CN103328498A - 新的o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其变体，和使用其转化甲硫氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新的蛋白质、其变体蛋白、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体、通过该重组载体转化的微生物，和使用该蛋白生产甲硫氨酸或乙酸的方法。本发明的生产方法与现有的方法相比，通过具有更高的转化率和降低的反应时间，而具有经济地生产L-甲硫氨酸和乙酸的优势，并且当使用变体蛋白时，通过使注入的酶匀浆的量最小化，其可容易地以高产率生产L-甲硫氨酸和乙酸。

Description

新的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其变体,和使用其转化甲硫氨酸的方法
技术领域
本发明涉及具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新的蛋白质、其突变体蛋白、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体、用该重组载体转化的微生物和使用该蛋白质生产甲硫氨酸或乙酸的方法。
背景技术
体内的一种必需氨基酸L-甲硫氨酸包含在大部分蛋白中并且以游离状态存在于为调味剂之一的酱油中。其广泛地用作饲料和食品添加剂，和也用作医用的大输液或合成药品的原料。甲硫氨酸是参与体内甲基转移反应的重要氨基酸。首先，通过与ATP反应，甲硫氨酸被转化成δ-腺苷甲硫氨酸，其接着为各种受体提供甲基基团；并且其接着经高半胱氨酸和胱硫醚转化成半胱氨酸。红色面包霉从半胱氨酸合成甲硫氨酸。发酵食品比如酱油或干酪的气味通常是由于源自甲硫氨酸的醛、醇和/或酯。
而且，甲硫氨酸用作化合物比如胆碱、卵磷脂和肌酸的前体，并且用作合成半胱氨酸与牛磺酸和用作硫供体的原料。另外，甲硫氨酸与大脑中的各种神经递质的合成相关。甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)抑制体内肝脏和动脉中脂肪的积累，并且起多种作用，比如减轻抑郁症、炎症、肝脏疾病和肌肉痛。而且，甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸提供多种功能，比如抑制肝脏和动脉中的脂肪沉积，其促进脂肪代谢；增加大脑、心脏和肾脏中的血流循环；刺激消化；促进有毒物质的解毒和***；和促进重金属比如铅的***。已经报道800至1,600mg甲硫氨酸的日摄取量展现卓越的抗抑郁效果；具有肝脏疾病，尤其酒精引起的肝脏疾病患者的肝脏功能的改善；骨关节疾病中极好的抗炎症作用；和刺激骨关节疾病中关节恢复。而且，作为头发的必需营养，已知甲硫氨酸为脆发提供营养，预防脱发。
对于甲硫氨酸的化学合成，最常见地，通过水解5-(β-甲基巯乙基)-乙内酰脲生产L-甲硫氨酸。然而，当通过这种化学合成方法生产甲硫氨酸时，具有生产混合形式的L-型和D-型的缺点。就此而言，有专利公开了使用生物学方法使得选择性生产L-甲硫氨酸的技术(WO2008/013432)。简称为两步方法的该方法包括通过发酵生产L-甲硫氨酸前体的工艺和通过使用酶将L-甲硫氨酸前体转化成L-甲硫氨酸的工艺。L-甲硫氨酸前体类型优选地包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。该两步方法的发展解决了所有现有的问题，比如对硫化物特异的底物的毒性；菌株中通过甲硫氨酸和SAM的反馈控制；和对胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶特异性的中间产物的分解。而且，仅仅选择性生产L-甲硫氨酸的该方法优于同时生产D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸二者的传统化学合成方法，并且通过相同的反应，该方法可另外地生产有机酸，更具体地，琥珀酸和乙酸，作为副产物。
两步方法中的酶转化方法采用具有胱硫醚γ合酶活性、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶活性或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶，并且通过L-甲硫氨酸的前体——O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸与甲硫醇的酶反应生产L-甲硫氨酸和有机酸。
在从L-甲硫氨酸的前体O-乙酰高丝氨酸生产L-甲硫氨酸的酶转化反应中，可使用各种微生物源的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。然而，为了用作工业转变酶，酶需要满足数个要求以使成本效益最大化。首先，酶应当具有高活性和高转化率的特性，并且其过表达在大肠杆菌中应该是可能的。一般而言，对于使用纯化酶的反应，酶的活性、反应速度和对底物的高亲和力是必要的。但是，如果酶匀浆直接添加至反应，则除了具有高活性之外，每单位细胞的酶的过表达应当是可能的，以便用最小量的匀浆进行反应。第二，酶需要与高浓度的O-乙酰高丝氨酸保持高的反应速度，并且其活性的抑制应当低，这即使在终产物L-甲硫氨酸和乙酸积聚至高浓度时。最后，酶应当具有热稳定性，以在1小时至5小时长的反应期间保持其活性。考虑上述要求，之前公开的源自海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶是极好的酶，但是为了使得生产甲硫氨酸的两步法的商业价值最大化，有必要探究具有增强的三种特性的酶。
发明内容
技术问题
本发明人已经从各种微生物来源获得了O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶基因，并且通过实验最终选择来自类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶基因。接着在转化反应中使用酶之后，发明人已经发现来自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶是在生产甲硫氨酸的两步方法中使用的经济上可行的转变酶，并且也确认通过诱导突变改进酶可增强转变酶的经济生存能力，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新的蛋白质。
