CN103429731B - 具有生产n‑乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物及用其生产n‑乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产N‑乙酰葡糖胺的棒状杆菌属微生物，该微生物保留了6‑磷酸乙酰转移酶活性，以及用该微生物生产N‑乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。

Description

具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物及用其生产 N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法
技术领域
本发明涉及基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，以及用其生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。
背景技术
葡糖胺是葡萄糖的氨基衍生物，以及N-乙酰葡糖胺是葡糖胺的乙酰化衍生物。它们是许多天然多糖的重要成分，并且能形成细胞的结构材料，构成细胞壁。
N-乙酰葡糖胺是蛋白合成的重要组分，参与组织再生，因此N-乙酰葡糖胺在预防和治疗多种疾病中具有治疗潜力，诸如胃炎、食物过敏、炎性肠病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及由于骨关节组织代谢异常导致的病理状况。葡糖胺也被用作预防和治疗人类骨关节疾病的功能性食物。
葡糖胺通过酸水解几丁质(chitin)而获得，几丁质是由N-乙酰葡糖胺衍生的复杂碳水化合物。可选地，葡糖胺也可以通过酸水解壳聚糖而产生。原料几丁质是N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的共聚物，并且是节肢动物和真菌中常见的天然物质。几丁质可以从节肢动物废料(龙虾、小虾、磷虾、蟹、明虾的外骨骼)获得，并且最近更多从廉价的来源如用于柠檬酸生产的真菌生物质中获得
常见的工业实践是通过如下方法来纯化几丁质：用酸和碱的组合处理几丁质，以除去附带矿物质、蛋白质等的其它杂质，然后长时间通过使用浓盐酸在高温下以低收率在单个步骤中将几丁质解聚并脱乙酰基成葡糖胺。作为游离碱的葡糖胺很不稳定，易降解。因此，产生稳定的盐，如盐酸盐。
节肢动物废料和真菌生物质中葡糖胺的含量低，因此产生大体积的废物。葡糖胺非常昂贵，因为生产过程本身具有相对低的收率，并且是能源和化学集约的(energy andchemically intensive)。此外，常见形式的葡糖胺源于贝类，已知在对贝类敏感的人中有过敏反应的可能性。而且，原材料(例如，几丁质的来源，如蟹壳)的可用性逐渐变得有限。因此，对以高得率生产用于商业销售和使用的葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的具有成本效益的方法存在需求。
PCT公开WO 02/66667公开了从微生物质制备葡糖胺以除去过敏反应可能性的方法。该生产方法克服了与贝类过敏有关的问题，但遇到的主要问题是得率低。更具体地，由于该方法依赖于在其它产物如柠檬酸发酵过程中产生的生物质废物，不足以生产足够量的葡糖胺以满足对该产品日益增长的市场需求。
同时，N-乙酰葡糖胺目前是通过用有机乙酰化试剂如乙酸酐乙酰化葡糖胺而生产的，但这种生产方法需要的成本高。同样，由于生产得率低，不易大规模生产N-乙酰葡糖胺。
为克服这些问题，美国专利7,332,304公开了通过大肠杆菌(E.coli)发酵生产N-乙酰葡糖胺的方法。该方法提出用大肠杆菌发酵以获得高N-乙酰葡糖胺生产得率，这极大地解决了所遇到的问题，包括由于传统工艺复杂导致的低N-乙酰葡糖胺生产得率。另外，已知葡糖胺可以通过简单的酸处理使N-乙酰葡糖胺去乙酰化来生产(Novikov V.Y.etal.Russ.J.Appl.Chem.1997：1467-1470)，因此也有可能以高得率生产葡糖胺。
然而，该方法不适用于生产保健食品，因为大肠杆菌的使用产生了潜在有毒的内毒素。另外，葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶——其对N-乙酰葡糖胺的生产很重要(参见图1：GNA1)——在大肠杆菌中不存在，因此要引入其它微生物，如酵母。有一个限制是关键酶的表达需要可诱导的表达***(Deng M.D.et al.Met Eng.2005：201-214)。关键酶不受调控的表达引起细胞增殖的严重抑制。可诱导表达***的劣势在于需要诱导材料，导致生产成本增加，并且应当确定诱导时间点，因此认为其不适于大规模发酵的工业化生产。在生产安全和工业化改进的可能性方面，上述方法具有使用大肠杆菌和可诱导表达***的缺点。
迄今为止，大肠杆菌发酵技术被开发来克服原材料的可用性有限和生产得率低的问题。然而，还没有适于生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的对人和动物安全的菌株。另外，还没有利用组成性表达***而非可诱导表达***以利于工业化酶生产的生产菌株的报道。
为解决上述问题，本发明人开发了用于大规模发酵N-乙酰葡糖胺和葡糖胺而不引起环境问题，能够实现生产稳定性和工业应用的棒状杆菌属微生物，以及用该微生物生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的方法，从而完成本发明。
发明概述
本发明的目的是提供基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌属微生物，优选具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性和降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一目的是提供用棒状杆菌属微生物生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。
发明效果
