CN103327987A - 水生动物软骨提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明以从水生动物组织中得到有用的提取物为课题。根据本发明，可以提供含有分子量为250万以上的蛋白多糖的鱼类软骨水提取物。该提取物对皮肤具有优异的抗老化效果（特别是抗炎症效果、皮肤屏障功能改善效果、皮肤保水性改善效果）。而且，本发明的鱼类软骨水提取物，不仅可以通过涂敷在皮肤上来起到该效果，也可以通过口服摄取来起到该效果。

Description

水生动物软骨提取物
技术领域
本发明涉及水生动物软骨提取物。更详细而言，本发明涉及含有高分子量蛋白多糖的水生软骨提取物。
背景技术
蛋白多糖是与胶原蛋白等一起形成***的细胞外基质中的基质的主要生物高分子。以往，蛋白多糖是通过将哺乳动物（特别是牛）的软骨中所含的物质提取分离而得到，然而，由于报告过牛脑海绵状症（BSE）的发病，因此希望避免从哺乳动物软骨中提取，需要将其取而代之的蛋白多糖供给源。此外，以往的蛋白多糖提取工序烦杂而且产量不高，因此制造成本非常高，不能充分地实现工业应用，因此需要一种更加简便而且产量高的制造方法。
水生动物组织是有力的蛋白多糖供给源替代候选。尝试过提取作为水生动物的鲸、鲨鱼的软骨中所含的蛋白多糖。但是，这些水生动物的捕获量存在限制，很难制造大量的蛋白多糖。此外，提取分离操作也很烦杂，提取所用的溶剂等中存在有高毒性的物质等。
为了解决这些问题，尝试过从大量废弃的水生动物组织中提取蛋白多糖。例如，专利文献1中记载有使用鲑鱼的鼻软骨来制造包含蛋白多糖的组合物（鼻软骨粉末）的方法。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009－173702号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明以高效地从水生动物组织中提取蛋白多糖为课题。
用于解决课题的方法
本发明人等惊奇地发现如下方法，即，能够使用水从作为水生动物的鱼类的软骨中提取蛋白多糖的方法。而且，发现与通过现有的方法得到的鱼类软骨提取物中所含有的蛋白多糖相比，通过该方法从鱼类软骨中提取的鱼类软骨水提取物含有高分子量的蛋白多糖，还发现该高分子量的蛋白多糖具有优异的效果。本发明是在这些见解的基础上做了进一步的改良而完成的。
即，本发明包含例如以下项目所述的主题。
项目1.
一种鱼类软骨水提取物，其含有分子量为180万以上的蛋白多糖。
项目2.
根据项目1所述的鱼类软骨水提取物，其含有分子量为250万以上的蛋白多糖。
项目3.
根据项目2所述的鱼类软骨水提取物，其含有分子量为500万以上的蛋白多糖。
项目4.
根据项目3所述的鱼类软骨水提取物，其中，分子量为500万以上的蛋白多糖以干燥质量换算，包含9质量%以上。
项目5－1.
根据项目1～4中任意一项中所述的鱼类软骨水提取物，其中，胶原蛋白以干燥质量换算，包含在30质量%以上。
项目5－2.
根据项目1～5－1中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，分子量为250万以上的蛋白多糖所包含的糖醛酸量，占提取物中所包含的糖醛酸总量的10%以上。
项目5－3.
根据项目1～5－2中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，提取物中所包含的糖醛酸量以干燥质量换算，相对于提取物总量为10质量%以上。
项目6－1.
根据项目1～5中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，鱼类为鲑鱼或鳟鱼。
项目6－2.
根据项目1～6－1中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，软骨为鼻软骨。
项目7－1.
一种外用组合物或口服组合物，其包含项目1～6－2中任意一项所述的鱼类软骨水提取物。
项目7－2.
一种饮食品组合物、口腔用组合物、或化妆品组合物，其包含项目1～6－2中任意一项所述的鱼类软骨水提取物。
项目8－1.
根据项目7－1或7－2所述的组合物，其为炎症改善用或抗老化用。
项目8－2.
根据项目1～6－2中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其为炎症改善用或抗老化用。
项目9－1.
根据项目1～6－2中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其使用70℃～100℃的水而被提取出。
项目9－2.
根据项目9－1所述的鱼类软骨水提取物，其使用70℃～100℃的水经过3～4小时而被提取出。
项目10－1.
一种被分离的分子量为500万以上的蛋白多糖。
项目10－2.
一种被分离的分子量为500万以上的源自鱼类软骨的蛋白多糖。
发明的效果
与通过现有方法得到的鱼类软骨提取物中所含有的蛋白多糖相比，本发明的鱼类软骨水提取物含有高分子量的蛋白多糖。而且，本发明的鱼类软骨水提取物对皮肤有优异的抗老化效果（特别是抗炎效果、皮肤屏障功能改善效果、皮肤保水性改善效果）。而且，本发明的鱼类软骨水提取物，不仅可以通过涂敷在皮肤上来起到该效果，也可以通过口服摄取来起到该效果。
附图说明
图1a为置于托盘中的冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片。
图1b为置于塑料袋中的冷冻鲑鱼鼻软骨小片的照片。
图1c为置于塑料袋中的脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的照片。
图2为表示在冷冻鲑鱼鼻软骨小片中加入水并在100℃下提取时的蛋白多糖产量随时间的变化的图表。需要说明的是，该产量是每1g冷冻鲑鱼鼻软骨的值。
图3为对由脱脂鲑鱼鼻软骨粉末（粉末），冷冻鲑鱼鼻软骨块（块）或者冷冻鲑鱼鼻软骨小片（小片）提取蛋白多糖时的糖醛酸（以GlcA表示）及蛋白质（以Protein表示）的产量进行比较图表。将GlcA及Protein的产量值换算为由每100g冷冻鲑鱼鼻软骨块提取的情形。需要说明的是，糖醛酸量反映蛋白多糖量。
图4a表示将利用凝胶过滤色谱法解析本发明的鱼类软骨水提取物的一例（样品No.10）而得到的糖醛酸量色谱图及280nm蛋白质量色谱图叠加绘制而成的图。
图4b表示利用凝胶过滤色谱法解析本发明的鱼类软骨水提取物的一例（样品No.10）而得到的糖醛酸量色谱图及洗脱了各分子量标记物的馏分的位置。
图5表示利用离子交换色谱法色谱法解析本发明的鱼类软骨水提取物的一例（样品No.10）而得到的糖醛酸量色谱图。
图6表示利用凝胶过滤色谱法解析图5的蛋白多糖部分而得到的糖醛酸量色谱图及280nm蛋白质量色谱图。
图7表示通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物的一例（样品No.10），来研究是否获得炎症改善效果的结果。左侧的图表表示UVB照射4周后的结果，右侧的图表表示UVB照射7周后的结果。
图8表示通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物的一例（样品No.10），来研究是否获得皮肤屏障功能增强及改善效果的结果。左侧的图表表示UVB照射4周后的结果，右侧的图表表示UVB照射7周后的结果。
图9表示通过口服摄取样品No.10、以及进一步精制样品No.10而得到的PG－1提取物及PG－2提取物，来研究是否获得炎症改善效果的结果。左侧的图表表示UVB照射4周后的结果，右侧的图表表示UVB照射7周后的结果。
图10表示通过口服摄取样品No.10、以及进一步精制样品No.10而得到的PG－1提取物及PG－2提取物，来研究是否获得皮肤屏障功能增强及改善效果的结果。左侧的图表表示显示UVB照射4周后的结果，右侧的图表表示UVB照射7周后的结果。
图11表示通过口服摄取样品No.10、以及进一步精制样品No.10而得到的PG－1提取物及PG－2提取物，来研究是否获得皮肤保水性增强及改善效果的结果。左侧的图表表示UVB照射4周后的结果，右侧的图表表示UVB照射7周后的结果。
图12表示通过口服摄取样品No.10，来研究是否获得皮肤屏障功能增强及改善效果的临床试验结果。
