调得过低(因为pH过低,不仅仅浪费pH调节试剂,更会造成三萜、黄酮和多糖的水解,见图1,当pH等于1时有机相中出现了水解后新产生的三萜化合物,次级黄酮和黄酮苷元增加,以及水相中产生水解的次级糖),并且所获得的甘草三萜不经过洗涤也能够达到较高的纯度,将甘草总三萜与甘草总多糖充分分离之后,不仅提高了甘草总三萜的得率,重要的是甘草总多糖的纯度大大提高。由此可见,为了获得纯度和得率更高的甘草总三萜和甘草总多糖,调整获得更为合适的pH很有必要,基于此发现,将pH调整为小于4大于1,优选范围2.5-3.5;更优选PH3。
步骤5、分离步骤3中的有机相和水相,有机相为甘草总三萜类成分,水相为含有甘草总多糖的水溶性成分;
步骤6、步骤5中分离出的水层含有的成分较杂,分离其中的多糖类成分,首先将水层所含蛋白质除掉,优选的方法是,先用sevag法除蛋白质等杂质,再用有机试剂沉淀得甘草多糖,沉淀试剂包括能够沉淀多糖的各种试剂,优选乙醇,更优选的通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60~80%。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤1中含有甘草提取物的提取液的制备方法为:将含有甘草三萜、甘草黄酮和甘草多糖的甘草属植物,包括根、根茎、茎、叶、花和/或果实,优选根和/或根茎,或含有甘草三萜、甘草黄酮和甘草多糖的市售商品材料,包括甘草药材、甘草膏、甘草制剂,采用温浸、渗漉、煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种方法提取;优选料液比w/v(g/ml)为1:5~1:10;优选提取次数1~3次;优选提取时间每次0.5~1.5小时;优选多次提取时将提取液合并。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤1提取甘草提取物时所用溶剂为以下溶剂中的任一种:优选A.碱性水溶液,优选溶液pH10-14;B.碱性甲醇溶液,优选混合溶液pH10-14;C.碱性乙醇溶液,优选混合溶液pH10-14,其中调解提取溶剂为碱性的试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水;D.水;E.甲醇与水的混合物,优选混合物中甲醇含量10~70wt%;F.乙醇与水的混合物,优选混合物中乙醇含量10~60wt%;G:丙酮与水的混合物,优选的混合物中丙酮含量10~50wt%。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤1中甘草提取液优选浓缩液,更优选的浓缩液为不残留有机试剂,浓缩方法包括但不限于以下方法中的一种或几种方法联合使用,A.常压加热浓缩,B.减压加热浓缩,C.冷冻干燥浓缩,D.喷雾加热干燥浓缩;优选浓缩液比重1.05~1.20(20℃)。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:提取甘草总提取物的步骤1不是必须的,如果是购买的商品甘草提取物,如商品甘草膏,此步骤可省略。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤2中的有机试剂指的是能与水分层的试剂,优选易溶解甘草三萜和甘草黄酮而不易溶解甘草多糖的有机试剂,更优选正丁醇、乙酸乙酯。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤2中的pH调节试剂能够影响pH的物质,碱性物质,优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤6中用有机试剂沉淀多糖后离心或静置,优选静置,优选的静置时间为10~24小时;优选的静置时温度为4~20℃。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤6中沉淀的多糖需要分离,分离方式为自然过滤、真空抽滤、超滤、离心或连续流离心分离中的任何一种或几种但不限于以上方法,优选离心、连续流离心或真空抽滤。
所述分离甘草有效成分的方法,其特征在于:步骤3中分离出的有机相和步骤5中分离出的有机相和步骤6中沉淀的多糖分别进行干燥或不进行干燥,优选干燥;干燥方法为自然干燥、减压干燥、冷冻干燥或喷雾干燥等方法中的任何一种或多种方法联合使用,但不限于以上方法。
第2项.一种分离甘草总黄酮的方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1、将含有甘草提取物的提取液,加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH6-8,分层为有机相和水相,其中含有甘草提取物的提取液指的是含有甘草黄酮的水溶液,有机试剂指的是能与水分层的有机溶剂,优选正丁醇和乙酸乙酯,调节体系pH的试剂为能够影响体系pH的物质,碱性试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤2、分离步骤1中的有机相和水相,甘草黄酮类成分包含于有机相,对有机相经过或不经过干燥处理。
第3项.一种分离甘草总多糖的方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1、将含有甘草提取物的提取液,加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH6-8,分层为有机相和水相,其中含有甘草提取物的提取液指的是含有甘草多糖的水溶液,有机试剂指的是能与水分层的有机溶剂,优选正丁醇和乙酸乙酯,调节体系pH的试剂为能够影响体系pH的物质,碱性试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤2、分离步骤1中的有机相和水相,甘草总多糖类成分包含于水相;