本发明的另一目的是提供编码该新的蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的突变体蛋白。
本发明的另一目的是提供编码该突变体蛋白的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供包括该多核苷酸的重组载体。
本发明的另一目的是提供用该重组载体转化的微生物。
本发明的另一目的是提供使用该蛋白质或生产其的微生物从前体O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇生产甲硫氨酸或乙酸的方法。
有利效果
本发明提供具有源自类球红细菌的从底物甲硫醇(CH3SH)生产L-甲硫氨酸和乙酸需要的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质。如果使用该蛋白质，其与使用具有来自海王生丝单胞菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质的现有方法相比，具有通过具有更高的转化率和减少的反应时间经济地生产L-甲硫氨酸和乙酸的优势。另外，如果使用具有本发明的增强活性的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的突变体蛋白，则这可使添加的酶匀浆的量最小化，从而容易以高产率生产L-甲硫氨酸和乙酸。
附图说明
图1表示pCL-PCJ1-MetZhne载体的示意图。
图2a和2b显示HPLC结果，表明甲硫氨酸的生产。首先，添加包括蛋白质的微生物(总反应体积的)5-10%的匀浆至O-乙酰高丝氨酸的发酵肉汤，并且通过添加6-8pH的15% Na-甲硫醇启动反应。2小时之后，收集发酵肉汤并且从其去除细胞以分析甲硫氨酸生产。
图3显示在2.5μl、5μl、10μl来自生丝单胞菌属某种(MetZ-hne)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和来自红细菌属(MetZ-rsp)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的细胞匀浆中转变酶表达水平的比较。
图4表明30L间歇反应器中转化反应期间的pH变化。
图5显示30L间歇反应器中转化反应期间O-乙酰高丝氨酸(OAHS)和L-甲硫氨酸(Met)的浓度变化，每个时间添加的甲硫醇(MeSH)的比——设定需要的甲硫醇总量为100%，和每个时间的甲硫氨酸转化率。通过将上至每个时间点生产的甲硫氨酸的总量除以添加的O-乙酰高丝氨酸的总量，计算甲硫氨酸转化率(g/g)%(*甲硫氨酸的转化率，92.59%=以摩尔计的甲硫氨酸转化率，100%)。
最佳模式
一方面，本发明提供具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新的蛋白质。
在本发明中，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质指能够使用L-甲硫氨酸的前体O-乙酰高丝氨酸，和甲硫醇合成L-甲硫氨酸的新的蛋白质。该新的蛋白质优选地是具有来自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质。为了本发明的目的，该新的蛋白质包括非限制性地具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的任何蛋白质，但是其可优选地为SEQ ID No.13的蛋白质。
如本文所使用，术语“O-乙酰高丝氨酸”是分子量为161.16的物质，并且是微生物中甲硫氨酸生物合成中的第一特异性中间体。在肠细菌中，O-琥珀酰高丝氨酸代替O-乙酰高丝氨酸用作中间体，和在高等植物中，O-磷酸高丝氨酸用作中间体。O-乙酰高丝氨酸由L-高丝氨酸和乙酰基-CoA通过高丝氨酸乙酰转移酶催化作用在与苏氨酸生物合成的分叉点产生。
专利公开WO2008/013432公开了使用两步法生产L-甲硫氨酸的工艺，并且在该工艺中，O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸是两种类型的O-酰基高丝氨酸，其是用于生产L-甲硫氨酸的前体。
如本文所使用，术语“前体”指在代谢或生物合成反应中终产物之前的步骤中生产的物质。为了本发明的目的，前体指作为甲硫氨酸特异性的代谢路径一部分的生产L-甲硫氨酸前体的菌株生产的代谢物，或其衍生物。具体地，本发明的L-甲硫氨酸前体指O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸。
能够通过酶转化从L-甲硫氨酸前体中的O-琥珀酰高丝氨酸生产甲硫氨酸的酶包括胱硫醚γ合酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。一般而言，编码胱硫醚γ合酶的基因通常记录为metB，和编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因通常记录为metZ。这些酶具有下列三种活性。
L-半胱氨酸+O-琥珀酰高丝氨酸=>琥珀酸+胱硫醚
硫化物(HS-)+O-琥珀酰高丝氨酸=>琥珀酸+高半胱氨酸
甲硫醇+O-琥珀酰高丝氨酸=>琥珀酸+L-甲硫氨酸
O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶是能够通过使用为另一L-甲硫氨酸前体的O-乙酰高丝氨酸生产L-甲硫氨酸的酶。一般而言，编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因通常记录为metY。该酶具有下列三种活性。
L-半胱氨酸+O-乙酰高丝氨酸=>乙酸+胱硫醚
硫化物(HS-)+O-乙酰高丝氨酸=>乙酸+高半胱氨酸
甲硫醇+O-乙酰高丝氨酸=>乙酸+L-甲硫氨酸