图13表示通过口服摄取样品No.10，来研究是否获得皮肤保水性增强及改善效果的临床试验结果。
图14表示添加了在50℃、70℃、90℃、100℃及100℃过热的温度条件下提取出的提取物、及市售品A的情况下的细胞增殖试验结果。*表示相对于对照，在0.1%显著性水平下观察到显著差异。
具体实施方式
以下，对本发明进行进一步的详细说明。需要说明的是，在本说明书中，“质量”与“重量”可以替换。
蛋白多糖是具有使糖胺聚糖（粘多糖）及蛋白质结合而成的结构的化合物。糖胺聚糖是具有2糖的重复结构的酸性糖，具体而言，可以列举出硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素等。这些酸性糖成分所具有的2糖的重复结构中，通常该2糖中的1个是氨基糖、另一个是糖醛酸。因此，在蛋白多糖的检测时，可以使用作为糖醛酸检测法的常用方法之一的咔唑硫酸法。
此外，对于蛋白质，将该糖胺聚糖呈梳齿状键合的化合物称为蛋白多糖单体（将蛋白多糖单体中的该蛋白质称为核心蛋白质。）。特别是认为在生物体内，该蛋白多糖单体经由链接蛋白与透明质酸键合而形成聚集体，将该聚集体称为蛋白多糖集合体（proteoglycan aggregate）。本说明书中的术语“蛋白多糖”包含蛋白多糖单体及蛋白多糖集合体的意思。需要说明的是，透明质酸也是糖胺聚糖的一种。
本发明的鱼类软骨水提取物包含高分子量蛋白多糖。这里的高分子量蛋白多糖具体而言是指分子量为180万以上的蛋白多糖，优选分子量为250万以上、300万以上、400万以上、500万以上、600万以上、700万以上、800万以上、900万以上、1000万以上、1100万以上、1200万以上、1300万以上、1400万以上、1500万以上、1600万以上、1700万以上、1800万以上、1900万以上、或2000万以上的蛋白多糖。优选分子量大的蛋白多糖，特别优选分子量为500万以上。利用下述条件的凝胶过滤色谱法处理本发明的鱼类软骨水提取物，使用咔唑硫酸法对所得到的各馏分中包含的糖醛酸量（反映蛋白多糖量）进行定量，根据该糖醛酸量制作色谱图，由此可以确认上述分子量以上的蛋白多糖的存在。以下，有时将这样的基于糖醛酸量的色谱图称为“糖醛酸量色谱图”。此外，测定各馏分的280nm下的吸光度，使所包含的蛋白质量相对值化（即，成为反映所包含的蛋白质量的值），从而能够绘制出基于该吸光度的色谱图。以下，有时将这样的色谱图称为“280nm蛋白质量色谱图”。
〔凝胶过滤色谱法条件〕
色谱柱：Sepharose CL－2B填充色谱柱（以Sepharose CL－2B作为载体而填充到Φ1cm×50cm的色谱柱中而成。Sepharose CL－2B的葡聚糖的分级范围为100～20000kDa，可以从GE Healthcare公司等获得。Sepharose CL－2B为2%交联琼脂糖，粒径为60～200μm（由激光衍射散射法得到）、CAS注册号为65099－79－8。）
缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（pH 7.1，含有0.2M的NaCl）
应用样品量：鱼类软骨水提取物4mg（以干燥质量换算）（溶解于1mL缓冲液中使用）
流速：0.15mL/min
各馏分量：1mL/试管
分子量校正曲线：对于下述各种葡聚糖分子量标记物，在与上述同样的条件下进行凝胶过滤色谱法处理，利用用于糖检测的公知方法即苯酚·硫酸法，测定各馏分的吸光度（反映葡聚糖量），找出洗脱了各标记物的馏分，制作出反映该条件下凝胶过滤色谱法的各馏分中包含的成分的分子量的校正曲线。“洗脱了各标记物的馏分”是指最多量的各标记物被洗脱的馏分。换言之，是指相当于色谱图中的峰顶的馏分，所述色谱图反映对各葡聚糖分子量标记物进行凝胶过滤时的葡聚糖量。
<葡聚糖分子量标记物>
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（来自肠膜明串珠菌的葡聚糖）（mol wt 5000000－40000000）（SIGMA）…色谱柱的void volume（空隙容积）用、20000kDa
Dextran Standard（葡聚糖标准品）1400000（SIGMA）…1400kDa
Dextran Standard 670000（SIGMA）…670kDa
Dextran Standard 410000（SIGMA）…410kDa
Dextran Standard 270000（SIGMA）…270kDa
其中，对于Dextran from Leuconostoc mesenteroides，在进行了将其所包含的低分子的葡聚糖除去的前处理之后，作为标记物使用。该前处理如下进行：通过上述的〔凝胶过滤色谱法条件〕使Dextran from Leuconostocmesenteroides其本身洗脱，回收分子量为20000kDa以上的分子，使其冷冻干燥。具体而言，利用苯酚·硫酸法测量各馏分的吸光度，并制作出反映葡聚糖量的色谱图，在该色谱图中，将相当于最先出现的峰的馏分回收，将其冷冻干燥（认为由此可以将分子量为20000kDa以上的分子回收并冷冻干燥）。实际上，将该冷冻干燥物用作标记物（色谱柱的void volume测定用）。
按照Hodge,J.E.and Hofreiter,B.T.,Method in CarbohydrateChemistry,1338（1962）中记载的方法（苯酚·硫酸法），进行用于获得反映葡聚糖量的色谱图的吸光度测定。具体而言，如下所述来进行。
〔1〕在105×15mm的试管中加入500μl的试样水溶液。
〔2〕加入500μl的苯酚试剂（5v/v%苯酚水溶液），并进行搅拌。
〔3〕加入2.5mL的浓硫酸，立即剧烈搅拌10秒钟。
〔4〕室温下放置20分钟以上。
〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。
需要说明的是，咔唑硫酸法是一种公知的方法，其将作为糖醛酸（葡萄糖醛酸（GlcA）、艾杜糖醛酸等）的显色色素的咔唑溶液添加至测定检体样中，使用分光光度计测定吸光度，并基于该吸光度算出糖醛酸量。使用规定浓度的葡萄糖醛酸标准溶液制作出校正曲线，求出检体中的葡萄糖醛酸含量。更具体而言，按下述方法进行。将0.95g的硼酸钠·10水合物溶解在100mL的浓硫酸中得到试剂，用试管取2.5mL该试剂，进行冰冷。接着在其上轻轻地重叠0.5mL被检物（优选包含2～20μg的糖醛酸）。在水冷的同时充分进行搅拌，以使其温度不会达到室温以上。用玻璃球将其盖上后，在沸水浴中加热10分钟，水冷至室温。在其中加入将125mg咔唑溶解于100mL无水甲醇中而得的试剂0.1mL并进行混合，然后在沸水浴中加热15分钟。之后，水冷至室温，测定530nm的吸光度。使用0.5mL的蒸馏水作为空白对照。同时，使用葡萄糖醛酸制作出校正曲线。（下述实施例的咔唑硫酸法也按照此处记载的方法进行。）
以干燥质量换算，本发明的鱼类软骨水提取物中包含的全部糖醛酸量（通过咔唑硫酸法定量）中，优选10质量%以上是源自分子量为250万以上的蛋白多糖的糖醛酸。换言之，就本发明的鱼类软骨水提取物而言，以干燥质量换算，优选分子量为250万以上的蛋白多糖所包含的糖醛酸量占提取物所包含的糖醛酸总量的10质量%以上。更优选为15质量%以上、20质量%以上、25质量%以上、30质量%以上、35质量%以上、40质量%以上、45质量%以上、50质量%以上、55质量%以上、或60质量%以上。该比例越大越优选。此外，就本发明的鱼类软骨水提取物而言，以干燥质量换算，优选分子量为500万以上的蛋白多糖所包含的糖醛酸量占提取物所包含的糖醛酸总量的7质量%以上。更优选为10质量%以上、13质量%以上、16质量%以上、20质量%以上、24质量%以上、27质量%以上、30质量%以上、34质量%以上、37质量%以上、或40质量%以上。该比例越大越优选。
需要说明的是，就特定的分子量（假设为X）以上的蛋白多糖所包含的糖醛酸量而言，其在提取物中所包含的糖醛酸总量中占何种程度的比例，可以由上述糖醛酸量色谱图的峰面积求出。具体而言，相对于该糖醛酸量色谱图的峰面积总体，只要求出分子量X以上的糖醛酸所占的面积比例即可。更具体而言，在以糖醛酸量为纵轴、以馏分No.为横轴的糖醛酸量色谱图中，以穿过包含分子量X的蛋白多糖的馏分的方式作垂线，在被该垂线分割的峰部分中，只要求出包含分子量较大的蛋白多糖的峰部分的面积在峰整体的面积中占何种比例即可。
