CN102552371B

CN102552371B - 一种绞股蓝叶提取物及其制备***药物的用途

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Publication number: CN102552371B
Application number: CN2012100114821A
Authority: CN
Inventors: 朴香兰
Original assignee: Minzu University of China
Current assignee: Minzu University of China
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-01-16
Also published as: CN102552371A

Abstract

本发明涉及一种富含达木林A、达木林B、gypenoside L和gypenoside LI的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)叶提取物，该提取物的制备方法，以及该提取物和这4种皂苷类化合物在制备***药物中的用途，所述的癌症选自：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或白血病。

Description

一种绞股蓝叶提取物及其制备***药物的用途

技术领域

本发明涉及一种富含达木林A、达木林B、gypenoside L和gypenoside LI的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)叶提取物，该提取物的制备方法，以及该提取物和这4种皂苷类化合物在制备***药物中的用途。

背景技术

绞股蓝为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的全草^[1]，具有清热解毒，止咳祛痰功能。又称“七叶胆”、“蛇王”、“甘茶蔓”、“公罗锅底”、“小苦药”等。《本草纲目》中对绞股蓝有如下记载“五叶藤治疮疖、虫咬、凉血解毒、利小便”。由于绞股蓝含有与人参相似的达玛烷类皂苷，又被冠予“南方人参”、“第二人参”的美誉^[2][5-7]，此外，绞股蓝还含有多糖类^[3，4]、黄酮类成分^[8]、氨基酸^[9]、无机盐^[10]等。现代药理学表明，绞股蓝具有抗癌作用、抗氧化作用、降血糖作用^[11]、降血脂作用^[11，12]、增强免疫作用等。国内主要是生长在长江以南，中国的陕西，云南，湖北，湖南，广东，广西，福建等地。目前国内有绞股蓝茶、绞股蓝浓缩汁、绞股蓝龙须茶、富硒养生茶等多个系列产品。

绞股蓝中最主要的药效成分是皂苷类成分。研究表明，人参属植物中抗癌活性与低极性、稀有或微量人参皂苷直接相关，如稀有人参皂苷Rh2、Rg3、Rb3等药效更为珍贵，在某些难治性疾病肿瘤治疗方面显示独特的疗效^[13，14]。但是在天然植物中人参皂苷Rb1含量较高，而Rg3、Rh2、Compand K等含量甚微。对于有些有较强活性的稀有皂苷，来源有限而且存在于植物内含量较低，用传统的分离方法，不但需要大量的药用资源，而且得率也低。因此，如何提高稀有活性成分的含量或获得更有活性的成分成为现代药学研究的重点。

利用高温高压方法，绞股蓝热处理产物与原植物相比，具有更强的抗肿瘤活性。热加工后的绞股蓝提取物为抗癌药提供理论依据。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的在于提出一种富含达木林A(damulin A)、达木林B(damulan B)、gypenosideL和gypenoside LI的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)叶提取物，该提取物的制备方法，以及该提取物和这4种皂苷类化合物在制备***药物中的用途。

本发明的绞股蓝叶提取物的制备方法如下：

取绞股蓝叶在80-140℃、0.08-0.50MPa的高温高压条件进行热处理1-10小时，将处理后的绞股蓝叶用3-12倍量(v/w，mL/g)的50％-95％乙醇回流提取1-5次，每次1-10h。将热处理绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝叶热处理产物醇提物。

优选的提取方法如下：

取绞股蓝叶在125℃、0.24MPa的高温高压条件进行热处理3小时，将处理后的绞股蓝叶用8倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇回流提取3次，每次2h。将热处理绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝叶热处理产物醇提物。

本发明通过NMR及LC/MS技术手段，根据文献，鉴定了所制备的绞股蓝叶提取物中的4个有效成分：达木林A(damulin A)、达木林B(damulan B)、gypenoside L和gypenoside LI。并HPLC-MS分析方法，对该提取物中的各有效成分进行了含量测定。其中：

所述的化合物占绞股蓝叶提取物的重量比为：damulin A不少于14mg/g、damulin B不少于5mg/g、gypenoside L不少于3mg/g、gypenoside LI不少于2mg/g。