L-甲硫氨酸生产中，使用需要较少碳源比如葡萄糖和原糖用于生产两种L-甲硫氨酸前体的O-乙酰高丝氨酸是更加有成本效益的。然而，尽管为O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的MetZ酶不从其终产物L-甲硫氨酸获得反馈抑制，但为O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的MetY酶被其产物L-甲硫氨酸抑制，并且因此MetY难以在酶反应中使用。
在本发明的一个实施例中，通过测试各种metZ基因的活性，鉴定类球红细菌源的具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的metZ基因，虽然之前预期其是O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。而且，确认类球红细菌源的metZ不获得L-甲硫氨酸的反馈抑制。所选择的具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质可具有SEQ ID No.13的氨基酸序列。
在本发明的一个实施例中，在具有源自生丝单胞菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质中，比较底物特异性、转变酶的表达水平和转变酶的活性。结果，发现当通过使用源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的突变体蛋白生产L-甲硫氨酸时，突变体蛋白显示对于O-乙酰高丝氨酸比O-琥珀酰高丝氨酸更高的底物特异性(表1)，和其也表明在反应早期阶段期间改进的酶活性，改进的反应速度和L-甲硫氨酸转化率(表2)。另外，当在源自两种菌株的重组体突变体蛋白中，比较终产物的抑制水平时，源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶保持L-甲硫氨酸生产的高活性，即使受到其终产物的反馈抑制(表3)。而且，当比较酶相对于反应温度的热稳定性时，与源自生丝单胞菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的突变体蛋白相比，源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶显示卓越的热稳定性(表4)。
所以，本发明具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质满足了用作工业转变酶的所有要求，包括高活性、高转化率、在大肠杆菌中过表达、受到终产物的酶活性的低抑制和在终产物积聚时保持热稳定性的能力，并且因此通过使用本发明的酶，可以以高速度和高效力生产L-甲硫氨酸和乙酸。
另一方面，本发明提供比野生型具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的突变体蛋白。
如本文所使用，术语“突变”或“突变体蛋白”指表现单个稳定遗传或非遗传表型改变的培养物或个体。本发明中，突变体蛋白优选地指由于编码源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因的一个或多个的突变而活性相比野生型增加的蛋白质。突变体蛋白的序列可包括与野生型的序列具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的蛋白序列。优选地，蛋白可以是通过突变具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的突变体蛋白，其中自由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的N-末端的第三位氨基酸被异亮氨酸之外的氨基酸替换，自所述蛋白质的N-末端的第65位氨基酸被苯丙氨酸之外的氨基酸替换，和自所述蛋白质的N-末端的第104位氨基酸被缬氨酸之外的氨基酸替换，或作出三种类型的氨基酸突变的一种或多种的组合。更优选地，可组合两种或更多种和甚至更优选地三种类型的突变。甚至更优选地，蛋白可以是其中自N-末端的第三位氨基酸异亮氨酸被天冬酰胺替换，和第65位氨基酸苯丙氨酸被酪氨酸替换，和第104位氨基酸缬氨酸被丙氨酸替换的突变体蛋白。突变体蛋白的氨基酸序列可优选地是具有SEQ ID Nos.15、16、17或18的氨基酸序列的突变体蛋白。
具体地，由SEQ ID No.15的氨基酸序列表示的突变体蛋白是由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的变体形式，其中自其N-末端的第三位氨基酸异亮氨酸被天冬酰胺替换。
由SEQ ID No.16的氨基酸序列表示的突变体蛋白具有酪氨酸对苯丙氨酸的替换，所述苯丙氨酸是自由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的N-末端的第65位氨基酸。
由SEQ ID No.17的氨基酸序列表示的突变体蛋白具有丙氨酸对缬氨酸的替换，所述缬氨酸是自由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的N-末端的第104位氨基酸。
另外，由SEQ ID No.18的氨基酸序列表示的突变体蛋白具有天冬酰胺对异亮氨酸的替换——所述异亮氨酸是自由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的N-末端的第三位氨基酸，酪氨酸对苯丙氨酸的替换——所述苯丙氨酸是第65位氨基酸，和丙氨酸对缬氨酸的替换，所述缬氨酸是第104位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，基于上述发现，产生了源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶突变体蛋白的四种突变体蛋白，比如I3N、F65Y、V104A和E182G，其具有改进的酶活性。接着，通过测量突变体蛋白的活性，选择了三种有效的突变体蛋白，比如I3N、F65Y和V104A(表9)。制备包括三种有效突变体蛋白组合的载体，并且转染入大肠杆菌。在测量每种突变体蛋白的活性之后，发现相比野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，突变体蛋白具有1.75倍活性增加(表10)。