步骤3、将步骤2中的水相,加入有机试剂,调节体系pH小于4大于1,优选范围pH2.5-3.5,体系分层为有机相和水相,水相为含糖类等水溶性成分,其中pH调节试剂为能够影响pH的物质,优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤4、由于步骤3中分离出的水相含有的成分较杂,分离其中的多糖类成分,首先将水相所含蛋白质除掉,优选的方法是,先用sevag法除蛋白质等杂质;再用有机试剂沉淀得甘草多糖,沉淀试剂包括能够沉淀多糖的各种试剂,优选乙醇,更优选的通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60~80%;有机试剂沉淀多糖后离心或静置,优选静置,优选的静置时间为10~24小时;优选的静置时温度为4~20℃;
步骤5、对沉淀的多糖经过或不经过干燥处理。
第4项.一种分离甘草总三萜的方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1、将含有甘草提取物的提取液,加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH6-8,分层为有机相和水相,其中含有甘草提取物的提取液指的是含有甘草多糖的水溶液,有机试剂指的是能与水分层的有机溶剂,优选正丁醇和乙酸乙酯,调节体系pH的试剂为能够影响体系pH的物质,碱性试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤2、分离步骤1中的有机相和水相,甘草三萜类成分包含在水相;
步骤3、将步骤2中的水相,加入有机试剂,调节体系pH小于4大于1,优选范围pH2.5-3.5,体系分层为有机相和水相,甘草三萜类成分在有机相,其中pH调节试剂为能够影响pH的物质,优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤4、分离步骤3中的有机相,经过干燥或不干燥处理。
第5项.一种同步分离甘草总黄酮、甘草总三萜和甘草总多糖的方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1、获得含有甘草提取物的提取液,其中含有甘草提取物的提取液指的是同时含有甘草黄酮、甘草三萜和甘草多糖的水溶液;
含有甘草提取物的提取液制作方法为:将甘草属生物质材料,经切片或不经切片后,采用温浸、渗漉、煎煮、回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种提取,提取1~3次,每次0.5~2小时,优选多次提取时将提取液合并,其中甘草属生物质材料为含有甘草总黄酮、甘草总三萜和甘草总多糖的甘草属植物,优选甘草(Glycyrrhiza uralensis Fish.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflataBat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)中的一种或多种的根和/或茎;提取时所用溶剂为以下溶剂中的任一种:优选A.碱性水溶液,优选溶液pH10-14;B.碱性甲醇溶液,优选混合溶液pH10-14;C.碱性乙醇溶液,优选混合溶液pH10-14,其中调解提取溶剂为碱性的试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水;D.水;E.甲醇与水的混合物,优选混合物中甲醇含量10~70wt%;F.乙醇与水的混合物,优选混合物中乙醇含量10~60wt%;G:丙酮与水的混合物,优选的混合物中丙酮含量10~50wt%;
步骤1a、将步骤1中的含有甘草提取物的溶液进行减压浓缩,浓缩液密度20℃比重1.05~1.20;
步骤2、将步骤1a中的浓缩液加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH6-8,分层为有机相和水相,有机试剂指的是能与水分层的有机溶剂,优选正丁醇和乙酸乙酯,调节体系pH的试剂为能够影响体系pH的物质,碱性试剂优选氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、碳酸钠、氨水,酸性试剂优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤3、分离步骤2中的有机相和水相,其中有机相为甘草黄酮、水相含有甘草三萜和甘草多糖;
步骤4、将步骤3中的水相加入有机试剂,再加调节试剂使体系pH小于4大于1,优选范围pH2.5-3.5,体系分层为有机相和水相,其中pH调节试剂为能够影响pH的物质,优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸;
步骤5、分离步骤4中的有机相和水相,甘草三萜类成分在有机相,糖类等水溶性成分在水相;
步骤6、由于水相中含有的成分较杂,先用sevag法去除水层中含有的蛋白质杂质,再通过加95%乙醇或无水乙醇使含有甘草多糖类成分的水层中的乙醇浓度达到60~80%,静止10~24小时,最后获得不溶性成分,即为甘草多糖成分;
步骤7、对步骤3、步骤5中分离出的有机相和步骤6中沉淀的多糖经过干燥处理。
有益效果
1、本发明充分利用甘草黄酮和甘草三萜类成分本身具有酸性结构,易溶于碱性溶剂的特点,先用碱性溶剂提取,可以提高甘草总黄酮和甘草总三萜的提取率。
2、使用有机溶剂萃取分离时,调节体系pH为碱性所用试剂用量少,尤其用pH12的溶剂提取时,浓缩液pH已达到最适范围6-8,不需要再加碱酸调节体系pH,方法简便,试剂用量少。
3、仅用调节体系pH值,可使甘草提取物中的主要活性成分即黄酮类、三萜类和/或多糖类成分同步分离,在最适pH下,甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的收率和纯度都很高。
4、甘草中三大类活性成分在一条生产线上被分离开来,避免了单一成分提取分离造成其它有效成分损失,即便含量很少的成分也不会损失,大大提高了甘草的综合利用度。
5、溶剂可重复使用,能耗低,成本低,适于工业化生产。