CN103316074B - 一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物及其制剂、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物制剂的组合方法及制备方法，更具体地说，涉及一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物及其制剂、应用。由花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组成，其中花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物重量配比为6.4–12.8:8.16–32.64:1–4。花锚提取物中1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮含量不低于1.0%；黄芪提取物中黄芪甲苷含量不低于0.15%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不低于0.03%；甘草提取物中甘草酸含量不低于7.0%，甘草苷含量不低于0.5%。花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物制成组合药物后每一剂量单位中含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸、甘草苷的量分别为下述重量范围2.72–5.44mg、0.428–1.714mg、0.122–0.49mg、1.78–7.12mg、0.285–1。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物制剂的组合方法及制备方法，更具体地说，涉及一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物及其制剂、应用。
背景技术
我国是乙型肝炎高发区，堪称“肝炎大国”。在法定传染病中，其发病率仅次于感染性腹泻与流行性感冒而居第三位。我国人群中的乙肝表面抗原的携带率高达10%以上，他们中的四分之一最终将发展成慢性肝炎、肝硬变或原发性肝癌。乙肝不仅严重影响人体健康，而且给家庭、社会造成沉重的经济负担，我国每年用于肝炎和肝病的医疗、保健费用高达1000多亿元。乙型肝炎已成为我国重大的公共卫生问题之一，高效价廉的乙肝药物有巨大的经济效益和社会效益。
乙肝健收载于《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第十二册，口服，A、B片合用，一次各2～3片，一日3次。
主要功能为利胆退黄，改善肝功，调节免疫机能。用于急慢性乙型肝炎和其他肝炎。
花锚(Halenia elliptica D．Don)是龙胆科花锚属一年生草本植物，是“藏茵陈”类药用植物中的一种，主产于青藏高原，以全草或地上部分入药，味苦，性寒，具有清热祛湿，疏肝利胆等功效。用于治疗急性黄疸型肝炎、胆囊炎、头昏头痛等症，是我国藏族、羌族民间常用草药之一。其主要化学成分为口山酮及口山酮苷类成分，1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、1，7-二羟基-2，3，4，5-四甲氧基口山酮、1，5-二羟基-2，3，7-三甲氧基口山酮、1，2-二羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮等。
黄芪为豆科植物Astragalus membranaceus(Fisch) Bge.Var.Monghoicus (Bge.)Hisao 或膜英黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.的干燥根。黄芪含有多种有效成分，主要有黄芪皂苷甲、乙、丙，黄酮类，黄芪多糖A、B、C、D及氨基酸类等， 黄芪总皂苷具有抗炎、镇痛和免疫调节作用，不仅有免疫增强作用，亦有免疫调节作用；同时具有降压作用，强心作用，保护心肌细胞、提高心脏保存作用，对脑血管的保护作用，抗生物氧化作用，提高抗御自由基攻击的能力等。黄芪能提高免疫球蛋白、促进抗体产生、对B淋巴细胞免疫功能具有明显的增强作用，对T淋巴细胞功能也有增强作用。
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat．或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。性味甘、平，有止咳、平喘、化痰及肾上腺皮质激素样作用，能抗炎、抗衰老、调和诸药，通行十二经，为广泛使用的传统中药之一。主要有效成分为三萜类化舍物(甘草甜素和甘草酸盐、甘草次酸等)．黄酮类化合物(甘草黄碱酮、异甘草黄酮、甘草素等)及甘草多糖类化合物等三大类成分。具有免疫调节、抗病毒等感染、抗炎和抗过敏作用。
由于中药材的产地或收获季节等对药材质量影响较大，传统中药成品按处方比例称取规定量的中药材进行生产，导致每批产品的功效可能不一致，存在一定的缺陷。乙肝健片由花锚、黄芪及甘草三味中药组成，共制成A、B两种片剂，服用时需两种同时服用，增加了生产成本及降低了患者的依从性。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物及其制剂、应用，是一种乙肝疾病的药物及其制备方法、应用，通过对花锚、黄芪、甘草药材中的有效部位研究，改进了提取工艺，针对有效成分进行提取，制定提取物检测指标，并制订质量标准，最后通过药效试验后确定各提取物的最佳比例（提取物用量以指标成分的含量计算后称取），这样既提高了药物的疗效，同时又保证每批成品的疗效基本一致性。而且将A、B片合二为一，降低生产成本，方便患者服用。经药效学正交实验，表明各组方组的药效主要和花锚提取物的量（也即是1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮的量）基本成正相关，和黄芪提取物、甘草提取物的量无明显的相关性，药效比较明显的组方中1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮的含量明显比乙肝健片中的含量高，可以看出，对比药物乙肝健片中花锚用量相对偏少，从药效实验结果来看，每最小剂量单位含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮含量在2.72~5.44mg之间，疗效较好，故用本发明制成的制剂药效超过了乙肝健片。