另一方面，本发明提供编码具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新的蛋白质或比野生型具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的突变体蛋白的多核苷酸。
如本文所使用，术语“多核苷酸”指具有通过共价键连接成长链的核苷酸单体的核苷酸多聚体，并且一般而言，其意思是长于某些长度的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)链。为了本发明的目的，多核苷酸可以是编码蛋白质的多核苷酸片段。该多核苷酸片段包括与具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多核苷酸片段的序列具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的多核苷酸片段。
优选地，多核苷酸可以是由SEQ ID No.14的核苷酸序列表示的多核苷酸。由SEQ ID No.14的核苷酸序列表示的多核苷酸是编码具有SEQ ID No.13的氨基酸序列的野生型蛋白质的多核苷酸。
另外，编码突变体蛋白的多核苷酸可具有SEQ ID Nos.19、20、21或22的核苷酸序列。具有SEQ ID Nos.19、20、21和22的核苷酸序列的多核苷酸分别是编码具有SEQ ID Nos.15、16、17和18的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
如本文所使用，术语“同源性”指两个多核苷酸部分之间的同一性的百分数。可通过本领域已知的技术确定一个部分与另一部分的序列对应。例如，可通过使用容易获得并且能够比对序列信息的计算机程序直接比对两个多核苷酸分子的序列信息，来确定同源性。另外，可通过在用于在同源区域中形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，并且通过单链特异性核酸酶消化杂交的链以确定消化片段的大小，来确定同源性。
如本文所使用，术语“同源的”指具有‘共同进化起源’的蛋白质之间的相互关系，其中所有的语法形式和拼写变型包括源自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)和源自其他种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)。这些蛋白质(和其编码基因)具有由高度序列相似性反应的序列同源性。然而，在一般的使用和本发明中，当形容词比如“非常高的”修饰术语“同源发生”时，其指序列相似性，而不是共同进化起源。
如本文所使用，术语“序列相似性”指在可具有或没有共同进化起源的蛋白质的核苷酸序列或氨基酸序列之间的同一性或同源性的程度。在一种具体的实例中，当对于固定长度的氨基酸序列，氨基酸序列之间的多肽匹配是至少21%(优选地至少约50%和最优选地约75%、90%、95%、96%、97%或99%)时，这两条序列是‘基本上同源的’或‘基本上类似的’。可通过使用在数据库中使用的标准软件比较序列，或例如，通过在为某些***限定的严格条件下进行DNA杂交实验，鉴定基本上同源的序列。适于杂交的限定条件在本领域传统技术范围内(例如，Sambrook等，1989，见下文)。
另一方面，本发明提供包括编码野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其突变体蛋白的多核苷酸的重组载体。
如本文所使用，术语“载体”指用于克隆核苷酸和/或将核苷酸转移至宿主细胞的任何载体。载体可以是复制子，以允许复制与其他DNA片段结合的片段。“复制子”指用作体内DNA复制，即通过自调节可复制的自复制单位的任何遗传单位(例如，质粒、噬菌体、黏粒、染色体和病毒)。载体可包括用于体外、先体外后体内或体内将核苷酸引入宿主细胞的病毒和非病毒载体，并且也可包括微球形DNA。例如，载体可以是没有细菌DNA序列的质粒。已经进行去除富含CpG区域的细菌DNA序列，以减少转基因表达的沉默并且促进自质粒DNA载体的更多持续表达(Ehrhardt,A.等(2003)Hum Gene Ther 10:215-25；Yet,N.S.(2002)MoI Ther 5:731-38；Chen,Z.Y.等(2004)Gene Ther 11:856-64)。另外，载体可包括转座子，比如睡美人(Sleeping Beauty)(Izsvak等J.MoI.Biol.302:93-102(2000))，或人工染色体。优选地，可使用载体比如pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322和pMW118，和更优选地可使用pCL_PCJ1，其是***有CJ1启动子的pCL1920载体(KR20060068505)。
本发明中，多核苷酸可操作地连接至重组载体。术语“可操作地连接”指核苷酸表达的调节序列与编码目标蛋白用于执行其一般功能的核苷酸序列的可操作连接，从而影响编码核苷酸序列的表达。与重组载体的可操作连接可通过使用本领域已知的基因重组技术进行，并且位点特异性DNA切割和连接可通过使用本领域已知的限制酶和连接酶完成。
另外，重组载体可进一步包括选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶基因的一个或多个抗生素抗性基因。
如本文所使用，术语“抗生素抗性基因”指具有对抗生素抗性的基因，并且包括该基因的细胞即使在用相应抗生素处理的环境下可存活。所以，抗生素抗性基因有效地用作大肠杆菌中大规模生产质粒的选择标记。本发明中，因为抗生素抗性基因不是显著影响通过为本发明关键特征的载体组分的最佳组合获得的表达效率的因素，所以任何常见抗生素抗性基因可非限制性地用作选择标记。具体地，可使用抗氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素的抗性基因，并且优选地可使用壮观霉素抗性基因。
另一方面，本发明提供用重组载体转化的微生物，用于生产O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