根据本发明，可以开发具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物，因此使用该微生物生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺，从而实现没有过敏反应风险的N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的大规模生产。进一步，其是工业上可应用的，因为保健食品和治疗材料可以安全地被生产，并且关键酶可以被组成性地表达。
附图说明
图1图解了生产N-乙酰葡糖胺的菌株中N-乙酰葡糖胺的生物合成途径和基因改造，其中nagA被失活并且外源基因GNA1被扩增；
图2图解了pDZ-nagA1ST载体的结构，其中具有终止密码子的nagA1被克隆到pDZ中；
图3图解了pECCG117-PEFTU-GNA1载体的结构，其中组成性表达启动子PEFTU先被克隆到pECCG117载体中，然后GNA1被克隆到其中；
图4图解了pVWEx2-GNA1载体的结构，其中GNA1被克隆到pVWEx2载体中。
优选实施方式详述
一方面，本发明涉及具有生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物，其中该微生物具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性以及降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性。
在本发明中，葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶指通过乙酰化葡糖胺-6-磷酸生产N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的酶。该酶存在于酵母(Saccharomyces)属微生物中，但不存在于棒状杆菌属微生物中。
如本文所用，术语“具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性”或“具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的棒状杆菌属微生物”意为棒状杆菌属微生物中不存在的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因被导入棒状杆菌属微生物中以表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶，因此，该棒状杆菌属微生物能用该酶将N-葡糖胺-6-磷酸转化为N-乙酰葡糖胺-6-磷酸。
通过导入该基因将葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性赋予棒状杆菌属微生物的方法可以通过本领域熟知的多种方法进行。在本发明的具体实施方式中，编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列被导入载体中，并且该重组载体被用于转化棒状杆菌属微生物。
葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因是具有在棒状杆菌属微生物中可操作的核酸序列的任意基因。在一个具体实施方式中，该基因是源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因，优选SEQ ID NO.11的核酸序列。具体地，编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的序列可以在保留其活性的情况下进行某种程度的改造。本领域技术人员容易理解，通过人工改造保留70％或更多同源性的核酸序列等同于源自本发明核酸序列的序列——只要其保留了本发明所期望的基因活性。
优选地，将启动子可操作地连接到本发明的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因，以便诱导该基因的表达。更优选地，针对本发明的目的，该启动子是诱导棒状杆菌属微生物进行葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的组成性或可诱导表达的启动子，以及该启动子是能诱导导入棒状杆菌属微生物中的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的组成性或可诱导表达的任意基因。在一个具体实施方式中，该组成性启动子是EFTU启动子，以及该可诱导表达启动子是laclq-Ptac启动子。当大肠杆菌中葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的表达在生长早期被诱导时，发生严重的生长抑制，因此应当只采用可诱导表达***(Deng M.D.et al.Met Eng.2005：201-214)。相反，本发明的棒状杆菌属微生物具有这样的优势：其生长不受该酶的可诱导或组成性表达影响。
如本文所用，术语“葡糖胺-6-磷酸脱氨酶”指参与乙酰葡糖胺-6-磷酸转化为葡糖胺-6-磷酸的酶。对于本发明的目的，本发明的棒状杆菌属微生物的特征在于其与天然存在的基因相比，由于编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列部分或全部缺失/突变，显示较少或不显示编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因的表达。与天然存在的基因相比，由于编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列部分或全部缺失/突变，编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的基因的低表达或不表达可以在本文中表示为“降低”或“缺失”。
为诱导葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因不表达或较少表达，例如，突变可以发生在启动子或位于结构基因上游的调控区域中。连接在结构基因上游中的调控盒也可以执行相同的功能。可以改造启动子以降低表达，或者可以通过降低的mRNA稳定性来调控基因翻译以便降低表达。此外，可以通过位点特异性重组DNA技术用缺失的或突变的片段置换部分或全部基因来使葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的活性降低或缺失。然而，对本领域技术人员而言明显的是，除了这些方法外，可以通过本领域熟知的多种方法实现该基因的不表达或较少表达。
