CN103316379A

CN103316379A - 用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的补片及其制备方法

Info

Publication number: CN103316379A
Application number: CN2013102403977A
Authority: CN
Inventors: 王建六; 李琦; 刘海峰
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103316379B

Abstract

本发明公开了一种用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的补片及其制备方法。本发明提供了一种医用补片，为吸附有离体的脂肪间充质干细胞的丝素蛋白支架。本发明还保护一种制备医用补片的方法，依次包括如下步骤：（1）在丝素蛋白支架上滴加脂肪间充质干细胞的细胞悬液，孵育；（2）培养，得到医用补片。将该医学补片植入机体进行盆底重建后，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终达到修复盆底支持功能缺损的目的。

Description

用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的补片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的补片及其制备方法。

背景技术

女性盆底功能障碍性疾病（pelvic floor dysfunctional diseases,PFDs）是中老年女性常见病，主要包括因盆底损伤和机能退化造成的盆腔脏器脱垂（pelvicorgan prolapse,POP）、压力性尿失禁（stress urinary incontinence,SUI）以及排便障碍。而随着人口的老龄化和对生活质量要求的提高，PFDs的发病率和就诊率将逐年提高。

盆底功能障碍性疾病的发病机制尚不清楚，推测是盆底***、肌肉和神经在生物力学、生殖内分泌改变和***代谢的共同作用下，使盆底支持功能进行性受损所致。

对于盆底功能障碍性疾病的治疗方法主要分为非手术治疗和手术治疗。非手术治疗方法的临床效果有限，仅适用于轻度PFDs患者。随着盆底解剖研究认识的深入，手术器械的改进以及修补材料的发明应用，妇科泌尿学与盆底重建外科学有了突破性的进展。盆底重建手术的目的是修复和重建盆底缺损，恢复盆底组织的解剖结构和正常功能。近年应用各种新型材料和手术方式，特别是网片和吊带的应用，极大地改善了盆底修复和重建手术的疗效，有效地降低了手术后中、远期复发率。

盆底重建外科手术中应用的替代材料主要为各种类型的补片和吊带。根据盆底组织修复的特点，Ridder在2002年提出理想的重建材料应具有以下的特性：①最小的异物反应；②有弹性可弯曲；③容易缝合；④较好的组织相容性；⑤允许胶原纤维长入；⑥启动永久的组织修复；⑦好的力学性能；⑧抗感染；⑨伤口并发症较小。

目前临床常用的补片主要有两类：一类是以聚丙烯为代表的化学合成补片，其性质稳定而坚固，但由于其不可吸收的特性存在侵蚀、感染和排斥等并发症；另一类为生物源性补片，尽管相容性较好，但植入体内后降解速度较快，术后复发率较高。因此，综合化学合成补片和生物源性补片的优点，研制可用于盆底重建手术的新型补片，成为当前盆底功能障碍性疾病治疗研究的热点。

发明内容

本发明提供了一种用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的补片及其制备方法。

本发明提供了一种医用补片，为吸附有离体的脂肪间充质干细胞的丝素蛋白支架。

所述医用补片可为如下任一所述方法制备得到的医用补片。

本发明还保护一种制备医用补片的方法，依次包括如下步骤：

（1）在丝素蛋白支架上滴加脂肪间充质干细胞的细胞悬液，孵育；

（2）培养，得到医用补片。

所述方法中，所述丝素蛋白支架的大小可为20mm×20mm，每片所述丝素蛋白支架上滴加0.5ml1×10⁴-1×10⁶个细胞/ml（如2×10⁵个细胞/ml）的所述细胞悬液。所述方法中，所述滴加具体可滴加于所述丝素蛋白支架的毛面。所述方法中，所述孵育的条件具体可为：37℃、20-30min。所述培养的条件具体可为：37℃、5%CO₂，饱和湿度培养7天，每天更换新的培养基。所述培养基具体可为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。所述脂肪间充质干细胞的细胞悬液具体可为采用常规方法进行胰酶消化后的脂肪间充质干细胞的细胞悬液。