优选，所述的化合物占绞股蓝叶提取物的重量比为：damulin A不少于18mg/g、damulinB不少于5.5mg/g、gypenoside L不少于5mg/g、gypenoside LI不少于2.5mg/g。

更为优选，所述的化合物占绞股蓝叶提取物的重量比为：damulin A 18-30mg/g、damulinB 5.5-30mg/g、gypenoside L 5-20mg/g、gypenoside LI 2.5-10mg/g。

所述绞股蓝叶提取物中有效成分的分离及鉴定如下：

用2倍树脂床体积(2BV)的乙醇，以2BV/h的流速通过HP-20大孔树脂层，并保持液面高度，浸泡过夜。用乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止。取乙醇洗脱液适量，在200-400nm范围内扫描紫外图谱，在250nm左右无明显紫外吸收。用去离子水以2BV/h的流速通过树脂层，洗净乙醇。用2BV 4％的HCl溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性(pH试纸检测pH＝7)。用2.5BV4％的NaOH溶液，以5BV/h的流速通过树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性(pH试纸检测pH＝7)。

将绞股蓝热处理产物醇提物用水超声混悬倒入大孔树脂HP20中，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡、吸附过夜。洗脱流速为2BV/h，分别用20％，50％，75％，95％，100％乙醇醇溶液洗脱。

对上述95％乙醇洗脱液进行硅胶柱色谱法、反相C18色谱法，分离得到4个化合物，用NMR及LC/MS技术手段，根据文献，最终被鉴定为绞股蓝皂苷gypenosdie L、gypenoside LI、达木林A、达木林B(表1、图1、图2)。

表1绞股蓝热处理产物有效成分的核磁共振谱数据

本发明所述的化合物结构式如下：

我们还发现，本发明制备得到的绞股蓝叶热处理产物醇提物以及达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI对于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和白血病细胞均具有较强的抑制作用，因此，本发明还提供该绞股蓝叶提取物和这4种皂苷类化合物在制备***药物中的用途。

附图说明

图1绞股蓝叶醇提物(A)与绞股蓝叶热处理产物醇提物(本发明绞股蓝叶提取物)(B)的高效液相色谱

图2绞股蓝叶热处理产物中的皂苷类化合物达木林A(A)、达木林B(B)、gypenoside L(C)、gypenoside LI(D)的LC-MS图谱

具体实施方式

实施例1提取物的制备实验

我们比较了几种不同的制备方法制备得到的提取物，并测定了其中达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI四个化合物的含量。结果如下：

1、绞股蓝醇提物的制备

取绞股蓝叶用8倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇回流提取3次，每次2h。将绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝醇提物。

2、绞股蓝叶醇提物的热处理产物的制备

取绞股蓝叶用8倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇回流提取3次，每次2h，浓缩，浓缩液在125℃、0.24MPa的高温高压条件进行热处理3小时，干燥得到绞股蓝叶醇提物的热处理产物。

3、绞股蓝叶的热处理产物醇提物的制备(本发明制备的绞股蓝叶提取物)

4、阳性对照组人参热处理产物提取物的制备

取人参在125℃、0.24MPa的高温高压条件进行热处理3小时，将处理后的人参用8倍量(v/w)的80％乙醇回流提取3次，每次2h。将热处理人参的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到人参热处理产物的提取物。

利用HPLC-MS分析方法，对绞股蓝叶醇提物、绞股蓝叶醇提物热处理产物、绞股蓝叶热处理产物醇提物进行含量测定。

表2不同提取物中达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI的含量

^*N.D.：在HPLC-UV、LC-SIR/MS、LC-MRM/MS基本检测不到。

结果表明，如表2所示，绞股蓝叶热处理产物醇提物(本发明制备的绞股蓝叶提取物)中绞股蓝皂苷达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI的含量最高。尤其是，虽然第3种方法制得的提取物与第2种方法制得的提取物相比，仅仅是热处理和醇提取顺序的不同，但是热处理产物提取物的各个有效成分含量都高于后者，经统计学分析，该差异具有显著性，产生了预料不到的技术效果。另外，阳性对照组人参热处理产物提取物中均未检测出这4种有效成分。