如本文所用，术语“生产N-乙酰葡糖胺的能力”意为本发明的棒状杆菌属微生物具有在培养其的培养基中生产和累积N-乙酰葡糖胺的能力。如本文所用，术语“生产葡糖胺的能力”指由微生物发酵产生的材料生产葡糖胺的能力，并且指根据本领域已知的各种方法本发明的棒状杆菌属微生物通过将培养基中累积的N-乙酰葡糖胺脱乙酰基成葡糖胺，生成和累积葡糖胺的能力。
如本文所用，术语“具有生产N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺能力的微生物”是属于棒状杆菌属的微生物。优选地，该微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(例如，ATCC13032)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(例如，ATCC6872)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(例如，ATCC13869)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(例如，ATCC14067)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)(例如，FERM-BP 1539)、Corynebacterium efficiens(例如，C.efficiens str.YS-314)等等，但不限于此。更优选地，该微生物是谷氨酸棒杆菌，甚至更优选2008年9月29日保藏于KCCM(韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)，Eulim Buld.，361-221，Hongje-1-Dong，Seodaemun-Ku，Seoul，120-861，Korea)的登录号为KCCM10967P的谷氨酸棒杆菌CJNAG1。
另一方面，本发明涉及生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法，包括培养具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物。
具体地，本发明涉及生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法，包括如下步骤：(a)培养本发明的具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物和(b)收集培养步骤中生产的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺。
本发明的上述培养可以通过本领域技术人员已知的适当的培养基和条件进行。本领域技术人员完全理解，培养方法可以根据所选的菌株容易地调整后进行使用。例如，培养方法包括但不限于分批培养、连续培养和补料分批培养。多种培养方法描述于例如以下参考文献中：“Biochemical Engineering”by James M.Lee，Prentice-Hall InternationalEditions，pp 138-176。培养所用的培养基应当满足特定菌株的培养条件。
本发明所用的培养基含有葡萄糖作为主要碳源，并且该培养基可以含有适当量的多种碳源。所用的氮源的示例为有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粉；以及无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用。本文中的培养基可以另外包含磷酸二氢钾、磷磷酸氢二钾和相应的含钠盐作为磷源。该培养基也可以包含金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，可以添加氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以以分批方式或连续方式加入添加到培养物中。
在培养过程中，可以适当添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸，以调节培养物的pH。可以适当添加消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以减少培养物中泡沫的形成。为保持培养物在需氧状态，可以向培养物中注入氧气或含氧的气体。为保持培养物在厌氧和微需氧状态，可以不向培养物中注入气体或向培养物中注入氮气、氢气或二氧化碳气体。将培养物保持在30至37℃，优选35至37℃。培养可以一直持续到获得期望量的期望材料，优选持续10至160小时。
收集和/或回收本发明培养步骤中生产的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的步骤可以通过本领域已知的适当方法进行，这取决于培养程序，例如分批培养、连续培养或补料分批培养，以便从培养基中收集期望的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺。
此外，本发明还可以包括将收集的N-乙酰葡糖胺通过脱乙酰基转化为葡糖胺的步骤。对本领域技术人员而言明显的是，该转化可以通过本领域广泛熟知的方法(例如，Novikov V.Y.et al.Russ.J.Appl.Chem.1997：1467-1470)进行。
下面将参考实施例对本发明进行更加详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，本发明并不意图受这些实施例的限制。
实施例1：N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶突变体以及染色体DNA置换重组载体pDZ-nagAST的构建
为防止野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13102)利用N-乙酰葡糖胺-6-磷酸，编码N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的nagA1(NCgl2556，SEQ IDNO.1)——其利用N-乙酰葡糖胺-6-磷酸作为底物——被失活。