此外，本发明的鱼类软骨水提取物中所包含的糖醛酸量（通过咔唑硫酸法测定）以干燥质量换算，为该提取物的5质量%以上，更优选为10质量%以上，进一步优选为15质量%以上，更进一步优选为20质量%以上，特别优选为25质量%以上。需要说明的是，在本说明书（特别是图表）中，在表示糖醛酸量时，有时用葡萄糖醛酸的简记GlcA、例如“GlcA（μg）”等来表示。
此外，在本发明的鱼类软骨水提取物中，分子量为180万以上的蛋白多糖，以干燥质量换算，在该提取物中优选包含30质量%以上，更优选包含35质量%以上。
而且，在本发明的鱼类软骨水提取物中，分子量为500万以上的蛋白多糖，以干燥质量换算，在该提取物中优选包含5质量%以上、10质量%以上、15质量%以上、20质量%以上、25质量%以上、30质量%以上、或35质量%以上。该含有比率越大越优选。
此外，本发明的鱼类软骨水提取物的脂质含量少。本发明的鱼类软骨水提取物所包含的脂质量与蛋白多糖量的质量比（脂质量/蛋白多糖量），优选小于该提取物的原料即鱼类软骨所包含的脂质量与蛋白多糖量的质量比（脂质量/蛋白多糖量）。本发明的鱼类软骨水提取物的脂质含量，以干燥质量换算，优选为5质量%以下，更优选为4质量%以下，进一步优选为3质量%以下，进一步更优选为2质量%以下，特别优选为1质量%以下。这样的鱼类软骨水提取物如后所述，可以通过将作为提取物原料的鱼类软骨脱脂（即除去脂肪）后再使用而得到。此外，也可以通过利用公知的脱脂方法进一步对提取物进行脱脂后而得到。
此外，就本发明的鱼类软骨提取物而言，优选其所包含的蛋白质量中的大部分是胶原蛋白（优选II型胶原蛋白）。具体而言，所包含的蛋白质量的优选80质量%以上、更优选85质量%以上，优选是胶原蛋白。需要说明的是，本发明的鱼类软骨提取物中所包含的胶原蛋白量，以干燥质量换算，优选为30质量%以上，更优选为30～60质量%。
此外，本发明的鱼类软骨提取物中所包含的灰分，以干燥质量换算，优选为15质量%以下，更优选为5～15质量%，进一步优选为5～10质量%。
需要说明的是，该蛋白质量为如下求出的值：通过凯氏定氮法测定样品中的氮量，再从该氮量中减去源自糖胺聚糖的氮量后所得值（即，该蛋白质量是不包括源自蛋白多糖的蛋白质量的值）。此外，该灰分是通过直接灰化法计算出的值。此外，该胶原蛋白量为如下求出的值：通过氨基酸自动分析法（HPLC法）测定样品中的羟基脯氨酸的量，再设定胶原蛋白中包含6.7%的羟基脯氨酸来进行计算。
本发明的鱼类软骨水提取物提取自鱼类软骨（鱼类的软骨）。作为鱼类，优选鲑鱼科鲑鱼属的鱼，具体而言例示有鳟鱼（细鳞大马哈鱼，樱鳟，五月鳟等）、鲑鱼（白鲑，红鲑，银鲑，大鳞大马哈鱼，虹鳟等）等。此外，也可以使用鲨鱼，鳕鱼的等。特别优选鲑鱼或鳟鱼。此外，软骨没有特别限制，但是优选头部软骨，尤其是鼻软骨。此外，因为在将鱼类加工成食品产品等时通常将头部废弃，所以具有头部软骨的获得成本低，可以大量且稳定供给的优点。
使用水来进行提取。就鱼类软骨而言，可以将从生物体收集到的软骨直接供于提取，也可以将其微细化（更具而言，小片化或者粉末化）后再供于提取。此外，如下所述，也可以在提取前使用乙醇等有机溶剂对鱼类软骨实施脱脂处理。这样，可以使用水对蛋白多糖（包含高分子量蛋白多糖）进行提取。即，本发明的鱼类软骨水提取物可以优选利用水从鱼类软骨中提取而得到。此外，或者在进行水提取时，在加热水的同时进行提取，或者使用热水或沸水，由此可以高效率且更有效地得到鱼类软骨水提取物。
小片化鱼类软骨是将鱼类软骨小片化而成。小片化可以利用公知的方法进行。例如，使用公知的搅拌器或研磨机等机器，将鱼类软骨（优选冷冻鱼类软骨）化为小片。小片化操作优选尽可能地在低温下进行。例如，优选为能够使小片化后的鱼类软骨保持冷冻状态的温度。具体而言可以例示出0℃以下。
此外，从提取效率的观点出发，小片化鱼类软骨优选为冷冻了的小片化鱼类软骨（冷冻小片化鱼类软骨）。冷冻小片化鱼类软骨可以通过（i）将鱼类软骨冷冻后使其小片化、或者（ii）将鱼类软骨小片化后再进行冷冻而获得，但特别优选通过（i）来获得。冷冻方法没有特别限制，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，在－20～－80℃左右将鱼类软骨保存24～72小时左右的方法。
每1小片的小片化鱼类软骨或冷冻小片化鱼类软骨优选为0.001～0.5g左右，更优选为0.005～0.3g左右，进一步优选为0.01～0.1g左右。优选以可以得到这样的小片的方式进行小片化操作（通过对使用机器条件进行研究，可得到这样的小片的机器使用条件可以简单地决定）。
粉末化鱼类软骨是将鱼类软骨粉末化而得的产物（鱼类软骨粉末）。粉末化可以通过公知的方法进行。例如，可以使用公知的搅拌器或研磨机等机器，将鱼类软骨（优选冷冻鱼类软骨）粉末化。粉末化操作优选尽可能在低温（例如4℃以下）下进行。
此外，从提取效率方面出发，粉末化鱼类软骨优选为冷冻了的粉末化鱼类软骨（冷冻粉末化鱼类软骨）。冷东化鱼类软骨可以通过（i’）将鱼类软骨冷冻后使其粉末化、或者（ii’）将鱼类软骨粉末化后再进行冷冻而获得，但特别优选通过（i’）来获得。冷冻方法没有特别限制，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，在－20～－80℃左右将鱼类软骨保存24～72小时左右的方法。
需要说明的是，与“小片”相比，“粉末”虽然指小的物质，但是并不是想明确地区分两者。将鱼类软骨微细化后的产物中，将比较大的碎片称为“小片”，将比较小的碎片称为“粉末”。因此，虽没有特别限制，但作为粉末，希望是包含具有如下粒径的粒子的粉末，即，约10～1000μm左右，优选50～500μm左右，更优选100～200μm左右（通过激光衍射散射法来测定）。优选粉末中含有大量（例如，为50质量%以上，优选为70质量%以上）的具有这样的粒径的粒子。
就所使用的小片化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨而言，可以使用已脱脂（即，除去脂肪）的鱼类软骨。即，也可以使用小片化脱脂鱼类软骨或粉末化脱脂鱼类软骨。其原因在于，通过使用经脱脂处理后的鱼类软骨，可以得到脂质的混入较少的提纯度高的鱼类软骨水提取物。小片化脱脂鱼类软骨或粉末化脱脂鱼类软骨可以通过（α）将脱脂处理后的鱼类软骨小片化或者粉末化、或者（β）将鱼类软骨小片化或粉末化后进行脱脂处理而获得。
脱脂方法可以使用公知的方法。例如，作为在上述（α）中对鱼类软骨进行脱脂处理的方法，例如，可以例示出将鱼类软骨用流水（例如来自自来水的水龙头的流水）漂洗1～24小时左右的方法。此外，鱼类软骨的获取可以通过公知的方法进行，例如可以例示出如下方法：将鱼类组织（优选鱼类头部）在水中浸渍1～24小时左右使其膨胀，除去软骨（优选鼻软骨）之外的组织的方法；或者，将冷冻鲑鱼头部解冻后，立刻取出鼻软骨，然后用流水漂洗1～24小时左右进行洗涤及脱脂的方法。在残存有肉片等的情况下，优选使用镊子等除去残存的肉片等。需要说明的是，考虑到在该阶段鱼类软骨并没有被小片化或粉末化，因此即使用流水漂洗，也几乎无法提取出蛋白多糖。此外，在下述（β）的情况下也是一样，可以使用使用有机溶剂提取除去脂质的方法。
此外，例如，在上述（β）中，作为对小片化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨进行脱脂处理的方法，例如可例示出使用有机溶剂提取除去脂质的方法。作为有机溶剂，可例示出乙醇、己烷、丙酮等。更具体而言，作为上述（β）的方法，可以优选使用专利文献1（日本特开2009－173702号公报）中记载的方法。即，例如，通过包含以下工序A～E的方法，得到粉末化脱脂鱼类软骨，可以优选将其用于本发明（更详细的条件已记载于专利文献1中）。
A.将冷冻了的水生动物组织（鱼类组织）粉碎，在其中加入水，在温度0～20℃、pH4.8～7下进行处理的工序
B.对A的固液混合物进行离心分离，除去最上部的脂质层和中间层的水层，回收沉淀物的工序
C.使沉淀物干燥，并进行微粉末化的工序
D.在所得到的干燥微粉末中加入己烷、丙酮或乙醇作为溶剂，提取除去残存脂质的工序
E.除去溶剂的工序