如本文所使用，术语“转化”指将基因引入宿主细胞用于表达该基因。将本发明的载体转化入细胞的方法可包括用于将核苷酸引入细胞的任何方法，并且其可通过选择本领域已知的适当标准技术进行。可使用比如电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆病毒感染、微注射、DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体的方法，但不限于其。
转化的基因可***宿主细胞的染色体中和位于染色体外部，只要其可在宿主细胞中表达。另外，基因包括DNA和RNA作为编码多肽的多核苷酸，并且可非限制性地使用可引入并且在宿主细胞中表达的任何基因。例如，基因可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒为多核苷酸构建体，其包括自表达需要的所有元件。表达盒通常包括与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以为可自复制表达载体的形式。另外，基因可以是以其本身或以多核苷酸构建体形式引入宿主细胞并且与宿主细胞中表达需要的序列可操作地连接的基因。
如本文所使用，术语“用重组载体转化的微生物”指用包括编码至少一种目标蛋白质的基因的载体转染的细胞。本发明中，如果微生物包括能够通过转化重组载体生产O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的野生型或突变体蛋白，可使用任何原核和真核微生物。例如，可使用属于埃希氏菌属某种、欧文氏菌属某种、沙雷氏菌属某种、普罗威登斯菌属某种、棒状杆菌属某种、假单胞菌属某种、钩端螺旋体属某种、沙门氏菌属某种、短杆菌属某种、生丝单胞菌属某种、色杆菌属某种和诺卡氏菌属某种(Norcardia sp.)的微生物菌株或真菌或酵母。优选地，可使用属于埃希氏菌属某种、棒状杆菌属某种和钩端螺旋体属某种的微生物菌株和酵母，和更优选地可使用埃希氏菌属某种，和最优选地大肠杆菌的微生物菌株。
另一方面，本发明提供生产甲硫氨酸或乙酸的方法，包括添加野生型蛋白、突变体蛋白或生产其的微生物至O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇的混合物，从而与所得混合物反应。
O-乙酰高丝氨酸指纯化形式的O-乙酰高丝氨酸或包含O-乙酰高丝氨酸的发酵肉汤。而且，甲硫醇指所有下列形式，液化的甲硫醇钠(CH3S-Na)形式，和气态或液化的甲硫醇(CH3SH)形式，以及专利公开WO2010/098629公开的包括二甲硫(DMS)的甲硫醇。在本发明的一个实例中，对于L-甲硫氨酸转化反应，添加包括多肽的微生物(总反应体积的)5-10%的匀浆至O-乙酰高丝氨酸的发酵肉汤，并且通过添加15%Na-甲硫醇至pH6-8的混合物启动该反应。接着，2小时之后，收集发酵肉汤，并且从中去除细胞，然后通过HPLC分析以鉴定甲硫氨酸生产。如图2b中显示的，当本发明的突变体蛋白用于生产甲硫氨酸时，酶转化反应和活性优于现有生产菌株的那些。而且反应产物造成的反应抑制被最小化，并且突变体蛋白的热稳定性是极好的，从而提示本发明的突变体蛋白可有效地用于工业目的。
另一方面，本发明提供蛋白质作为O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的应用。
如上述，本发明的蛋白质可以是具有源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的野生型蛋白和其突变体蛋白，并且优选地其可以是具有SEQ ID Nos.13和15-18的氨基酸序列的蛋白质。本发明的蛋白质具有对O-乙酰高丝氨酸的高底物特异性，从而具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的活性或其增强的活性，并且因此其可用于生产甲硫氨酸或乙酸。
发明模式
下文，通过提供如下实施例更详细描述本发明的构造和效果。然而，这些实施例仅仅用于阐明本发明，而绝不是限制本发明的范围。
实施例1：甲硫氨酸转变酶的生产
1-1.来自生丝单胞菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶
通过从KEGG网站(www.kegg.com)获得将O-乙酰高丝氨酸转化成甲硫氨酸的来自海王生丝单胞菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因序列，产生引物。海王生丝单胞菌的染色体购买自ATCC(USA)。使用染色体作为模板和SEQ ID Nos.1和2的引物，如下进行PCR反应：30个循环，在94℃下变性步骤30秒，在55℃下退火步骤30秒，和在72℃下延伸步骤2分钟。HL PCR预混合物试剂盒(Bioneer，Korea)用于PCR反应。
通过PCR反应获得的DNA片段由Ncol/HindIII切割并且克隆至用相同酶消化的pCL-PCJ1载体。最终制备的载体命名为pCL-PCJ1-MetZhne并且其示意图显示在图1中。将克隆的载体转化入大肠杆菌K12细胞，并且在添加50μg/L壮观霉素的LB培养基平板上培养，并且选择集落。将选择的集落接种在3ml包含50μg/L壮观霉素的LB培养基中，并且在37℃下培养，200rpm持续16小时。将细胞培养物再接种在25ml新的LB液体培养基(250ml烧瓶中)中，并且在相同的培养条件下培养直到O.D.600达到0.5-0.6(持续2-3小时)，并且之后立即将其在500ml添加4%葡萄糖的LB培养基(1L广口瓶中)中培养直到耗尽葡萄糖。收集1ml的酶培养物培养基，离心去除上清液，并且用0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)冲洗成团的细胞。将细胞重悬浮在1mL的磷酸钾缓冲液中，并且使用超声以30秒的间隔粉碎5次。收集粉碎的细胞匀浆，并且使用BIO-Rad蛋白质定量试验(BIO-Rad，USA)量化蛋白质的总量。另外，通过SDS-PAGE确认蛋白表达。随后，收集的细胞匀浆在酶转化反应中使用。
1-2.来自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶
在该实验中，克隆metZ基因，其编码将O-乙酰高丝氨酸转化为甲硫氨酸的来自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