该失活可以通过多种方法来进行，诸如基因缺失或导入额外的序列，以及在本实施例中，在nagA1基因的ORF(开放阅读框)中***终止密码子，以诱导基因翻译的失活。
具体地，从谷氨酸棒杆菌(ATCC13102)中分离基因组DNA，并且用该基因组DNA作为模板以及引物SEQ ID NO.2和3进行PCR，以获得编码N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的基因(nagA1：NCgl2556)。
用于扩增nagA1基因的引物的各序列如下。
SEQ ID NO.2(nagA1-5)
5’-GGAATTCATGGCAGAAGTGGTGCATTATCAAG-3’
SEQ ID NO.3(nagA1-3)
5’-GCTCTAGAGATGATGTCCATGGTCGGACTCC-3’
为了用野生型N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因构建在ORF中具有终止密码子的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶突变体，制备了额外的引物(SEQ ID NO.4和5)，以在196位的异亮氨酸和197位的丙氨酸之间***终止密码子。
具体地，使用通过PCR获得的野生型nagA1作为模板以及各引物SEQ ID NO.2和4及SEQ ID NO.3和5进行PCR。两种终产物是部分nagA1，因此具有其一半的大小。这两种产物被同时用作模板，并且使用引物SEQ ID NO.2和3再次进行PCR。通过这个过程，获得编码失活的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶突变体的基因。通过韩国专利公开号2008-0025355中公开的分子生物学技术，使用限制酶EcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)和XbaI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)将失活的nagA1基因片段导入染色体DNA置换载体pDZ中，以构建pDZ-nagA1ST载体(图2)。
SEQ ID NO.4(nagA1ST-5)
5’-GTGCCCGAAGGAAGCTTAAATGATGTGGTGCGC-3’
SEQ ID NO.5(nagA1ST-3)
5’-GCGCACCACATCATTTAAGCTTCCTTCGGGCAC-3’
实施例2：谷氨酸棒杆菌CJNAGKO的构建
为了用构建的pDZ-nagA1ST载体转化野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13102)，通过二次交换将终止密码子***到染色体上nagA1基因的ORF中，如韩国专利公开号2008-0025355中所述。最后，将终止密码子***在196位的异亮氨酸和197位的丙氨酸之间，以构建CJNAGKO。
实施例3：葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的组成性表达载体的构建
为了生产N-乙酰葡糖胺，构建了表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的载体，所述葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶是使用葡糖胺-6-磷酸作为底物生产N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的酶。为了工业应用，使用组成性启动子来构建载体以确保该酶在细胞生长过程中的组成性表达。用于表达的酶是GNA1，其是已知的酿酒酵母的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因。
至于该酶的组成性表达，使用EFTU启动子(Judith B.et al.Appl EnvironMicrobiol.2005：8587-8596.)，其已知是谷氨酸棒杆菌中的组成性启动子。使用由谷氨酸棒杆菌分离的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO.6和7进行PCR，以获得EFTU启动子(SEQID NO.8)。通过已知的分子生物学技术，使用限制酶NdeI(New England Biolabs，Beverly，MA)和HindIII(New England Biolabs，Beverly，MA)将所得的PCR产物EFTU启动子导入pECCG1117载体(Biotechnology letters vol 13，No.10，p.721-726(1991)或韩国专利公开号92-7401)中。构建的载体被称为pECCG117-PEFTU。另外，使用由酿酒酵母分离的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO.9和10进行PCR，以获得GNA1(SEQ ID NO.11)。使用SpeI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)将获得的GNA1导入pECCG117-PEFTU载体中，以构建pECCG117-PEFTU-GNA1载体(图3)。
用于扩增EFTU启动子和GNA1基因的各引物序列如下。
SEQ ID NO.6(EFTU-5)
5’-GACTAGTATGTTCGGTTACGTCGGTGACCTTC-3’
SEQ ID NO.7(EFTU-3)
5’-CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3’
SEQ ID NO.9(GNA1-5)
5’-GGAATTCCATATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGG-3’
SEQ ID NO.10(GNA1-3)
5’-GCTCTAGACTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCC-3’