一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物是采取以下技术方案实现：
一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于，它由花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组成，其中花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物重量配比为6.4–12.8: 8.16–32.64:1–4。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物，其特征在于，花锚提取物中1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮含量不低于1.0%；黄芪提取物中黄芪甲苷含量不低于0.15%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不低于0.03%；甘草提取物中甘草酸含量不低于7.0%，甘草苷含量不低于0.5%。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于，花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物制成组合药物后每一最小剂量单位（即每一片、粒、包等）中含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸、甘草苷的量分别为下述重量范围2.72–5.44（mg）、0.428–1.714（mg）、0.122–0.49（mg）、1.78–7.12（mg）、0.285–1.14（mg）。服用方法为一日3次，每次2～3最小剂量单位。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于，花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物制成组合药物后每一最小剂量单位中含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸、甘草苷量分别为下述重量组合中的任何一组：2.72mg、0.428 mg、0.122 mg、3.56 mg、0.57 mg，5.44 mg、0.428 mg、0.122 mg、7.12 mg、1.14 mg，5.44 mg、0.857 mg、0.245 mg、1.78 mg、0.285 mg，5.44 mg、1.714 mg、0.49 mg、3.56 mg、0.57 mg。服用方法为一日3次，每次2～3最小剂量单位。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物制备方法，其特征在于，
（1）花锚按下述工艺流程提取：将净选后的花锚切制称量，置提取罐内，分别加入70%乙醇10倍量、8倍量，回流提取两次，第一次3小时，第二次2小时，过滤，放出回流液，合并二次回流液，回收乙醇，浓缩至稠膏, 干燥、粉碎成细粉即得。
（2）黄芪按下述工艺流程提取：将净选后的黄芪饮片称量，置提取罐内，加水煮提两次，第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，静置，过滤，合并上清液, 浓缩至稠膏，干燥、粉碎成细粉即得提取物。
（3）甘草按下述工艺流程提取：取净选后的甘草，润透，切片，加水煎煮两次。第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉即得提取物。
（4）提取物经含量测定后，根据含量数据按重量配比分别称取提取物，加入适宜的药用辅料后按制剂工艺制成制剂。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于其制剂为口服制剂。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于含有口服制剂的药用辅料。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于口服制剂包括硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂。
所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物在制备治疗急慢性乙型肝炎和其他肝炎药物中应用。功能主治为利胆退黄，改善肝功，调节免疫机能。用于治疗急慢性乙型肝炎(乙肝)和其他肝炎。
所述的口服制剂的药用辅料选用微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、聚维酮K30(PVPK30)、色拉油、蜂蜡、氢化棕榈油、大豆磷脂、甲基硅油、蔗糖、淀粉、打浆淀粉、香精。
本发明是一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物及其制剂、应用，通过对花锚、黄芪、甘草药材中的有效部位研究，改进了提取工艺，针对有效成分进行提取，制定提取物检测指标，并制订质量标准，最后通过药效试验后确定各提取物的最佳比例（提取物用量以指标成分的含量计算后称取），这样既提高了药物的疗效，同时又保证每批成品的疗效基本一致性。而且将A、B片合二为一，降低生产成本，方便患者服用。从药效试验来看，用本发明制成的制剂药效超过了乙肝健片。本发明制成的制剂量效关系清析，成分明确，制剂质量稳定可控，疗效较好，能满足临床需求。
具体实施方式
以下通过实施例，结合药效学试验结果，进一步说明本发明，下述实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。
一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物制备方法，其方法如下：