需要说明的是，进一步优选使用已实施了冷冻处理及脱脂处理两者的小片化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨（冷冻小片化脱脂鱼类软骨或冷冻粉末化脱脂鱼类软骨）。它们例如可以通过将脱脂处理后的鱼类软骨冷冻，再将其小片化或粉末化而得到。
鱼类软骨、优选小片化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨（以下统称为“微细化鱼类软骨”）被供于进行水提取。作为水提取时使用的水（以下，有时称为“提取水”），举例可例示出Milli－Q水、蒸馏水、去离子水、精制水、自来水等。此外，提取水的pH通常为5.5～8.0左右，优选为pH6.0～7.5左右，更优选为pH6.5～7.5左右。并不优选溶解了酸、碱、碱类等使pH大幅变动的物质的溶剂。需要说明的是，如果将有机酸或无机酸等酸化合物、或者氢氧化钠等碱化合物添加到提取水中，高分子量蛋白多糖（特别是分子量超过1000万的高分子量蛋白多糖）减少或消失，因此优选不添加酸化合物或碱化合物。需要说明的是，虽然并非是限定性的解释，但是推测酸化合物或碱化合物的影响，可能是提取处理中蛋白多糖集合体崩坏的原因。
水提取，例如可以通过将鱼类软骨在水中浸渍适当的时间（例如30分钟以上、优选30分钟～24小时左右、更优选1～12小时左右、进一步优选2～6小时左右、更进一步优选3～4小时左右）来进行。水的量没有特别限制，例如可例示出供于提取的小片化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨全部浸在水中的程度的量。水提取时，可以静置，也可以进行搅拌。优选进行搅拌。此外，提取时的水温没有特别限制，优选为50℃以上，更优选为70℃以上。因此，既可以在提取时进行加热，也可以在提取前预先加热。加热温度（即使用的水温），具体而言例示出优选为50～100℃左右、更优选为70～100℃左右、进一步优选为80～100℃左右。此外，也可以在加压下加热。此外，在进行加热的情况下，由于担心高分子量蛋白多糖因热分解，因此可以在提取处理中更换加热了的提取水。更换提取水的情况下，各提取水的提取时间间隔，例如例示为每隔15分钟～4小时，优选每隔30分钟～2小时或1小时左右。作为优选的一种方案，可以列举出如下的方法：在鱼类软骨中加入可以将其总量浸渍的水（优选加热了的水），在加热的同时静置或搅拌3～4小时。此外，作为其他的一种方案，可以列举出如下的方法：将“在鱼类软骨中加入可以将其总量浸渍的水（优选加热了的水），在加热的同时静置1小时，将该水回收”这样的工序重复4次（这种情况下，合计进行了4小时的水提取）。
水提取后，回收液体部分，从而可以得到鱼类软骨水提取物。液体部分的回收可以通过实施例如离心分离（例如可例示5000rpm、20分钟、4℃下的离心分离）处理或连续离心分离处理等、再回收上清液来进行。既可以将该液体（上清液）直接作为本发明的鱼类软骨水提取物来使用，也可以通过公知方法进一步将其精制（例如脱脂）后使用。或者，也可以通过减压蒸馏法等进行浓缩。此外，或者，也可以通过冷冻干燥法或喷雾干燥法等，进行干燥或粉末化。这样的本发明的鱼类软骨水提取物，例如可以优选用作食品、化妆品、口腔用组合物、医药品等的原材料。
本发明的鱼类软骨水提取物，特别优选用于皮肤的抗老化。皮肤因各种原因而每天受到伤害。例如，在表皮层中，表皮屏障功能会因外在的原因（例如紫外线等光照射等）或内在的原因（例如老龄化等）而降低，经表皮透过蒸腾水分量（transepidermal water loss：TEWL）上升。因此，皮肤变干燥，或引起皮肤粗糙等。此外，因同样的理由，在真皮中，会引起胶原蛋白产生能力降低、皮肤弹性下降、真皮层的肥厚等，皮肤变得僵硬化。因此，皮肤发生皱纹等。
本发明的鱼类软骨水提取物，具有抑制及改善这样的皮肤症状的效果（抗炎症效果、皮肤屏障功能改善效果、皮肤保水性改善效果、细胞增殖促进效果），特别是可以优选用于光（尤其是紫外线）照射（暴露）引起的上述皮肤症状的预防及改善。需要说明的是，就细胞增殖促进效果而言，特别是如果提取时的提取温度发生变化，则效果的大小也会发生变化。认为其原因在于，由于提取温度发生变化，因此鱼类软骨水提取物的组成发生变化。
本发明的鱼类软骨水提取物，其使用方式没有特别限制。本发明的鱼类软骨水提取物通过涂敷、或口服摄取，均可取得上述效果，所以适宜用作外用组合物或口服组合物。即，优选以包含本发明的鱼类软骨水提取物的外用组合物或口服组合物的形式来使用。这些组合物可以用作医药品组合物、准医药品组合物、口腔用组合物、化妆品组合物、食品组合物等。它们可以通过使用本发明的鱼类软骨水提取物并利用常用方法来制造。特别是这些组合物可以优选用于口腔护理领域、皮肤护理领域、毛发护理领域及保健领域。
就口腔护理领域所使用的、包含本发明的鱼类软骨水提取物的口腔用组合物（以下，有时记为“本发明所涉及的口腔用组合物”）而言，其既可以是本发明的鱼类软骨水提取物本身，也可以是将该提取物与口腔用组合物所使用的其他成分（例如研磨剂、粘合剂、表面活性剂、赋形剂、湿润剂、pH调节剂、增稠剂、甜味剂、防腐剂、药效成分、着色剂、香味剂等）研磨剂、发泡剂、洗涤剂、表面活性剂、湿润剂、pH调节剂、增稠剂、香味剂等）适宜配合制造而得的组合物。例如，可以通过常用方法制造成糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂敷剂、喷雾剂、填补剂、液态剂、漱口水、贴剂、口嚼剂、含片、片剂等形态。
优选将这样的本发明所涉及的口腔用组合物用作口腔组织的炎症改善用、抗老化用、干燥预防/改善用。即，本发明所涉及的口腔用组合物包括炎症改善用口腔用组合物、抗老化用口腔用组合物、组织修复用口腔用组合物、口腔干燥预防/改善口腔用组合物。
就毛发护理领域或皮肤护理领域所使用的、包含本发明的鱼类软骨水提取物的化妆品组合物（以下，有时记为“本发明所涉及的化妆品组合物”）而言，其既可以是本发明的鱼类软骨水提取物本身，也可以是将该提取物与容许用于化妆品的表面活性剂、湿润剂、高分子剂、粉体、酯类、醇类、动植物油脂、药剂、防腐剂、着色剂、香料、其他容许用于化妆品的成分、材料适宜配合并通过常用方法制造而得的组合物。具体而言，可以列举出：配合本发明的鱼类软骨水提取物而制造的育毛剂、生发剂、乳液、化妆水、乳霜、美容液、面霜、面膜、防晒霜等。这样的本发明所涉及的化妆品组合物可以优选用作炎症改善用或抗老化用、保湿用，更具体而言，例如可以优选用作育毛用、头皮保养用、防晒用、晒后修复用、保湿用及抗皮肤老化用（例如干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等的预防或改善）。
就保健领域所使用的、包含本发明的鱼类软骨水提取物的饮食品组合物（饮料及食品）（以下，有时记为“本发明所涉及的饮食品组合物”）而言，其既可以是本发明的鱼类软骨水提取物本身，也可以是将该提取物与食品卫生学上所容许的基剂、载体、添加剂、其他可利用于食品的成分·材料等适宜配合而得的组合物。例如，可以例示出：包含本发明的鱼类软骨水提取物的保湿用以及抗皮肤老化用（例如，干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等的预防或改善用）的加工食品、饮料、营养补充食品、特殊用途食品（病人用食品、特定保健用食品、吞咽困难者用食品等）、美容食品等。而且，含有这样的本发明所涉及的饮食品组合物的保湿剂、抗皮肤老化剂也包含在本发明中。该保湿剂、抗皮肤老化剂，可以以美容用或抗皮肤老化用（例如，干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等的预防或改善用）的饮用剂、锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶冻剂、糖锭剂、浆糊剂、粘稠剂、粉末剂、条块（block bar）等形态来供给。
在包含本发明的鱼类软骨水提取物的外用组合物或者口服组合物（特别是，本发明所涉及的口腔用组合物、化妆品组合物、或饮食品组合物）中，虽然没有特别限制，但这些组合物所包含的鱼类软骨水提取物量，例如相对于组合物整体通常为0.0001～100质量%，优选为0.001～50质量%，更优选为0.005～30质量%，更进一步优选为0.01～20质量%。此外，组合物中所包含的、源自分子量为250万以上的蛋白多糖的糖醛酸的量，例如相对于组合物整体为0.00001～10质量%，优选为0.0001～5质量%，进一步优选为0.0005～1质量%左右。