实施例4：葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的可诱导表达载体的构建
构建了谷氨酸棒杆菌的可诱导表达***，以与实施例3中的谷氨酸棒杆菌的组成性表达***进行比较
具体地，使用由酿酒酵母中分离的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO.9和10进行PCR，以获得GNA1。使用PstI(New England Biolabs，Beverly，MA)和XbaI(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)将获得的GNA1导入pVWEx2载体中，以构建pVWEx2-GNA1载体(图4)，所述pVWEx2载体已知是谷氨酸棒杆菌株中的可诱导表达***(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007.76：545-552)。将lacIq-Ptac启动子用于所述可诱导表达。所用引物的各序列如下。
SEQ ID NO.12(Vw2-GNA1-5)
5’-AACTGCAGATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGG-3’
SEQ ID NO.13(Vw2-GNA1-3)
5’-GCTCTAGACTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3’
实施例5：使用导入GNA1的谷氨酸棒杆菌CJNAGKO生产N-乙酰葡糖胺
为了使用谷氨酸棒杆菌生产N-乙酰葡糖胺，将葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)导入突变体CJNAGKO中，该突变体在染色体上N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagA1)ORF中具有终止密码子。也就是说，实施例3和4构建的p117-PEFTU-GNA1和pVWEx2-GNA1均被转化到CJNAGKO中，以制备具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)活性而没有N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的菌株。制备的菌株被分别称为CJNAG1(KCCM10967P)和CJNAG2(表1)。
为测试制备的菌株是否生产N-乙酰葡糖胺，制备了只有N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶被失活的的菌株(对照2)和只有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶被扩增的菌株(对照3)，并且用作对照组。野生型谷氨酸棒杆菌也被用作另外的对照组(对照1)。最后，检验N-乙酰葡糖胺是否被生产(表1)。
培养基组成和培养方法如下。将5ml种子培养基(含有5g胰蛋白胨的水溶液、2.5g酵母提取物、5g NaCl、在500ml蒸馏水中的18.5g脑心浸液和在500ml蒸馏水中的91g山梨醇在高压和高温下分别被灭菌，然后彼此混合)放入试管中，然后在其中接种测试菌株，随后在30℃温育12小时。将20ml培养基(基于1L蒸馏水、90g单独灭菌的葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g固体玉米浆、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4 7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g单独灭菌的CaCO3)等分到250ml锥形烧瓶中，然后在其中接种200ul种子培养基，随后在30℃发酵42小时。具体地，当细胞的光密度(OD)在600nm下是1.0时，向用pVWEx2-GNA1转化的‘对照3’和‘CJNAG2’添加100uMIPTG。各菌株使用三个烧瓶进行测试，并且测量平均细胞浓度和N-乙酰葡糖胺浓度。作为发酵的结果，N-乙酰葡糖胺以约1.0g/L或更大的浓度被生产，这与组成性或可诱导表达无关(表1)。对于用棒状杆菌生产NAG，可以使用组成性表达***，而对于用大肠杆菌生产NAG，应仅采用可诱导表达***，其中生长阶段和生产阶段是分离的。
[表1]
葡糖胺可以通过酸处理经由生产的N-乙酰葡糖胺的脱乙酰基作用而生产，这可以通过Novikov V.Y.et al.(Russ.J.Appl.Chem.1997：1467-1470)所述的已知方法进行。通过使用该方法，当生产N-乙酰葡糖胺时，可以容易地额外生产葡糖胺。
从上述描述来看，在本文展示和描述的那些细节中，本发明的各种修改或变化对本领域技术人员而言将变得明显。因此，这些修改和变化明显意图落入所附权利要求的范围内。
关于用于专利步骤的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约
国际形式
CJ第一制糖株式会社 由本页底部确定的国际保藏
5005-GANAMDAEMUN-RO， 机构依照第7.1条发布
CHUNG-KU，首尔，
大韩民国

Claims (7)

1.棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，其具有生产N-乙酰葡糖胺的能力，其中所述微生物具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性和降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性，其中所述葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶组成性地被表达。
2.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶由核酸序列SEQ ID NO.11编码。
3.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述组成性表达由EFTU启动子驱动。