使用类球红细菌的染色体作为模板和SEQ ID Nos.3和4的引物，如下进行PCR反应：30个循环，在94℃下变性步骤30秒，在55℃下退火步骤30秒，和在72℃下延伸步骤2分钟。
通过Ncol/HindIII切割从该PCR反应获得的DNA片段，并且克隆入用相同的酶消化的pCL-PCJ1载体(Korea，CJ)。通过使用以与实施例1-1描述的相同方式克隆的载体获得的细胞匀浆，并且其在酶转化反应中使用。
实施例2：比较转变酶表达水平、底物特异性和转变酶的活性
通过使用由实施例1-1和1-2的方法获得的每种细胞匀浆，比较源自生丝单胞菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的表达水平和酶活性。
一般而言，通过使用如实施例1-1中提到的来自BIO-Rad的蛋白质定量试验量化蛋白质的量，然而，当用大肠杆菌蛋白质，比如酶匀浆分析蛋白质的混合物时，难以使用蛋白质量化方法比较某些酶的表达水平。所以，在该实验中，使用SDS-PAGE比较从实施例1-1和1-2获得的细胞匀浆中转变酶的表达水平。作为使用10μl、5μl和2.5μl的两种细胞匀浆，比较源自生丝单胞菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(Metz-hne)和源自红细菌属某种的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ-rsp)的结果，观察到MetZ-rsp显示高于MetZ-hne约4倍表达水平(图3)。
为了确定两种酶的底物特异性，将O-酰基高丝氨酸溶解在0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)至3mM的终浓度。另外，添加用作辅因子的5′-磷酸吡哆醛(Sigma，USA)至反应混合物至10μM的终浓度。添加另一底物甲硫醇(Japan Tokyo Chemical Industry Ltd.)至反应混合物至2mM的终浓度。将1ml的反应混合物放在37℃下，并且接着添加10μl的每种酶提取物以使得终蛋白浓度为5mg/ml。通过在反应开始后收集100μl的反应混合物并且将其添加至900μl的4mg/ml DTNB溶液(5,5-二硫双(2-硝基-苯甲酸)，Sigma，USA)测量在415nm下的吸光度，确认该反应的进展。
DTNB与残留在反应混合物中的甲硫醇的-SH基团反应，并且合成黄色物质。因此，可通过观察随着反应混合物中的甲硫醇转化为甲硫氨酸反应混合物中黄色的消失，监测反应的进展。而且，如果DTNB的吸光度在反应前后差别(ΔO.D.415)较高，则提示酶的活性较强。
由于O-酰基高丝氨酸反应混合物和酶溶液反应的结果，观察到源自海王生丝单胞菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶二者都显示对O-乙酰高丝氨酸的底物特异性比对O-琥珀酰高丝氨酸更高。每种酶的底物特异性简单显示为表1中′+′的数量。总体上，鉴定两种菌株都对O-乙酰高丝氨酸的底物特异性比对O-琥珀酰高丝氨酸更高。
[表1]
Figure BDA00003538921500141
实施例3：在高浓度O-乙酰高丝氨酸培养基中的早期期间，比较 MetZ-hne和MetZ-rsp反应
为了比较MetZ-hne和MetZ-rsp酶在高浓度的O-乙酰高丝氨酸中的转化率，以80g/L的O-乙酰高丝氨酸浓度进行甲硫氨酸转化实验。根据1ml试管规模中的80g/L O-乙酰高丝氨酸随时间的酶转化，比较源自海王生丝单胞菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶之间的相对甲硫氨酸生产速度。可通过测量从该反应中生产的甲硫氨酸浓度，比较O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的反应速度。更具体地，通过添加0.01ml的生产甲硫氨酸需要的另一底物甲硫醇钠(15%，w/v)、0.01ml的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和0.1mM 5′-磷酸吡哆醛酶辅因子至1ml的80g/L O-乙酰高丝氨酸，并且以800rpm搅拌，在33℃下进行酶转化反应。添加每种酶提取物至5mg/ml的终蛋白浓度。通过HPLC分析甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的浓度。甲硫氨酸转化率计算为从添加至反应的1摩尔甲硫醇生产的甲硫氨酸的摩尔数。
如表2中显示，甚至在高浓度的O-乙酰高丝氨情况下，源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶显示比源自海王生丝单胞菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶在早期期间更高的反应速度和更高的转化率。
[表2]
Figure BDA00003538921500151
实施例4：比较反应产物甲硫氨酸和乙酸的反应抑制程度
在两步法中，在酶反应中生产L-甲硫氨酸和乙酸。然而，已知高浓度的L-甲硫氨酸降低酶反应速度并且乙酸通过蛋白变化抑制酶活性。
对于为了工业目的O-乙酰高丝氨酸酶转化至L-甲硫氨酸和乙酸，酶应保持高活性，即使在具有上述酶活性抑制的情况下。在高浓度L-甲硫氨酸和乙酸的存在下，比较MetZ-hne和MetZ-rsp的活性。具体地，在0.3M L-甲硫氨酸(约45g/L)和0.3M乙酸的存在下，使用实施例2中描述的DTNB方法比较活性。在该反应中，使用25μl的5mg/ml细胞匀浆。结果显示MetZ-hne和MetZ-rsp的残留活性分别是42%和50%，并且因此确认即使在高浓度L-甲硫氨酸和乙酸存在下Metz-rsp也具有更低程度的酶活性抑制(表3)。
[表3]
Figure BDA00003538921500161
另外，分析两种酶在0.3M L-甲硫氨酸和0.3M乙酸存在下的转化反应，并且结果显示在表4中。
[表4]
Figure BDA00003538921500162
实施例5：比较MetZ-hne和MetZ-rsp酶的热稳定性