所述丝素蛋白支架的制备方法依次包括如下步骤：

（1）将桑蚕丝编织成网片；

（2）将步骤（1）得到的网片浸泡于80-100℃的0.1-0.3g/100mL Na₂CO₃水溶液，冲洗，晾干；

（3）将桑蚕丝置入0.1-0.3g/100mL Na₂CO₃水溶液中，95-100℃加热0.5-1.5小时，取出脱胶后蚕丝，冲洗，晾干；

（4）将氯化钙-乙醇-水溶液加热至70-90℃，然后放入步骤（3）得到的脱胶后蚕丝，70-90℃搅拌1-3小时，冷却后离心，取上层清液；

（5）将步骤（4）得到的上层清液透析，得到丝素蛋白溶液；

（6）将步骤（2）得到的网片浸没于步骤（5）得到的丝素蛋白溶液中，-25至-15℃静置10-15小时，然后-25至-15℃冻干15-30小时；

（7）将步骤（6）得到的网片置于80%-99%（体积分数）甲醇水溶液中室温静置5-15min，取出网片，晾干，得到丝素蛋白支架。

所述丝素蛋白支架的制备方法具体可依次包括如下步骤：

（1）将桑蚕丝在40针编织机上编织成网片；

（2）将步骤（1）得到的网片浸泡于98-100℃的0.2g/100mL Na₂CO₃水溶液（每30min更换相同的溶液，换液3次），然后用水冲洗，晾干；

（3）将桑蚕丝置入0.2g/100mL Na₂CO₃水溶液中，98℃加热1小时，取出脱胶后蚕丝，用水冲洗，晾干；

（4）将氯化钙-乙醇-水溶液加热至78±2℃，然后放入步骤（3）得到的脱胶后蚕丝，78±2℃搅拌2小时，自然冷却后4℃、8500r/min离心10min，取上层清液；

（5）将步骤（4）得到的上层清液倒入透析管中，放入装有水的烧杯中透析24小时（每隔3小时换一次双蒸水），然后用水调整蛋白浓度，得到蛋白浓度为2g/100mL的丝素蛋白溶液；

（6）将步骤（2）得到的网片浸没于步骤（5）得到的丝素蛋白溶液中，-20℃静置12小时，然后-20℃冻干24小时；

（7）将步骤（6）得到的网片置于90%（体积分数）甲醇水溶液中室温静置10min，然后取出网片，晾干过夜，得到丝素蛋白支架。

所述氯化钙-乙醇-水溶液可为将1摩尔CaCl₂、1-3摩尔乙醇和7-9摩尔水混合得到的溶液。所述氯化钙-乙醇-水溶液具体可为将1摩尔CaCl₂、2摩尔乙醇和8摩尔水混合得到的溶液。

以上任一所述的脂肪间充质干细胞可为来源于SD大鼠的脂肪间充质干细胞。

本发明还保护以上任一所述医用补片在制备用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的产品中的应用。

针对缺乏具有临床应用价值的用于女性盆底重建的组织工程补片的问题，本发明提供了一种利用脂肪间充质干细胞复合丝素蛋白支架构建组织工程补片的方法并提供了相应的医学补片。将该医学补片植入机体进行盆底重建后，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终达到修复盆底支持功能缺损的目的。

附图说明

图1为肉眼观察的丝素蛋白支架的形态照片。

图2为丝素蛋白支架置于光学显微镜下观察的照片。

图3为丝素蛋白支架在扫描电镜下观察的照片。

图4为组织工程补片扫描电镜下观察的照片。

图5为A组盆腔植入物以及周边的盆腔组织、皮下植入物以及周边的皮下组织进行HE染色的结果。

图6为B组盆腔植入物以及周边的盆腔组织、皮下植入物以及周边的皮下组织进行HE染色的结果。

图7为C组盆腔植入物以及周边的盆腔组织、皮下植入物以及周边的皮下组织进行HE染色的结果。

图8为Masson三色染色的结果。

图9为力学性能检测的结果。

图10为相同植入部位同种植入物内总胶原含量随植入时间的变化。

图11为相同植入部位同一植入时间不同种植入物内的总胶原含量的差异。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。SD（Sprague Dawley）大鼠：购自军事医学科学院实验动物中心。脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）分离自SD大鼠。桑蚕丝：苏州茂达纺织有限公司。