此外，本发明还包含获得本说明书中记载的效果的方法，所述方法包括：通过将本发明的鱼类软骨水提取物涂敷于皮肤或口腔内，从而改善皮肤或口腔内炎症的方法；或者通过将本发明的鱼类软骨水提取物涂敷于皮肤或口腔内，从而增强或改善屏障功能的方法；通过将本发明的鱼类软骨水提取物涂敷于皮肤或口腔内，从而促进细胞（特别是成纤维细胞）增殖的方法等。该方法中，可以直接使用本发明的鱼类软骨水提取物。此外，可以优选使用上述外用组合物、或者本发明所涉及的口腔用组合物或化妆品组合物。该方法适用的对象没有特别限制，特别优选具有炎症的对象、或因老化或日晒而导致皮肤屏障功能下降的对象。此外，也可以适用于美容目的而非治疗目的。特别是可以优选适用于为了增强屏障功能的美容目的。对象优选为包含人类的哺乳动物。即，不只是人类，也可以是非人类的哺乳动物。作为非人类的哺乳动物，例如可以例示宠物、家畜，更具体而言，例示有狗、猫、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、牛、马、猪、绵羊、山羊、羊驼、骆驼等。适用量没有特别限制，可以适当设定必需量。特别是在适用于人类的情况下，例如希望以如下方式调节多糖蛋白来设定所适用的鱼类软骨水提取物的量，即，使源自分子量为250万以上（进一步优选500万以上）的高分子量蛋白多糖的糖醛酸量达到成人每天优选0.1～500mg左右、更优选0.5～250mg左右、进一步优选1～100mg左右。
而且，本发明还包含获得本说明书中记载的效果的方法，所述方法包括：通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物，从而改善皮肤或口腔内炎症的方法；或者通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物，从而增强·改善屏障功能的方法；通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物，从而抑制皮肤的肥厚的方法；通过口服摄取本发明的鱼类软骨水提取物，从而改善皮肤保水性的方法等。该方法中，可以直接使用本发明的鱼类软骨水提取物。此外，可以优选使用上述口服组合物、或本发明所涉及的饮食品组合物。而且，可以优选使用包含本发明的鱼类软骨水提取物的医药品组合物。该方法适用的对象没有特别限制，特别优选出现炎症的对象、或因老化或日晒而导致皮肤屏障功能下降的对象、皮肤保水性下降的对象等。此外，也可以适用于美容目的。对象优选为包含人类的哺乳动物。即，不只是人类，也可以是非人类的哺乳动物。作为非人类的哺乳动物，例如可以例示宠物或家畜，更具体而言，例示有狗、猫、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、牛、马、猪、绵羊、山羊、羊驼、骆驼等。适用量没有特别限制，可以适当设定必需量。特别是在适用于人类的情况下，例如希望以如下方式调节多糖蛋白来设定所适用的鱼类软骨水提取物的量，即，使源自分子量为250万以上（进一步优选500万以上）的高分子量蛋白多糖的糖醛酸量达到成人每天优选0.2～1000mg左右、更优选1～800mg左右、进一步优选2～500mg左右。
实施例
以下，对本发明作更具体的说明，但是本发明并不限定于下述的示例。
来自鲑鱼鼻软骨的蛋白多糖的提取研究
<提取所使用的试样>
将以下3种（（1）～（3））源自鲑鱼鼻软骨的试样用于蛋白多糖的提取研究。需要说明的是，作为鲑鱼鼻软骨，使用如下得到的鲑鱼鼻软骨：将冷冻鲑鱼头部解冻后，立刻取出鼻软骨，然后用流水漂洗6小时来进行洗涤及脱脂，之后，用镊子除去肉片等再用手水洗而得到。
(1)冷冻鲑鱼鼻软骨块
将鲑鱼鼻软骨保存在冷冻机中并使其冷冻，将其用作冷冻鲑鱼鼻软骨块。需要说明的是，虽然冷冻鲑鱼鼻软骨块的大小和重量与所使用的鲑鱼头部的大小有关，但冷冻鲑鱼鼻软骨块大致是大小为2.5×1.5～4.5×2cm、重量为1.71～6.91g的块体（每7个的平均重量为3.701g）。将冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片示于图1a。
（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片
将（1）的冷冻鲑鱼鼻软骨块置于搅拌器中粉碎10秒钟，得到冷冻鲑鱼鼻软骨小片。将冷冻鲑鱼鼻软骨小片的照片示于图1b。需要说明的是，随机选取20小片，检查各小片的大小及重量，其大小大致为0.2～0.7cm，质量约为0.0890～0.0116g（20个的平均重量为0.033g）。此外，由100g冷冻鲑鱼鼻软骨块得到95.6g的冷冻鲑鱼鼻软骨小片。
（3）脱脂鲑鱼鼻软骨粉末
使用（1）的冷冻鲑鱼鼻软骨，利用专利文献1（日本特开2009－173702号公报）的实施例1中记载的方法，得到脱脂鲑鱼鼻软骨粉末。由100g冷冻鲑鱼鼻软骨块，得到5.83g脱脂鲑鱼鼻软骨粉末。将脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的照片示于图1c。
将专利文献1的实施例1的记载摘录如下。
“粉碎100g冷冻鲑鱼鼻软骨，向其中加入等容量的15℃的自来水，缓慢搅拌使其充分混合，并使所得混合物维持在5℃左右，立即使用离心分离器在9000rpm、30分钟、4℃下对该混合物进行离心分离，将脂质与包括蛋白多糖在内的其他组合物分开。离心分离层分为3层，除去最上部的脂质层和中间层的水层，回收沉淀物。将沉淀物冷冻干燥后，使用离心式粉碎机进行粉碎，得到水脱脂微粉。在该阶段，取一部分并使用醚萃取测定脂质，结果为脂质残存8.8%，如果将脱脂前的脂质设为100%，则除去率达到75.0%，有轻微的异味。接着，在水脱脂微粉中加入10倍容量的乙醇，溶解提取含有异味的脂质。将本操作重复2次并将乙醇溶液过滤除去，使溶剂蒸发得到微黄褐色无味的蛋白多糖组合物粉末。相对于鲑鱼鼻软骨的收率为58.7%（干基），蛋白多糖含有率为77.7%。蛋白多糖组合物粉末的异味完全消失。”
专利文献1的实施例1的“冷冻鲑鱼鼻软骨”相当于上述的“冷冻鲑鱼鼻软骨块”。此外，“干基”是指干燥质量换算。
<使用鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的提取研究>
在以上述方式操作而得到的（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片中加入水，通过静置或在100℃下加热来尝试蛋白多糖的提取。具体而言，如下操作而进行了研究。相对于约12g冷冻鲑鱼鼻软骨小片加入60ml的蒸馏水，配制出4份样品，在100℃下将他们分别加热1小时、2小时、3小时、4小时，然后通过离心分离机在5000rpm、20分钟、4℃下对它们进行离心分离，除去不溶物（残渣）回收上清液。测定回收上清液的量后，利用咔唑硫酸法测定回收上清液中的糖醛酸量（糖醛酸量反映蛋白多糖量。在图表中，有时使用糖醛酸的一种即葡萄糖醛酸的简记“GlcA”来表示糖醛酸量）。此外，利用Bradford法测定回收上清液中的蛋白质量。将结果示于表1。此外，将使表1图表化而成的图示于图2。
[表1]
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由表1及图2可知，随着加热时间的延长，蛋白多糖的提取量增加。此外，可知特别是如果加热长于3小时（例如4小时），则蛋白多糖提取量会大幅度增加。
<冷冻鲑鱼鼻软骨小片、与冷冻鲑鱼鼻软骨块及脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的比较>
关于（1）冷冻鲑鱼鼻软骨块及（3）脱脂鲑鱼鼻软骨粉末，进行与上述（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片的情况相同的操作（其中，使加热时间及加热温度发生变化）来提取蛋白多糖，并对其提取量进行比较。将结果示于表2。需要说明的是，在表2中，将提取的糖醛酸量及蛋白质量换算为每100g冷冻鲑鱼鼻软骨块的量来表示。蛋白质量是利用Bradford法测定的值。此外，将使表2图表化而成的图示于图3。图3所示的各试样的记载（1～9）与表2的“样品No.”栏的1～9的记载相对应。
[表2]