4.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌CJNAG1，以登录号KCCM10967P保藏。
6.生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法，包括如下步骤：
(a)培养权利要求1-5任一项所述的具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物，以及
(b)收集在所述培养步骤中生产的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺。
7.权利要求6所述的方法，其中在步骤(b)收集的N-乙酰葡糖胺被脱乙酰基，以生产葡糖胺。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8734814B2 (en) * 2012-03-02 2014-05-27 Asis Datta Recombinant microorganisms and uses thereof
CN105695350B (zh) * 2016-03-23 2020-02-07 西藏天虹科技股份有限责任公司 酿酒酵母及酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法
US10724015B2 (en) 2016-05-18 2020-07-28 Korea University Research And Business Foundation Microorganism having improved ability to produce N-acetylglucosamine as a result of modulating glycolytic flux
KR101912359B1 (ko) * 2016-05-18 2018-10-26 고려대학교 산학협력단 해당과정 플럭스 조절에 의해 n-아세틸글루코사민 생성능이 향상된 변이 미생물
KR102254635B1 (ko) * 2021-01-27 2021-05-21 씨제이제일제당 주식회사 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003175A2 (en) * 2002-07-01 2004-01-08 Arkion Life Sciences Llc Process and materials for production of glucosamine and n-acetylglucosamine

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920007401B1 (ko) 1990-06-21 1992-08-31 제일제당 주식회사 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터
AU5960498A (en) 1997-01-14 1998-08-03 Bio-Technical Resources Process for production of (n)-glucosamine
US6372457B1 (en) * 1997-01-14 2002-04-16 Arkion Life Sciences Llc Process and materials for production of glucosamine
US20020115639A1 (en) 2001-02-16 2002-08-22 Weiyu Fan Glucosamine and method of making glucosamine from microbial blomass
WO2003035877A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. PROCESSES FOR PRODUCING β-1,3-N-ACETYLGLUCOSAMINE TRANSFERASE AND N-ACETYLGLUCOSAMINE-CONTAINING COMPOSITE SACCHARIDE
US20050042735A1 (en) 2003-04-11 2005-02-24 Ming-De Deng Metabolic engineering for enhanced production of chitin and chitosan in microorganisms
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
JP2008245633A (ja) 2006-05-19 2008-10-16 Agri Bioindustry:Kk 組換えコリネ型細菌および生分解性ポリエステルの製造方法
US20070269872A1 (en) 2006-05-19 2007-11-22 Agribioindustry Inc. Recombinant coryneform bacterium and method for producing diodegradable polyester
US9109242B2 (en) 2006-09-15 2015-08-18 Cj Cheiljedang Corporation Corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003175A2 (en) * 2002-07-01 2004-01-08 Arkion Life Sciences Llc Process and materials for production of glucosamine and n-acetylglucosamine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
gene expression systems in corynebacteria;preeti srivastava et al.;《protein expression and purification》;20050430;第40卷(第2期);摘要 *

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