PBS缓冲液（0.01M）：1000ml去离子水中加入NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO41.15g，调pH值为7.4，高压灭菌后4℃保存。

实施例1、组织工程补片的制备

一、丝素蛋白支架的制备

1、将桑蚕丝以10×10cm的尺寸规格在40针编织机上编织成网片。

2、将步骤1得到的网片浸泡于98-100℃的0.2g/100mL Na₂CO₃水溶液（每30min更换相同的溶液，换液3次），然后用双蒸水冲洗，晾干。

3、丝素蛋白溶液的制备

（1）将桑蚕丝称重后置入0.2g/100mL Na₂CO₃水溶液中，98℃加热1小时（本步骤的目的是脱胶），取出脱胶后蚕丝，用双蒸水冲洗，晾干。

（2）将氯化钙-乙醇溶液（将CaCl₂、乙醇和双蒸水按1：2：8的摩尔比配制成的溶液）加热至78±2℃，然后放入步骤（1）得到的脱胶后蚕丝，78±2℃搅拌2小时（本步骤的目的是使丝素蛋白充分溶解），自然冷却后4℃、8500r/min离心10min，取上层清液。

（3）将步骤（3）得到的上层清液倒入透析管中，放入装有双蒸水的烧杯中透析24小时（每隔3小时换一次双蒸水），然后用双蒸水调整蛋白浓度，得到蛋白浓度为2g/100mL的丝素蛋白溶液。

4、将步骤2得到的网片浸没于步骤3得到的丝素蛋白溶液中，-20℃静置12小时，然后-20℃冻干24小时（本步骤的目的为使丝素蛋白充分填充至网片中的空隙，形成海绵样结构）。

5、将步骤4得到的网片置于90%（体积分数）甲醇水溶液中室温静置10min（本步骤的目的为使海绵部分的丝素蛋白形成silk II构象，防止其在后续的体外细胞培养时溶于细胞培养液中），然后取出网片，置于通风柜中晾干过夜，得到丝素蛋白支架。

二、丝素蛋白支架的形态学观察

肉眼观察步骤一制备的丝素蛋白支架的形态，随机选取5个编织网孔，游标卡尺测量网孔最大径线，计算网孔最大径线均值。肉眼观察的形态照片见图1。丝素蛋白支架由网状编织部分与海绵样填充部分组成，编织部分网孔最大径线为2.62±0.16mm(X±S,n=5)。丝素蛋白支架正反两面形态具有差异，一面表面较光滑，另一面较粗糙。

将步骤一制备的丝素蛋白支架置于光学显微镜下观察编织部分与海绵部分的复合情况。照片见图2。可见编织部分与海绵部分有机交联，可以为后续的细胞粘附生长提供支持。

步骤一制备的丝素蛋白支架在扫描电镜下观察的照片见图3。图3中：A：支架光面编织部分（×500）；B：支架光面海绵部分（×500）；C：支架毛面编织部分（×500）；D：支架毛面海绵部分（×500）。丝素蛋白支架厚度为0.413±0.112mm(X±S,n=5)。编织部分的蚕丝纤维表面光滑，单根蚕丝纤维直径为6.594±1.126μm(X±S,n=5)，单股丝线直径为0.539±0.234mm(X±S,n=5)。海绵部分为均一的多孔样结构，根据海绵部分在丝素蛋白支架两面的形态，可将丝素蛋白支架分为光面和毛面。