在工业规模的酶转化过程中，反应在33-37℃的温度下进行约1-6小时。除了被反应产物的反馈抑制之外，具有低热稳定性的酶随着转化反应的进展也具有低的酶活性。因此，酶的热稳定性是工业适用性和成本效益方面的重要因素。为了比较酶的热稳定性，通过实施例1-1和1-2方法获得的每种细胞匀浆在50℃下热处理10、30、60、120和240分钟，并且接着使用实施例2的DTNB方法比较酶的残留活性。
如表5中显示，源自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶在45℃下240分钟长的热处理之后显示与热处理之前其活性相比95%的残留活性。另一方面，MetZ-hne显示75%的残留活性，从而提示MetZ-rsp具有卓越的热稳定性。
[表5]
Figure BDA00003538921500171
实施例6：使用MetZ-rsp在间歇反应器中将O-乙酰高丝氨酸培养 基酶转化成L-甲硫氨酸
在本实施例中，为了评估在试管规模中鉴定的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metZ-rsp)现在在反应器***中的转化活性，使用具有1L最优体积的间歇反应器。通过发酵现有技术中公开的微生物菌株，生产为酶转化反应需要的底物的O-乙酰高丝氨酸，并且使用离心机从培养的发酵肉汤中去除细胞。使用500mL的约70g/L培养基(WO2008/013432)。因为甲硫醇在室温下以气态形式存在，所以通过使用通过添加甲硫醇至苛性钠溶液产生的液体形式的甲硫醇钠溶液(CH3S-Na，4.7M，33%，Arkema France)，进行实验。在酶转化反应中使用约50mL的甲硫醇钠。作为酶溶液，通过实施例1的方法产生的50mL的MetZ-rsp细胞匀浆连同0.1mM 5′-磷酸吡哆醛(Sigma，USA)添加至反应。在7.0的pH和33℃下以700rpm搅拌，进行酶转化反应。反应进行3小时，同时添加甲硫醇钠。通过HPLC分析O-乙酰高丝氨酸和随时间生产的L-甲硫氨酸的浓度，并且这些结果显示在表6中。
[表6]
时间(分钟) O-乙酰高丝氨酸(g/L) L-甲硫氨酸(g/L)
0 66.1 0
30 20.6 34.1
90 9.5 42.0
120 3.1 47.2
180 0 49.5
总体上，观察到使用MetZ-rsp酶溶液在1L间歇反应器中O-乙酰高丝氨酸培养基至L-甲硫氨酸的酶转化反应是快速的并且显示高的转化率(97%mol转化率)。
实施例7：使用MetZ-rsp在间歇反应器中按比例放大O-乙酰高丝 氨酸培养基至L-甲硫氨酸的酶转化反应
在本实施例中，为了通过在1L间歇反应器中鉴定的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metZ-rsp)的转化活性评估甲硫氨酸的按比例放大（scale-up）酶转化反应***，使用30L间歇反应器(Korea fermenter，Korea)进行甲硫氨酸转化反应。如实施例6中通过发酵现有技术中公开的微生物菌种(WO2008/013432)，生产为酶转化反应中需要的底物的O-乙酰高丝氨酸，并且使用离心机从培养的发酵肉汤中去除微生物菌株。通过添加水稀释上清液以使得O-乙酰高丝氨酸的浓度为66g/L，并且用于反应中。
在23L稀释的发酵上清液放置在发酵罐中之后，通过实施例1中描述的方法产生的500ml的metZ-rsp酶匀浆添加至其中，并且接着添加辅因子5′-磷酸吡哆醛(Sigma，USA)至0.1mM的终浓度。随后，通过添加氨气调节反应混合物的pH至6.5，并且将温度和搅拌分别设置为37℃和300rpm。
使用气态形式的甲硫醇(CH3SH，99.5%，UK，Intergas)，并且将其直接放入反应混合物，同时使用质流控制器控制添加的气体量。因为在反应混合物中一些甲硫醇蒸发，并且增加反应器内部的压力，所以调节供应甲硫醇的速度以保持压力小于0.5bar。将约220L(470g)的甲硫醇添加至反应总共120分钟，同时对于快速反应时期的第一个30分钟，控制供应速度为3-5L/min并且接着对于慢反应时期的剩余90分钟，控制供应速度为1-2L/min。酶转化反应期间，添加的甲硫醇的总量是与反应混合物中存在的O-乙酰高丝氨酸相同的摩尔量，所有的O-乙酰高丝氨酸在甲硫氨酸的合成期间被消耗。在反应结束之后，甲硫醇的剩余量小于0.1g/L。
因为在反应期间，每次生产1摩尔的甲硫氨酸，生产1摩尔的乙酸，其降低pH，当pH降低至6.48时，通过添加氨气增加pH，将反应的pH保持在6.5。可通过测量pH下降的斜率确定反应速度，并且当pH下降缓慢时可确定反应结束。
反应进行6小时同时添加甲硫醇至反应。通过HPLC分析O-乙酰高丝氨酸和L-甲硫氨酸随时间的浓度的变化，并且结果显示在图5中。
反应期间pH变化轮廓显示在图4中，并且通过反应甲硫氨酸转化的图显示在图5中。
总体上，确认即使当在30L间歇反应器中使用metZ-rsp酶溶液，将气态甲硫醇在O-乙酰高丝氨酸培养基至L-甲硫氨酸的酶转化反应中使用时，6小时可实现98%摩尔转化率的甲硫氨酸转化。
实施例8：通过应用突变改进metZ-rsp的酶活性
在本实施例中，进行易错PCR，以在野生型metZ-rsp中诱导随机诱变，并且为了该实验使用多样化PCR随机诱变试剂盒(CLONTECH，USA)。为了发现用于确定靶突变率的最佳条件，在下列两种条件下在各种浓度的MnSO4和dGTP下，进行易错PCR。实施例1-2中克隆的pCL-PCJ1:metZ-rsp用作其中待引入突变的DNA模板。
[表7]
Figure BDA00003538921500191
Figure BDA00003538921500201
用Ncol/HindIII切割在表7条件下进行的易错PCR的产物，并且克隆入用相同酶消化的pCL-PCJ1载体。将克隆的突变体库转化入大肠杆菌K12细胞，其接着在包含50μg/L壮观霉素的LB培养基平板上培养。培养之后，选择50个集落，并且接着进行测序分析，以确定突变率并且检查在各个位置突变的出现。测序分析结果表明突变率在条件1下是2.4kb-1，和在条件2下是2.9kb-1。基于这些结果，确定条件1和2二者都可产生合适的突变率，用于产生突变体库，并且因此使用在上述条件下产生的库进行有效突变的筛选。