（1）花锚按下述工艺流程提取：将净选后的花锚切制称量，置提取罐内，分别加入70%乙醇10倍量、8倍量，回流提取两次，第一次3小时，第二次2小时，过滤，放出回流液，合并二次回流液，回收乙醇，浓缩至稠膏, 干燥、粉碎成细粉，即得花锚提取物；
（2）黄芪按下述工艺流程提取：将净选后的黄芪饮片称量，置提取罐内，加水煮提两次，第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，静置，过滤，合并上清液, 浓缩至稠膏，干燥、粉碎成细粉，即得黄芪提取物；
（3）甘草按下述工艺流程提取：取净选后的甘草，润透，切片，加水煎煮两次。第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得甘草提取物；
（4）提取物经含量测定后，根据含量数据按重量配比分别称取提取物，加入药用辅料后按制剂工艺制成制剂。
实施例1
处方（组方4）：
花锚提取物 160g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮2.72mg×1000）
黄芪提取物 204g
（含黄芪甲苷0.428 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.122 mg×1000）
甘草提取物 50g
（含甘草酸3.56 mg×1000、甘草苷0.57 mg×1000）
微晶纤维素 50 g
羧甲基淀粉钠 70g
硬脂酸镁 2g
聚维酮K30(PVPK30) 适量
制法：按处方称取花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠，混合均匀。加入4%的PVPK30液混合揉制成软材，过20目筛，制湿粒。在50～60℃干燥2小时后，用18目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，用胶囊灌装得1000粒。用法与用量：口服，一次2～3粒，一日3次。
实施例2
处方（组方4）：
花锚提取物 160g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮2.72mg×1000）
黄芪提取物 204g
（含黄芪甲苷0.428 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.122 mg×1000）
甘草提取物 50g
（含甘草酸3.56 mg×1000、甘草苷0.57 mg×1000）
色拉油 500g
蜂蜡 40g
氢化棕榈油 60g
大豆磷脂 50g
甲基硅油 3g
制法：取色拉油，加入蜂蜡、氢化棕榈油，加热使其溶解，放冷，加入大豆磷脂，搅匀，加入花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，搅匀，胶体磨研匀，加入甲基硅油，减压除气，药液压制成软胶囊1000粒。用法与用量：口服，一次2～3粒，一日3次。
实施例3
处方（组方4）：
花锚提取物 160g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮2.72mg×1000）
黄芪提取物 204g
（含黄芪甲苷0.428 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.122 mg×1000）
甘草提取物 50g
（含甘草酸3.56 mg×1000、甘草苷0.57 mg×1000）
蔗糖 700g
淀粉 450g
打浆淀粉 80g
香精 3 ml
制法：称取处方量的花锚提取物、黄芪提取物、甘草提取物、蔗糖和淀粉，粉碎过100目筛，并充分混和半小时；将打浆淀粉冲成10%淀粉浆，放冷备用。搅拌下将淀粉浆加入到已混和好的料中，制成软材，过14目筛，制湿粒。湿粒于50～60℃干燥2小时，整粒后喷入香精，放置半小时，分装得1000包。用法与用量：口服，一次2～3包，一日3次。
实施例4
处方（组方4）：
花锚提取物 160g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮2.72mg×1000）
黄芪提取物 204g
（含黄芪甲苷0.428 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.122 mg×1000）
甘草提取物 50g
（含甘草酸3.56 mg×1000、甘草苷0.57 mg×1000）
微晶纤维素 50 g
羧甲基淀粉钠 70g
硬脂酸镁 1.5g
聚维酮K30(PVPK30) 适量
制法：按处方称取花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠，混合均匀。加入4%的PVPK30液混合揉制成软材，过16目筛，制湿粒。在50～60℃干燥2小时后，用14目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，制成1000 片，即得片剂。用法与用量：口服，一次2～3片，一日3次。
实施例5
处方（组方7）：
花锚提取物 320g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮5.44mg×1000）
黄芪提取物 204g
（含黄芪甲苷0.428 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.122 mg×1000）
甘草提取物 100g
（含甘草酸7.12 mg×1000、甘草苷1.14 mg×1000）
微晶纤维素 150 g
羧甲基淀粉钠 220g
硬脂酸镁 5g
聚维酮K30(PVPK30) 适量
制法：按处方称取花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠，混合均匀。加入4%的PVPK30液混合揉制成软材，过16目筛，制湿粒。在50～60℃干燥2小时后，用14目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，制成1000 片，即得片剂。用法与用量：口服，一次2～3片，一日3次。
实施例6