每100g冷冻鲑鱼鼻软骨块(脱脂鲑鱼鼻软骨粉末;5.83g 冷冻鲑鱼鼻软骨小片;95.6g)
Figure BDA00003537876600201
直接将冷冻鲑鱼鼻软骨块供于水提取，在没有进行加热的情况下，蛋白质未被提取。因此，可知在该提取条件下，蛋白多糖无法被提取。
特别是，在将冷冻鲑鱼鼻软骨小片在水中、100℃下加热4小时的情况下，提取的糖醛酸量（反映蛋白多糖量）显著地增加。
<蛋白多糖的分子量的研究>
在20g上述脱脂鲑鱼鼻软骨粉末中加入1000mL的常温的精制水（pH6.5），搅拌30分钟后，进行离心分离（8000rpm，30分钟，4℃），回收上清液，将该上清液冷冻干燥，得到鱼类软骨水提取物。以下，有时将该鱼类软骨水提取物称为样品No.10。
利用下述条件的凝胶过滤色谱法将该样品No.10分离成各馏分。然后，利用咔唑硫酸法对各馏分所包含的糖醛酸量进行定量。此外，测定各馏分280nm下的吸光度，将该吸光度作为反映所含的蛋白质量的值。然后，基于这些结果，绘制出糖醛酸量色谱图及280nm蛋白质量色谱图。将使糖醛酸量色谱图及280nm蛋白质量色谱图重叠而绘制出的图示于图4a，此外，将在糖醛酸量色谱图中表示洗脱了各分子量标记物的馏分的位置的图示于图4b。需要说明的是，凝胶过滤色谱法的各馏分的量如下所述设为1mL/试管，因此，图4的横轴“Elution Volume（洗脱体积）（mL）”反映馏分No.。
“〔凝胶过滤色谱法条件〕
色谱柱：Sepharose CL－2B填充色谱柱（以Sepharose CL－2B为载体填充到Φ1cm×50cm的色谱柱中而成。Sepharose CL－2B的葡聚糖的分级范围为100～20000kDa，例如可从GE Healthcare公司等获得。SepharoseCL－2B为2%交联琼脂糖，粒径为60－200μm（由激光衍射散射法得到），CAS注册号为65099－79－8。）
缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（pH 7.1，含有0.2M的NaCl）
应用样品量：样品No.10 4mg（溶解于1mL缓冲液中使用）
流速：0.15mL/min
各馏分量：1mL/试管
分子量校正曲线：对于以下的各种葡聚糖分子量标记物，在与上述同样的条件（其中，样品量为1mg/1mL的缓冲液）下进行凝胶过滤色谱法处理，利用苯酚·硫酸法测定各馏分的吸光度（反映葡聚糖量），制作出校正曲线。
<葡聚糖分子量标记物>
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5000000－40000000）（SIGMA）…色谱柱的void volume测定用、20000kDa
Dextran Standard 1400000（SIGMA）…1400kDa
Dextran Standard 670000（SIGMA）…670kDa
Dextran Standard 410000（SIGMA）…410kDa
Dextran Standard 270000（SIGMA）…270kDa
其中，关于Dextran from Leuconostoc mesenteroides，在进行了将该标记物所包含的低分子的葡聚糖除去的前处理之后，作为标记物使用。该前处理如下进行：通过上述的〔凝胶过滤色谱法条件〕（应用量为标记物用的量）使Dextran from Leuconostoc mesenteroides其本身洗脱，回收分子量2000万以上的分子，使其冷冻干燥。具体而言，利用苯酚·硫酸法测量各馏分的吸光度，并制作出反映葡聚糖量的色谱图，在该色谱图中，将相当于最先出现的峰的馏分回收，将其冷冻干燥（认为由此可以将分子量为20000kDa以上的分子回收并冷冻干燥）。将该冷冻干燥物用作标记物（色谱柱的void volume测定用）。
按照Hodge,J.E.and Hofreiter,B.T.,Method in CarbohydrateChemistry,1338（1962）中记载的方法（苯酚·硫酸法），进行用于获得反映葡聚糖量的色谱图的吸光度测定。具体而言，如下所述来进行。
〔1〕在105×15mm的试管中加入500μl的试样水溶液。
〔2〕加入500μl的苯酚试剂（5v/v%苯酚水溶液），并进行搅拌。
〔3〕加入2.5mL的浓硫酸，立即剧烈搅拌10秒钟。
〔4〕室温下放置20分钟以上。
〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。”
需要说明的是，所得到的校正曲线为（y=－4.1355Ln（x）+59.47；R2=0.9869），由R2值考虑可知，分子量与馏分No.（即洗脱液量）密切相关。
如图4b所示，可知，样品No.10至少包含分子量为200万以上（甚至分子量为250万以上）的蛋白多糖。需要说明的是，如图4b所示，在糖醛酸量色谱图中，向相当于特定的分子量的洗脱液量点上引垂线，求出将该色谱图分割成的2部分的面积比，由此，可以求出该特定分子量以上（或以下）的成分在鱼类软骨水提取物中的含有比率。
接下来，对样品No.10进一步详细地进行分析。具体而言如下进行。将样品No.10供于下述条件的离子交换色谱法，对蛋白多糖进行分级。具体而言，采集各16mL的洗脱馏分，利用咔唑硫酸法对糖醛酸量进行定量。
“〔离子交换色谱法条件〕
色谱柱：DEAE填充色谱柱（以DEAE（GE Healthcare公司）为载体，填充到Φ5.0cm×20cm的色谱柱中而成）
缓冲液：7M尿素－三盐酸缓冲液（pH7.2）
梯度：NaCl浓度0→0.75M
应用样品量：样品No.10（鱼类软骨水提取物的冷冻干燥物）200mg（溶解在50mL的缓冲液中来使用）
流速：2.0mL/min
馏分量：16mL/试管”
将所得到的糖醛酸量色谱图示于图5。收集包含糖醛酸的馏分（在图6中用两个方向的箭头表示），透析后，进行冷冻干燥，得到粉末。将该粉末作为“蛋白多糖部分”，用于以下的研究。
将如上操作而得到的蛋白多糖部分供于下述条件的凝胶过滤色谱法处理，进行分级。然后，利用咔唑硫酸法对各馏分中所包含的糖醛酸量进行定量。此外，测定各馏分的280nm下的吸光度，作为反映包含该吸光度值的蛋白质量的值。然后，基于这些结果，绘制出糖醛酸量色谱图及280nm蛋白质量色谱图。
“〔凝胶过滤色谱法条件〕
色谱柱：Sepharose CL－2B填充色谱柱（以Sepharose CL－2B（GEHealthcare公司）为载体，填充到Φ5.0cm×50cm的色谱柱中而成）。
缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（pH7.1，含有0.2M的NaCl）
应用样品量：150mg
流速：2.0mL/min
馏分量：16mL/试管”
此外，对于下述的各种葡聚糖分子量标记物，在同样条件（其中，样品量为50mg）下进行凝胶过滤色谱法处理，利用苯酚·硫酸法测定各洗脱馏分的吸光度（反映葡聚糖量），制作出分子量与馏分No.的校正曲线，求出分子量达到500万、40万的馏分No.。
“<葡聚糖分子量标记物>
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5000000－40000000）（SIGMA）…20000kDa
Dextran Standard 1400000（SIGMA）…1400kDa
Dextran Standard 270000（SIGMA）…270kDa
其中，对于Dextran from Leuconostoc mesenteroides，在进行了将其所包含的低分子的葡聚糖除去的前处理之后，作为标记物使用。该前处理如下进行：通过上述的〔凝胶过滤色谱法条件〕（应用量为标记物处理时的量）使Dextran from Leuconostoc mesenteroides洗脱，回收分子量为2000万以上的分子，使其冷冻干燥。具体而言，在反映葡聚糖量的色谱图中，将相当于最先出现的峰的馏分回收，并将其冷冻干燥（认为由此可以将分子量为20000kDa以上的分子回收并冷冻干燥）。实际上，将该冷冻干燥物用作标记物（色谱柱的void volume测定用）。用于获得反映葡聚糖量的色谱图的、吸光度测定，与上述同样地进行。”