在第一96深孔板中培养所得的细胞，并且用1:1比的BugBuster溶液(MERCK，USA)处理以获得细胞匀浆。接着，收集50μl的细胞匀浆，并且与包括300mM O-乙酰高丝氨酸和1mM L-半胱氨酸底物的50μl的反应混合物混合。所得反应混合物在室温下反应60分钟，同时在指定时间添加50uL的DTNB溶液。在颜色形成之后在415nm下测量O.D.值，并且结果显示在表8中。
[表8]
时间(分钟) 0 5 10 15 30 60
OD415 2.17 1.19 0.65 0.50 0.37 0.30
补偿OD 2.01 1.00 0.40 0.23 0.05 0.00
背景信号，415nm 0.16 0.19 0.25 0.27 0.32 0.30
在DTNB颜色水平随时间的图中，残留的L-半胱氨酸的O.D.值在反应之后的5分钟和10分钟分别是1.19和0.65。在实际筛选中，选择在酶反应5分钟之后具有小于1.0的DTNB颜色水平的残留半胱氨酸的突变体。
使用上述筛选方法，选择显示显著增加活性的候选突变体。随后，进行核苷酸序列比对，以在候选突变体中筛选有效的突变。接着最终，选择包括4种类型突变，比如I3N(SEQ ID NO：15)、F65Y(SEQ ID NO：16)、V104A(SEQ ID NO：17)和E182G的突变体。最终选择的突变作为候选突变引入，并且通过单独将每种类型的候选突变引入pCL-PCJ1:metZ-rsp标准载体，验证增加的活性。为了产生引入每种类型候选突变的载体，使用I3N突变的SEQ ID Nos.5和6的引物、F65Y突变的SEQ ID Nos.7和8的引物、V104A突变的SEQ ID Nos.9和10的引物和E182G突变的SEQ ID Nos.11和12的引物，产生引入每种候选突变的metZ-rsp表达载体。通过测序分析(Macrogen，Korea)确认成功引入突变。将产生的突变体载体转化入大肠杆菌K12，并且在33℃下和200rpm在LB培养基烧瓶中培养15小时。接着分析培养的样品，以确证每种候选突变。结果显示在表9中。
[表9]
突变 OD562nm 活性 单位 特异性活性 特异性单位
野生型 9.18 1.63 32.67 0.18 3.56
I3N 8.93 1.89 37.73 0.21 4.22
F65Y 8.83 2.00 39.93 0.23 4.52
V104A 8.60 1.88 37.67 0.22 4.38
E182G 9.53 1.43 28.60 0.15 3.00
引入每种候选突变之后的烧瓶评估表明I3N(SEQ ID No.15)、F65Y(SEQ ID No.16)和V104A(SEQ ID No.17)是有效的突变，其显示与现有的metZ-rsp对照组相比增加的活性。另一方面，确定E182G突变对于具有增加的活性是无效的，并且因此其被排除用于随后的实验。
确认为具有增加活性的包括I3N、F65Y和V104A所有三种类型的有效突变被引入载体pCL-PCJ1:metZ-rsp载体(命名为pCL-PCJ1:metZ-rspM3)，以产生具有甚至更多增强活性的载体。使用上面列举的引物，三种类型的突变一个接一个引入载体。将用三种类型突变制备的表达载体转化入大肠杆菌K12并且在烧瓶中培养。接着分析细胞培养物以评估表达载体的活性，并且结果显示在表10中。
[表10]
突变 活性 特异性活性
pCL-PCJ1:metZ-rsp 1.00 1.00
pCL-PCJ1:metZ-rsp M3 1.75 1.73
如表10中显示的，确认引入有三种类型有效突变的pCL-PCJ1:metZ-rsp M3的活性比pCL-PCJ1:metZ-rsp增加1.75倍。
Figure IDA00003538922700011
Figure IDA00003538922700021
Figure IDA00003538922700031
Figure IDA00003538922700041
Figure IDA00003538922700081
Figure IDA00003538922700091
Figure IDA00003538922700111
Figure IDA00003538922700121

Claims (12)

1.一种蛋白质，其具有由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性。
2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其由SEQ ID No.14的核苷酸序列表示。
4.一种突变体蛋白，其具有比野生型增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性，其中自由SEQ ID No.13的氨基酸序列表示的蛋白质的N-末端的第三位氨基酸被异亮氨酸之外的氨基酸替换，自所述蛋白质的N-末端的第65位氨基酸被苯丙氨酸之外的氨基酸替换，自所述蛋白质的N-末端的第104位氨基酸被缬氨酸之外的氨基酸替换，或进行三种类型氨基酸突变的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的突变体蛋白，其中通过用天冬氨酸替换自所述N-末端的所述第三位氨基酸，用酪氨酸替换所述第65位氨基酸，和用丙氨酸替换所述第104位氨基酸，进行所述突变。
6.根据权利要求4所述的突变体蛋白，具有选自SEQ ID Nos.15-18的氨基酸序列。
7.一种多核苷酸，其编码权利要求4所述的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，具有选自SEQ ID Nos.19-22的核苷酸序列。
9.一种重组载体，其包括权利要求2、3、7和8任一项所述的多核苷酸。
10.一种微生物，其用权利要求9所述的重组载体转化，用于生产O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
11.根据权利要求10所述的微生物，其是大肠杆菌(E.coli)。
12.生产甲硫氨酸或乙酸的方法，其包括添加权利要求1和权利要求4-6任一项所述的蛋白质，或生产所述蛋白质的微生物至O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇的混合物，从而与所得混合物反应。
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