处方（组方8）：
花锚提取物 320g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮5.44mg×1000）
黄芪提取物 408g
（含黄芪甲苷0.857 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.245mg×1000）
甘草提取物 25g
（含甘草酸1.78 mg×1000、甘草苷0.285mg×1000）
微晶纤维素 100 g
羧甲基淀粉钠 160g
硬脂酸镁 4g
聚维酮K30(PVPK30) 适量
制法：按处方称取花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠，混合均匀。加入4%的PVPK30液混合揉制成软材，过16目筛，制湿粒。在50～60℃干燥2小时后，用14目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，制成1000 片，即得片剂。用法与用量：口服，一次2～3片，一日3次。
实施例7
处方（组方9）：
花锚提取物 320g
（含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮5.44mg×1000）
黄芪提取物 816g
（含黄芪甲苷1.714 mg×1000、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.49 mg×1000）
甘草提取物 50g
（含甘草酸3.56 mg×1000、甘草苷0.57mg×1000）
微晶纤维素 150 g
羧甲基淀粉钠 220g
硬脂酸镁 5g
聚维酮K30(PVPK30) 适量
制法：按处方称取花锚提取物、黄芪提取物和甘草提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠，混合均匀。加入4%的PVPK30液混合揉制成软材，过16目筛，制湿粒。在50～60℃干燥2小时后，用14目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，制成1000 片，即得片剂。用法与用量：口服，一次2～3片，一日3次。
花锚提取物质量标准：
鉴别：称取本品约0.15g，置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml超声处理40分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取花锚对照材1g，同法制成对照药材溶液；再取1－羟基－3，4，5－三甲氧基口山酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，石油醚（60~90℃）－丙酮（7：3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
水分：取本品2~5g，置100~105℃干燥至恒重（连续两次的重量差异不超过5mg），应不得过10.0%。
含量测定：色谱条件与***适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.5%磷酸溶液（65：35) 为流动相；检测波长为243nm。理论板数按1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮峰计算应不低于4000 。
对照品溶液的制备：取1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l m l含0.08mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷．再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm )滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得。
本品按干燥品计算含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮不得少于1.0％。
黄芪提取物质量标准
鉴别：称取本品粉末1.5g，加甲醇20ml，加热回流1 小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱（100～120目，5g，内径10～15mm）上，用40％甲醇100ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2 次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2 次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml 使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以氯仿－甲醇－水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯(365nm) 下显相同的橙黄色荧光斑点。
水分：取本品2~5g，置100~105℃干燥至恒重（连续两次的重量差异不超过5mg），应不得过10.0%。
含量测定：黄芪甲苷
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（32：68) 为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000 。
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l m l含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品约1.5g，精密称定，置索氏提攻器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml ，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40m l ，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径为1.5cm，柱高为12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30mt洗脱，弃去洗脱液，继用70% 乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