实施例2抗肿瘤效果实验

1、细胞系及细胞培养

人肺癌细胞A549、人胃癌细胞MKN45、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、白血病细胞HL-60，以含10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、饱和湿度下、5.0％CO₂的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长。实验取对数生长期细胞。

2、MTT法药物敏感性试验

消化收集对数生长期细胞并调整成浓度约为1*10⁵/mL的单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，待细胞贴壁后加不含胎牛血清的DMEM培养液配制的各提取物，此外，实验还设含DMEM全培养基的空白对照组和人参热处理产物提取物与人参皂苷Rg3的阳性对照组，含1％DMSO阴性对照组。每一浓度设6个复孔，继续培养48h后，每孔加MTT 20μL于37℃、5％CO2培养箱孵育4h，弃上清后每孔加DMSO150μL，振摇10min。酶标仪于490nm波长处检测吸光度值。采用excel统计分析。

1)实验材料及仪器

培养基：DMEM培养基(GIBCO，USA)(含青霉素100kU/L，pH7.4)；

FBS(GIBCO，USA)；

消化液(O.05％胰酶，0.02％EDTA)(协和细胞资源中心)；

二甲基亚砜(DMSO)：购自SIGMA(USA)；

噻唑兰(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：购自(AMRESCO，USA)；

25mL培养瓶；

倒置相差显微镜；

细胞培养箱(Thermo Forma，USA)；

酶标仪。

2)实验方法

人肺癌细胞A549、人胃癌细胞MKN45、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、白血病细胞HL-60等的抑制活性测定采用MTT法。

3)供试样品

绞股蓝叶醇提物、绞股蓝叶醇提物热处理产物、绞股蓝叶热处理产物醇提物(本发明绞股蓝叶提取物)、达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI、阳性对照组人参热处理产物提取物与人参皂苷Rg3。(所述提取物的制备方法与实施例1提供的各提取物的制备方法相同)

4)实验结果

对人肺癌细胞A549、人胃癌细胞MKN45、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、白血病细胞HL-60等的抑制活性测定，结果表明，如表3所示，绞股蓝热处理产物醇提物具有很强的抑制作用。

表3各提取物的癌细胞抑制活性测定结果

本发明绞股蓝热处理产物醇提物中分离得到的4个化合物，即达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI与阳性对照组人参皂苷Rg3进行癌细胞抑制活性检测，结果表明，达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI对肺癌细胞A549、人胃癌细胞MKN45、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、白血病细胞HL-60均具有很强的抑制作用。

表4绞股蓝热处理产物醇提物分离得到的皂苷类化合物对癌细胞株的IC₅₀值

实验结果表明，本发明绞股蓝叶热处理产物醇提物及其分离得到的达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI具有抑制癌细胞活性。

Claims

1.一种绞股蓝叶提取物，其特征在于，所述的绞股蓝叶提取物的制备方法包括以下步骤：取绞股蓝叶在125-140℃、0.24-0.50MPa的高温高压条件进行热处理1-10小时，将处理后的绞股蓝叶用3-8倍量的50％-95％乙醇回流提取1-5次，每次1-10h，将热处理绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝叶提取物；所述的提取物中含有以下化合物，且化合物占绞股蓝叶提取物的重量比为：damulin A18-30mg/g、damulin B5.5-30mg/g、gypenoside L5-20mg/g、gypenoside LI2.5-10mg/g；所述提取物中化合物的结构式如下：

2.如权利要求1所述的绞股蓝叶提取物，其特征在于，所述的绞股蓝叶提取物的制备方法包括以下步骤：取绞股蓝叶在125℃、0.24MPa的高温高压条件进行热处理3小时，将处理后的绞股蓝叶用8倍量的80％乙醇回流提取3次，每次2h，将热处理绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝叶提取物。

3.权利要求1所述的绞股蓝叶提取物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：取绞股蓝叶在125-140℃、0.24-0.50MPa的高温高压条件进行热处理3-10小时，将处理后的绞股蓝叶用3-8倍量的50％-95％乙醇回流提取1-5次，每次1-10h，将热处理绞股蓝叶的乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝叶提取物。

4.权利要求1或2所述的绞股蓝叶提取物在制备治疗癌症药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的癌症选自：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或白血病。