将所得到的色谱图示于图6。在包含糖醛酸的馏分中，划分出分子量为500万以上、40万以上～小于500万、小于40万的3部分，分别收集馏分，并实施透析后，进行冷冻干燥，得到3种分子量不同的鱼类软骨水提取物（粉末）。将这3种鱼类软骨水提取物设为PG－1提取物（含有分子量为500万以上的蛋白多糖）、PG－2提取物（含有分子量为40万以上～小于500万的蛋白多糖）、PG－3提取物（分子量小于40万的蛋白多糖）。需要说明的是，由该结果可以确认样品No.10中至少包含分子量为500万以上的蛋白多糖。
通过口服摄取进行的皮肤抗老化能力评价1
实际中，使哺乳动物摄取鱼类软骨水提取物，并对其效果进行研究。
<使用的实验动物>
将无毛小鼠（Hr-/Kud♂）（九动公司）用于实验。预饲养不会因***变动而给皮肤状态带来影响的雄性无毛小鼠（6周龄）后，供于实验。
<实验方法>
如表3所示将小鼠分配至3个饲养笼中，分别设为不同的组（组1～组3）（每组6只）。此外为了对受试体进行个体识别而使其尾部带有标记。继续预饲养直至研究开始。试验时的平均体重为37g。需要说明的是，使用样品No.10作为表3中的组3的评价原材料即“鱼类软骨水提取物”。
[表3]
Figure BDA00003537876600251
<评价原材料的口服给药时的样品制备>
将样品No.10溶解于水中使其达到0.35mg/mL，制备出给药样品。
<口服给药方法>
在无毛小鼠达到8周龄的阶段，1天1次、利用探管进行强制口服给药来给予各给药样品0.5mL（0.175mg/天/只）。对照组给予0.5mL蒸馏水。以6次/周（周一～周六的6天时间内，每天1次）的频率持续给药，直至试验完成。
<UVB照射方法>
在口服投药开始3周后开始UVB照射。将小鼠放入UVB照射用笼中，放入UVB照射装置内，以1.0mW/cm2的强度6次/周（周一～周六的6天时间内，每天1次）照射UVB。照射量仅在第1周为60mJ/cm2，第2周以后设为120mJ/cm2。需要说明的是，UVB为波长280～315nm的紫外线。
<抗炎症评价>
使用多探头式皮肤测试仪（MPA 580：Courage-Khazaka公司）的Maxameter，测定UVB照射4周后及7周后的红斑量，对抗炎症进行评价。对各小鼠背部的5个位置进行测定，计算出平均值。由UVB照射引起的炎症，会产生红斑。因此，红斑量越多，表示炎症越严重。
将UVB照射4周后及7周后的红斑量测定结果示于图7。由结果可知，作为鱼类软骨水提取物的样品No.10可以通过口服给药抑制红斑。因此，可知该鱼类软骨水提取物可抑制由紫外线照射引起的炎症。
<皮肤屏障功能评价>
使用多探头式皮肤测试仪（MPA 580：Courage-Khazaka公司）的Taxameter，测定UVB照射4周后及7周后的经表皮透过蒸腾水分量（TEWL），对皮肤屏障功能进行评价。对各小鼠背部的3个位置进行测定，计算出平均值。需要说明的是，TEWL值越大则表示皮肤屏障功能（防止异物从皮肤的外部向体内侵入的功能、以及防止体内的水分向外逃逸的功能）越低。
将UVB照射4周后及7周后的TEWL测定结果示于图8。由结果可知，作为鱼类软骨水提取物的样品No.10可以通过口服给药来降低TEWL值，并改善了皮肤屏障功能。
通过口服摄取进行的皮肤抗老化能力评价2（由分子量不同引起的效果差异的研究）
使用样品No.10、以及由样品No.10进一步精制而得的PG－1提取物及PG－2提取物，对皮肤抗老化能力进行研究。
<使用的实验动物>
将无毛小鼠（Hr-/Kud♂）（九动公司）用于实验。预饲养不会因***变动而给皮肤状态带来影响的雄性无毛小鼠（6周龄）后，供于实验。
<实验方法>
如表4所示将小鼠分配至5个饲养笼中，分别设为不同的组（组1～组5）（每组6只）。此外，为了对受试体进行个体识别而使其尾部带有标记。继续预饲养直至研究开始。
[表4]
Figure BDA00003537876600261
<评价原材料的口服给药时的样品制备>
将各评价原材料溶解于水溶使其达到0.2mg/mL，制备出给药样品。
<口服给药方法>
在无毛小鼠达到8周龄的阶段，1天1次、利用探管进行强制口服给药来给予各给药样品0.5mL（0.1mg/天）。对照组给予0.5mL蒸馏水。以6次/周（周一～周六的6天时间内，每天1次）的频率持续给药，直至试验完成。
<UVB照射方法>
在口服投药开始3周后开始UVB照射。将小鼠放入UVB照射用笼中，放入UVB照射装置内，以1.0mW/cm2的强度6次/周（周一～周六的6天时间内，每天1次）照射UVB。照射量仅在第1周为60mJ/cm2，第2周以后设为120mJ/cm2。需要说明的是，UVB为波长280～315nm的紫外线。
<抗炎症评价>
使用多探头式皮肤测试仪（MPA 580：Courage-Khazaka公司）的Maxameter，测定UVB照射4周后及7周后的红斑量，对抗炎症进行评价。对各小鼠背部的5个位置进行测定，计算出平均值。由UVB照射引起的炎症，会产生红斑。因此，红斑量越多，表示炎症越严重。
将UVB照射4周后及7周后的红斑量测定结果示于图9。由结果可知，所使用的鱼类软骨水提取物，通过口服给药而抑制红斑，因此可抑制由紫外线照射引起的炎症。此外可知，鱼类软骨水提取物所包含的蛋白多糖中，分子量为500万以上的高分子量的蛋白多糖（PG－1提取物）发挥出特别高的效果。
<皮肤屏障功能评价>
使用多探头式皮肤测试仪（MPA 580：Courage-Khazaka公司）的Taxameter，测定UVB照射4周后及7周后的经表皮透过蒸腾水分量（TEWL），对皮肤屏障功能进行评价。对各小鼠背部的3个位置进行测定，计算出平均值。需要说明的是，TEWL值越大则表示皮肤屏障功能（防止异物从皮肤的外部向体内侵入的功能、以及防止体内的水分向外逃逸的功能）越低。
将UVB照射4周后及7周后的TEWL测定结果示于图10。由结果可知，所使用的鱼类软骨水提取物，通过口服给药使TEWL值降低，并改善了皮肤屏障功能。
<皮肤保水性评价>
使用多探头式皮肤测试仪（MPA 580：Courage-Khazaka公司）的Corneometer，测定UVB照射4周后及7周后的角质层水分量，对皮肤保水性进行评价。对各小鼠背部的10个位置进行测定，计算出平均值。
将UVB照射4周后及7周后的TEWL测定结果示于图11。由结果可知，所使用的鱼类软骨水提取物，通过口服给药使角质层水分量提高，改善了皮肤保水性。此外可知，鱼类软骨水提取物所包含的蛋白多糖中，具有分子量为500万以上的分子量的蛋白多糖（PG－1提取物）发挥出特别高的效果。
需要说明的是，在图7～图11中，图中的符号分别表示以下含义。
***；p<0.001
**；p<0.01
*；p<0.05
+；p<0.1
通过口服摄取进行的皮肤抗老化能力评价3（临床试验）
在受试者（健康的25岁～55岁的女性14名）前臂及上臂内侧皮肤处，通过下述所示的方法，使用含浸有十二烷基硫酸钠（SLS）的斑贴（chamber）进行刺激，对刺激后的红斑消失速度（在前臂部进行测定）以及经表皮透过蒸腾水分量（TEWL）（在上臂部进行测定）的变化进行比较（试验方法的详情如下所述）。
作为试验组，将500mg样品No.10、500mg作为安慰剂的“结晶纤维素粉末（Ceolus（注册商标）FD－301（旭化成chemicals（株）制造）”分别封入6粒硬质胶囊中，以1次3颗胶囊的比例，1天2次使受试者服用（即，1天摄取量为500mg）。需要说明的是，服用样品No.10的受试者为7名，服用安慰剂的受试者为7名。
需要说明的是，在500mg样品No.10中，包含约80mg的分子量为500万以上的蛋白多糖。该值（约80mg）通过下述方式求出：在图4的样品No.10的糖醛酸量色谱图中，收集相当于分子量为500万以上的蛋白多糖的馏分（No.16～23），透析后，使其冷冻干燥并测定干燥重量，求出绘制图4的色谱图时向色谱柱供给的No.10的量（4mg）、与该干燥重量之比，再用该比乘以500mg而算出。
自开始服用起第5周（继续服用直至测定结束时），在各受试者的前臂及上臂内侧皮肤处贴附含浸有SLS的斑贴，刺激皮肤，然后，在手臂的刺激部位和非刺激部位中，对刺激后的前臂部的红斑的颜色（L*a*b*表色***中的a*值）、及刺激后的上臂部的经表皮透过蒸腾水分量（TEWL）值分别进行测定。然后，算出刺激部位的测定值相对于非刺激部位的测定值的相对值（控制率），并对红斑消失速度及TEWL的变动进行研究。将结果分别示于图12及图13。
需要说明的是，更具体而言，皮肤刺激及测定如下进行。