三、组织工程补片的体外构建

1、将生长至90%融合的ADSCs进行胰酶消化，然后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（Hyclone公司）悬浮得到2×10⁵个细胞/ml的细胞悬液。

2、将步骤一制备的丝素蛋白支架裁剪成20mm×20mm大小，121℃、103kPa高压蒸汽灭菌20min。

3、将步骤2得到的每片丝素蛋白支架置于6孔板中，每孔1片、毛面向上，每片均匀滴加0.5ml步骤1得到的细胞悬液，37℃孵育30min（实际应用中，20-30min均可）。

4、取步骤3得到的6孔板，每孔加入3ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5%CO₂，饱和湿度培养7天，每天更换新的培养基，得到组织工程补片。

四、组织工程补片的形态观察

取步骤三得到的组织工程补片，用PBS缓冲液洗涤3次后进行扫描电镜观察，照片见图4。图4中：A：支架光面编织部分（×500）；B：支架光面海绵部分（×500）；C：支架毛面编织部分（×500）；D：支架毛面海绵部分（×500）。结果显示：ADSCs主要粘附于支架毛面的海绵部分，光面表面细胞较少；细胞充分伸展、粘附于支架上，生长良好，细胞形态与在培养瓶中贴壁生长时相似；细胞在支架上***增殖，形成细胞层，并分泌细胞外基质。

实施例2、组织工程补片的应用

一、动物的分组处理

将50只雌性SD大鼠随机分为4组，A、B、C组各15只，D组5只分别进行如下处理：

A组：植入聚丙烯网片；

B组：植入实施例1的步骤一制备的丝素蛋白支架；

C组：植入实施例1的步骤三制备的组织工程补片；

D组：不进行任何处理。

植入物即聚丙烯网片、实施例1的步骤一制备的丝素蛋白支架或实施例1的步骤三制备的组织工程补片。

聚丙烯网片（美国强生公司，Gynemesh）植入前的处理方法：裁剪为0.8cm×2cm大小，紫外线照射消毒，两面各20min。

丝素蛋白支架植入前的处理方法：裁剪为0.8cm×2cm大小，121℃、103kPa高压蒸汽灭菌20min，植入前浸入无菌PBS缓冲液中待用。

组织工程补片植入前的处理方法：无菌条件下裁剪为0.8cm×2cm大小，用无菌PBS缓冲液漂洗两遍。

植入方法：大鼠按1.5%戊巴比妥钠3ml/Kg腹腔注射麻醉，固定后以75%酒精消毒下腹部，于耻骨联合上2cm处行纵切口1.5-2cm，钝性分离皮肤及皮下组织至切口两侧3cm；剪开腹直肌前鞘，钝性分离腹直肌及腹膜，暴露膀胱；将膀胱与腹膜分离后，将补片至于膀胱子宫间隙内；3-0手术缝线将植入物固定于腹壁（命名为盆腔植入物），连续扣锁缝合腹直肌鞘膜，关闭腹腔；于切口两侧皮下各植入一块植入物（命名为皮下植入物），间断缝合切口，75%酒精消毒。

术后大鼠常规饲养。A、B、C组分别于术后4周、8周、12周各处死5只大鼠，取出植入物及周围组织。D组取***壁组织作为对照。

二、组织学改变

A、B、C组各组分别取盆腔植入物以及周边的盆腔组织、皮下植入物以及周边的皮下组织进行HE染色，结果见图5-图7。A组的结果见图5（×100）。B组的结果见图6（×100）。C组的结果见图7（×100）。

A组中，植入物在体内引起的炎症反应最小，皮下与盆腔内的炎症细胞浸润情况相似，且随植入时间延长，炎性细胞浸润情况的变化不大。B组中，植入物在体内引起的炎性反应最严重，且皮下植入物引起的炎症反应重于盆腔植入物，炎症反应在植入4周后最为剧烈，而后炎症反应逐渐减轻。C组中，植入物在体内随时间炎症反应情况的趋势与B组相似，但炎症细胞浸润程度较B组轻。