本品按干燥品计算含黄芪甲苷(C41H68O14)不得少于0.15％。
毛蕊异黄酮葡萄糖苷
| 时间（分钟） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0?20 | 20→40 | 80→60 |
| 20?30 | 40 | 60 |
色谱条件与***适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动性A，以0.2%甲酸溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.6g，精密称定.置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过.精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 各l0μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含毛蕊异黄酮葡萄糖苷（C22H22O10）不得少于0.03%。
甘草提取物质量标准
鉴别：取本品lg，加水40ml溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml(必要时离心），合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每lml含2mg 的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl ，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。
水分：取本品2~5g，置100~105℃干燥至恒重（连续两次的重量差异不超过5mg），应不得过10.0%。
含量测定：照高效液相色谱法测定。
色谱条件与***适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A ，以0.05 %磷酸溶液为流动相B ，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm 。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000 。
对照品溶液的制备：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每lml含甘草苷20μg、甘草酸铵0.2mg的溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1. 0207)。
供试品溶液的制备：取本品细粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100ml ，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计，含甘草苷（C21H22O9)不得少于0. 50%，甘草酸（C42 H62O16 )不得少于7.0%。
花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对肝损伤和肝纤维化的影响
一、简述
对于CCl4引起的小鼠急性肝损伤治疗效果较好的三种提取物的配比为组方4，5，6，7，8，9。但是以上拆方均能有效降低小鼠急性肝损伤引起的GPT和GOT（组方1、3组 P≮0.05）的释放（P<0.05）。
对于CCl4引起的大鼠慢性肝损伤治疗效果较好的三种提取物的配比为组方4，5，6，7，8，9。以上组方均能有效降低大鼠慢性肝损伤引起的GPT和GOT的释放（P<0.05）。
二、试验目的
根据新西药临床前研究指导原则的要求，研究受试药花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对肝损伤和肝纤维化的影响，初步摸索出较佳的剂量配比，为进一步研究提供试验依据。
三、实验材料
1、药物与试剂
CCl4：南京化学试剂有限公司，批号：10102511136
谷丙转氨酶(GOT)，谷草转氨酶(GPT)试剂盒：南京建成生物工程有限公司，批号：20130305
2、试验动物
清洁级小鼠，体重18-22g，浙江省实验动物中心提供，动物生产质量合格证号：SCXK（浙）2009-0033。
雄性清洁级SD大鼠，体重180～220g，浙江省实验动物中心提供，动物生产质量合格证号：SCXK（浙）2009-0033。
四、实验方法
1、花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响
SPF级小鼠96只，雌雄各半，随机分为12组，每组8只，即正常组，模型组，阳性组乙肝健片0.94g/kg，1号-9号组方组。各组每天灌胃给药，给药容量为0.2ml/10g·d-1，连续给药10天。正常组和模型组给予0.5%CMC-Na，末次给药后禁食不禁水，8 h后，除正常组外，其余各组均腹腔注射(ip) 0.08%CCl4花生油溶液0.1 ml/10g，12 h后眼球取血，分离血清（1）。检测血清中的谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性；取肝脏、脾脏称量，计算肝指数、脾指数，将肝脏用10%***固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观察肝组织病理改变。
2、花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响