·利用SLS贴布粘附的刺激方法及测定方法
将受试者的手臂内侧洗净后，进入设定为22℃、60%的恒温恒湿室内15分钟以上之后，粘附包含有0.5% SLS（Sodium dodecyl sulfate（十二烷基硫酸钠）：和光纯药工业株式会社Lot.STQ8638）30μL且带有滤纸的斑贴（200LARGE FINN CHAMBERS ON SCANPOR，NORGESPLASTER Ltd.），封闭刺激4小时。然后剥离斑贴，在1小时后、1天后、2天后，使用色彩色差计CR－400（KONICA MINOLTA）对刺激部位的红斑颜色（a*值）进行测定，并使用Tewameter TM－300（Courage+Khazaka）对刺激部的TEWL值进行测定。
由图12可确认，通过口服摄取样品No.10，红斑消失的速度加快（即，炎症得到改善）。此外，由图13可确认，通过口服摄取样品No.10，TEWL值下降（即，皮肤屏障功能得到改善·增强）。
细胞增殖效果的研究
在500g上述脱脂鲑鱼鼻软骨小片中，以质量比计加入2.5倍量的精制水，以100℃、90℃、70℃、或50℃进行加热。在100℃与90℃下加热3小时，在70℃与50℃下加热6小时。在100℃与90℃下软骨完全溶解，但是在70℃与50℃下软骨没有溶解完全，在一部分残存的状态下完成提取。然后，使用离心分离机在8000rpm、30分钟、4℃下进行离心分离，除去不溶物（残渣），回收上清液，进行冷冻干燥得到干燥冷冻样品（FD样品）。以下，分别将这些样品称为100℃提取FD样品、90℃提取FD样品、70℃提取FD样品、以及50℃提取FD样品。此外，在100℃下加热3小时后，进一步加热3小时，然后同样地进行离心分离及冷冻干燥，得到干燥冷冻样品。以下将该样品称为100℃（3h）提取FD样品。
将这些FD样品分别调节为GlcA的浓度为1mg/1mL的缓冲液，通过进行与上述<蛋白多糖的分子量的研究>中最初用于解析样品No.10的色谱法（结果示于图4的色谱法）同样的操作，而通过凝胶过滤色谱法进行解析，对各个样品的分子量进行研究。具体而言，由糖醛酸色谱图，分别求出分子量为500万以上的成分所占的比率、分子量为250万以上的成分所占比率、及分子量为180万以上的成分所占比率。将结果示于表5。
[表5]
Figure BDA00003537876600301
接下来，如下操作对这些样品的细胞增殖能力进行研究。即，在培养皿内，在包含10%fetal bovine serum（FBS、胎牛血清）的minimum essentialmedium（最低必需培养基：MEM培养基）中，接种1.5×104个细胞（cells）的人皮肤成纤维细胞（HDF53：CELL APPLICATIONS，INC），使用22μm过滤器对各样品进行过滤灭菌后，将样品添加到MEM培养基中使其浓度达到20μg/mL。添加后，培养5天。培养后，除去MEM培养基，用胰蛋白酶－EDTA（invitrogen）剥离细胞使其悬浊后，添加台盼蓝染色液，用计数板测定细胞数。
需要说明的是，使用水作为对照。此外，为了比较，作为蛋白多糖，还对市售的产品（设为市售品A）同样地进行了研究。
将结果示于图14。与对照相比，90℃提取FD样品显著地促进了细胞增殖。此外，70℃提取FD样品、100℃提取FD样品也显示出了促进细胞增殖的倾向。需要说明的是，该研究中的对照、50℃提取FD样品、70℃提取FD样品、90℃提取FD样品、100℃提取FD样品、100℃（3h）提取FD样品、及市售品A的n数分别为11、3、6、11、6、6、及5的顺序。统计处理通过Student t检验（Student′s t test）进行。
然后，分析该研究中使用的各样品的组成。各成分的分析如下进行。蛋白质、脂质、灰分、水分、羟基脯氨酸量（为了胶原蛋白量的测定而使用），委托财团法人日本食品分析中心，实施每100g各样品的成分分析。蛋白质量通过凯氏定氮法测定，脂质量通过酸分解法测定，灰分量通过直接灰化法测定，水分量通过常压加热干燥法测定，羟基脯氨酸量通过氨基酸自动分析法（HPLC法）测定。碳水化合物量通过从100（g）中减去蛋白质量、脂质量、灰分量及水分量来计算。
需要说明的是，蛋白质量通过如上所述的凯氏定氮法测定，但该方法是以氮量为指标的方法，为了使源自糖胺聚糖的氮也成为测定对象等，而如下进行修正。
首先，为了减去源自作为非蛋白质的糖胺聚糖的氮，由利用咔唑硫酸法求出的糖醛酸量算出（具体而言，糖醛酸量乘以换算系数2.593）酸性糖成分量（硫酸软骨素换算），由于源自硫酸软骨素的氮相当于分子量的2.9%，因此使得到的酸性糖成分量乘以2.9%，由此计算出源自糖胺聚糖的氮。
在减去源自糖胺聚糖的氮而得到的氮中，包含有源自胶原蛋白的氮和源自胶原蛋白以外的蛋白质的氮。就胶原蛋白和其他的蛋白质而言，由于所谓的蛋白质系数不同，因此需要获知源自胶原蛋白和其他的蛋白质的氮量。
如上所述，胶原蛋白的定量可通过对胶原蛋白中特别存在的氨基酸“羟基脯氨酸”进行定量来实施。具体而言，胶原蛋白含量如下计算：对胶原蛋白中特别存在的氨基酸即羟基脯氨酸（Hyp）进行测定，再设定胶原蛋白中包含6.7%的Hyp，由此进行计算。通过使用如上操作而得到的胶原蛋白量除以胶原蛋白的蛋白质系数5.55，计算出源自胶原蛋白的氮量。
由利用凯氏定氮法得到的氮定量值，减去源自糖胺聚糖的氮量及源自胶原蛋白的氮量，使所得的值乘以一般蛋白质的蛋白质系数6.25，从而计算出胶原蛋白以外的蛋白质量。
然后，蛋白质量可以通过使胶原蛋白量、和由前述计算得到的胶原蛋白以外的蛋白质量相加来计算。
将结果示于下述表6。表6的值表示（g/提取FD样品100g）。需要说明的是，在表6中，一并示出了分子量为180万以上的蛋白多糖的量。该分子量是180万以上的蛋白多糖的量的值，并且是表6的“糖胺聚糖量”与表5的“180万以上的成分所占比率”相乘而得的值。
[表6]
Figure BDA00003537876600321
单位是g/提取FD样品100g
酸性糖：作为硫酸软骨素等量来计算
硫酸软骨素等量=葡萄糖醛酸×换算系数2.593
此外，表6中的“10%EtOH处理→90℃提取FD”是指，使用10%的乙醇进行鱼类软骨的脱脂处理后，在90℃的水中提取而得到的样品。更具体而言，将500g的冷冻鲑鱼鼻软骨小片中加入2.5倍量的10%EtOH溶液，在室温下用搅拌器搅拌24小时，在8000rpm、30分钟、4℃下离心分离，通过在90℃下并进行螺旋桨式搅拌来加热回收的不溶物（包含软骨的残渣）直至软骨完全溶解，之后进行与表5所示的FD样品同样的离心分离、过滤处理，得到的冷冻干燥（FD）样品。
如表6所示，就本发明所涉及的鱼类软骨水提取物而言，其含有的蛋白质大多为胶原蛋白。此外，可知特别是脂质、灰分的含量越少，则越是具有细胞增殖能力（即，起到细胞增殖促进效果）。由于具有细胞增殖能力，因此认为其能够更有效地发挥炎症改善效果或者抗老化效果。

Claims (8)

1.一种鱼类软骨水提取物，其含有分子量为180万以上的蛋白多糖。
2.根据权利要求1所述的鱼类软骨水提取物，其含有分子量为250万以上的蛋白多糖。
3.根据权利要求2所述的鱼类软骨水提取物，其含有分子量为500万以上的蛋白多糖。
4.根据权利要求3所述的鱼类软骨水提取物，其中，分子量为500万以上的蛋白多糖以干燥质量换算，包含9质量%以上。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，胶原蛋白以干燥质量换算，包含30质量%以上。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的鱼类软骨水提取物，其中，鱼类为鲑鱼或鳟鱼，软骨为鼻软骨。
7.一种饮食品组合物、口腔用组合物、或化妆品组合物，其包含权利要求1～6中任意一项所述的鱼类软骨水提取物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其为炎症改善用或抗老化用。
CN2012800059678A 2011-01-19 2012-01-19 水生动物软骨提取物 Pending CN103327987A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

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