A组中，植入物为单股直径较大的网丝编织而成，孔径较大。B组和C组中，植入物为多股编织丝素纤维复合丝素蛋白冻干溶液的复合结构，孔隙较小。A组中，植入物的组织形成主要表现为单根网丝周围成纤维细胞层的形成及胶原纤维的包裹，而植入物与正常组织间无明显纤维包裹，且随植入时间延长，围绕在网丝周围的成纤维细胞层数和胶原纤维量均增加，但网丝之间的成纤维细胞及胶原量较少。B组和C组中，植入物与正常组织间均存在明显的纤维***包裹，成纤维细胞、炎症细胞与胶原纤维填充于植入物中，部分成纤维细胞沿丝素纤维长轴平行分布，形成的胶原纤维方向与丝素纤维相同。各组植入12周后，均可观察到血管生成，其中以C组血管生成密度最高。

A组中，植入物属于不可吸收材料，随植入时间延长，植入物中聚丙烯网丝的形态结构无变化。B组和C组中，植入物中的丝素蛋白为可降解材料，植入8周后可观察到丝素蛋白的降解，尤其以C组植入物的海绵部分显著；植入12周后，B组植入物的海绵部分结构模糊，丝素纤维编织束间出现较多空隙，提示丝素蛋白明显降解；植入12周后，C组植入物降解的海绵部分被***胶原与成纤维细胞逐渐填充，提示组织工程补片的组织形成情况与降解速率相匹配。

三、Masson三色染色

术后12周，A、B、C组各组分别取盆腔植入物以及周边的盆腔组织、皮下植入物以及周边的皮下组织，采用南京森贝伽生物科技有限公司的Masson三色染色试剂盒并按试剂盒说明书进行染色，照片见图8（×100）。

图8中，胶原蛋白呈天蓝色，细胞核被染为深蓝色，丝素蛋白支架被染成浅红色，而红细胞被染为深红色。结果显示：C组植入物无论皮下还是盆腔均有较多胶原生成，且随植入物的降解，C组植入物内形成的胶原基本替代了原丝素蛋白支架的结构；B组在植入物降解后，胶原形成较疏松，未能完全替代丝素蛋白支架。

四、力学性能测试（AGS-H多功能材料力学实验机，日本岛津）

术后12周，对A、B、C组各组盆腔植入物的最大失效力和杨氏模量进行测试，以D组大鼠***壁组织作为对照。

（1）待测植入物修剪为大小约0.6×1.5cm大小。

（2）将修剪好的样本安装入多功能材料力学实验机的夹具上，两端夹紧固定。

（3）游标卡尺测量样本的各个径线：两夹具之间的样本长度，即承受力学作用的实际样本长度（L，mm）、宽度（d，mm）、厚度（h，mm）。

（4）调整仪器参数，使样品完全伸展，校准后以10mm/min的加载速率对样品进行拉伸，直至样品完全拉断。

（5）整个实验在常压、常温（室温20℃左右）下进行，操作过程中保持样品湿润，实验结果由配套数据采集***自动采集并通过excel输出。

（6）根据excel输出数据绘制应力-形变量曲线（软件自动绘制），并根据以上测得的样本径线与曲线线性部分计算样品杨氏模量。公式如下：

植入12周后盆腔植入物的力学性能检测结果见表1。方差分析结果显示：A组植入物的最大失效力显著高于B、C、D三组（P<0.05）；C组植入物的最大失效力高于B组（P<0.05）；A组和C两组植入物的杨氏模量显著高于B组和D组（P<0.05），见图9。图9中，A：最大失效力；*为A组与D组间存在显著性差异（P<0.05），#为B、C组与A组间存在显著性差异（P<0.05），+为C组与B组间存在显著性差异（P<0.05）。B：杨氏模量；*为A、C组与D组间存在显著性差异（P<0.05），#为A、C组与B组间存在显著性差异（P<0.05）。

表1力学性能检测结果（X±S）

	最大失效力（N）	杨氏模量（Mpa）
			A组	4.147±0.484	3.532±0.258
B组	1.789±0.136	2.034±0.104
			C组	2.664±0.145	2.989±0.189
D组	2.328±0.384	1.681±0.204

五、羟脯氨酸及总胶原的测定

术后4周、8周或12周，采用南京建成生物工程研究所的羟脯氨酸测试盒（样本碱水解法）并按试剂盒说明书对各组植入物的羟脯氨酸含量进行检测。

总胶原（μg/mg）=羟脯氨酸（μg/mg）×7.46。

结果见表2。

表2总胶原蛋白含量的检测结果（μg/mg组织湿重，X±S）

相同植入部位同种植入物内总胶原含量随植入时间的变化见图10(A为A组，B为B组，C为C组；*为与植入4周组间存在显著性差异（P<0.05），#为与植入8周组间存在显著性差异（P<0.05）)。各组植入物内总胶原含量均随植入时间延长而增加。A组大鼠：皮下植入物植入4周至8周间总胶原含量无显著性差异，而植入12周后总胶原含量显著高于植入4周或8周后；盆腔植入物植入8周和12周后总胶原含量无显著性差异，但均显著高于植入4周后。B组大鼠：皮下植入物及盆腔植入物植入后总胶原含量的变化趋势与A组相同。C组大鼠：在皮下植入物植入4周与8周后，4周与12周间、8周与12周间的总胶原含量均存在显著性差异；盆腔植入物的总胶原含量随植入时间的变化与皮下植入物相同。

相同植入部位同一植入时间不同种植入物内的总胶原含量的差异见图11（A为植入4周，B为植入8周，C为植入12周；*为组织工程补片组（C组）与聚丙烯补片组（A组）间存在显著性差异（P<0.05），#为组织工程补片组（C组）与丝素蛋白支架组（B组）间存在显著性差异（P<0.05））。仅在植入12周后盆腔植入物的总胶原含量间存在差异，C组植入物内总胶原含量显著高于A组和B组，而其余各组间总胶原含量均无显著性差异。

不同植入部位同一植入时间同种植入物内胶原总量的差异：尽管各组在相同植入时间的皮下植入物内的总胶原含量均高于盆腔植入物，但该差异均不存在统计学意义。

不同植入时间、不同植入部位、不同种类植入物内的总胶原含量与正常大鼠***壁组织（D组）内的总胶原含量的差异：统计学分析显示，植入后12周，皮下各组植入物及C组盆腔植入物的总胶原含量与D组总胶原含量不存在显著性差异；其余各组植入物内总胶原含量均显著低于D组。

Claims

1.一种医用补片，为吸附有离体的脂肪间充质干细胞的丝素蛋白支架。

2.如权利要求1所述的医用补片，其特征在于：所述医用补片的制备方法依次包括如下步骤：

（2）培养，得到医用补片。

3.如权利要求2所述的医用补片，其特征在于：所述丝素蛋白支架的大小为20mm×20mm时，每片所述丝素蛋白支架上滴加0.5ml2×10⁵个细胞/ml的所述细胞悬液。

4.如权利要求2或3所述的医用补片，其特征在于：所述所述孵育的条件为：37℃、20-30min。

5.如权利要求2或3或4所述的医用补片，其特征在于：所述培养的条件为：37℃、5%CO₂，饱和湿度培养7天。

6.一种医用补片的制备方法，依次包括如下步骤：

（2）培养，得到医用补片。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述丝素蛋白支架的大小为20mm×20mm时，每片所述丝素蛋白支架上滴加0.5ml2×10⁵个细胞/ml的所述细胞悬液。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述所述孵育的条件为：37℃、20-30min。

9.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：37℃、5%CO₂，饱和湿度培养7天。

10.权利要求1至5中任一所述医用补片在制备用于治疗女性盆底功能障碍性疾病的产品中的应用。