SPF级SD大鼠96只，随机分为12组，模型组8只； 每组8只，即正常组，模型组，阳性组乙肝健片0.47g/kg，1号-9号组方组。大鼠分组后，除正常对照组外，其余动物给40% CC14油溶液皮下注射2次/周，注射CC14时精确计算剂量，首次皮下注射量为0.8 ml /kg，以后注射量为0.5 ml /kg。同时实验各组均分别灌服各自药物，正常组和模型组给予0.5%CMC-Na，给药容积为0.5mL/100g体重，每3天根据鼠体重变化调整1次给予CC14的量和灌服药物的剂量. 8wk后眼静脉采血，检测血清中的谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)的活性（2）。之后处死动物，取肝脏、脾脏称量，计算肝指数、脾指数，将肝脏用10%***固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观察肝组织纤维化病理改变程度。
阳性药乙肝健片：人用量 一次6片（A，B各3片），一日3次，
正交试验，采用三因素三水平，水平采用标准提取物重量的50%、100%、200%，需组方成9次实验。
表 1人用量实验方案列表
各组方组的最小剂量单位及乙肝健片中相应各指标成分含量
药理试验时举例说明：如进行组方1实验时称取花锚提取物80mg、黄芪提取物204mg、甘草提取物25mg共309mg混匀，即为一个最小剂量单位，与上市样品乙肝健一片A片加一片B片的效果进行对比。再按照人用量为一次3片（即人用一次为309*3mg），一日3次，然后折算成小鼠和大鼠的用量。
经过剂量转换的动物给药剂量为（3）：
表2大鼠每天用量实验方案列表
| 因素 | 花锚提取物(mg/kg) | 黄芪提取物(mg/kg) | 甘草提取物(mg/kg) | 总量(mg/kg) |
| 组方1 | 74 | 188.7 | 23.125 | 285.825 |
| 组方2 | 74 | 377.4 | 46.25 | 497.65 |
| 组方3 | 74 | 754.8 | 92.5 | 921.3 |
| 组方4 | 148 | 188.7 | 46.25 | 382.95 |
| 组方5 | 148 | 377.4 | 92.5 | 617.9 |
| 组方6 | 148 | 754.8 | 23.125 | 925.925 |
| 组方7 | 296 | 188.7 | 92.5 | 577.2 |
| 组方8 | 296 | 377.4 | 23.125 | 696.525 |
| 组方9 | 296 | 754.8 | 46.25 | 1097.05 |
表3小鼠用量实验方案列表
| 因素 | 花锚提取物(mg/kg) | 黄芪提取物(mg/kg) | 甘草提取物(mg/kg) | 总量(mg/kg) |
| 组方1 | 148 | 377.4 | 46.25 | 571.65 |
| 组方2 | 148 | 754.8 | 92.5 | 995.3 |
| 组方3 | 148 | 1509.6 | 185 | 1842.6 |
| 组方4 | 296 | 377.4 | 92.5 | 765.9 |
| 组方5 | 296 | 754.8 | 185 | 1235.8 |
| 组方6 | 296 | 1509.6 | 46.25 | 1851.85 |
| 组方7 | 592 | 377.4 | 185 | 1154.4 |
| 组方8 | 592 | 754.8 | 46.25 | 1393.05 |
| 组方9 | 592 | 1509.6 | 92.5 | 2194.1 |
五、实验结果
1. 花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响
表4不同组方对小鼠CCl4致急性肝损伤的GOT与GPT的影响 (±S， n=8)
实验数据表明，模型组的GOT和GPT均明显的高于正常对照组，提示模型制作成功（P<0.05）。
与模型组比较，阳性药及各个组方组能显著降低GPT与GOT的释放（P<0.05，P<0.01）。与阳性药相比，组方7，8，9的 GOT的降低趋势明显，但是无显著性统计学差异。而各个组方均有降低GPT释放的作用，其中降低明显的组方组为7，8，9。
以上各个实验组对于GOT的改善作用：正常对照组>组方8>组方9>组方7>组方4>组方6>阳性药组>组方5>组方2>组方3>组方1>模型组。
以上各个实验组对于GPT的改善作用：正常对照组>组方8>组方9>组方7>组方6>组方4>阳性药组>组方5>组方1>组方3>组方2 >模型组。
2. 花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组合药物对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响
表5不同组方对大鼠CCl4致慢性肝损伤的GOT与GPT的影响 (±S， n=8)
实验数据表明，模型组的GOT和GPT均明显的高于正常对照组，提示模型制作成功（P<0.05）。
与模型组比较，阳性药及各个组方组能显著降低GPT与GOT（组方1、3组 P≮0.05）的释放（P<0.05）。
与阳性药比较，组方7，8，9的GOT的释放显著低于阳性药组（P<0.05）。同时组方4虽无统计学差异，但降低趋势明显。组方7，8，9与阳性药相比较，能显著改善GPT的释放（P<0.05）。
以上各个实验组对于GOT的改善作用：正常对照组>组方8>组方9>组方7>组方4>组方6>组方5>阳性药组>组方1>组方2 >组方3>模型组
以上各个实验组对于GPT的改善作用：正常对照组>组方7>组方9>组方8>组方5>组方4>阳性药组>组方6>组方2>组方3>组方1>模型组。
综合来看，组方4、7、8、9组有较好的药效，从有效成分的量效关系看，花锚提取物的量起主要作用，提示组方4、7、8、9组值得进一步开发研究。
3. 大鼠肝脏标本病理检查
正常组：肝脏组织结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈索状排列，肝细胞无明显的变性、坏死，有较多的糖原贮积，胞浆疏松淡染，肝窦无扩张充血，间质无炎细胞浸润。
模型组：肝脏组织结构尚完整，4例肝脏部分肝细胞见不同程度的脂变，胞浆中见大小不等的脂滴空泡，肝脏肝窦无扩张充血，间质均无炎细胞浸润，2例肝脏间质少量纤维增生。
阳性药组：肝脏组织结构尚完整，3例肝脏少部分肝细胞脂变，胞浆中见大小不等的脂滴空泡，肝脏肝窦无扩张充血，间质均无炎细胞浸润。
1-9剂量组：肝脏组织结构尚完整，各组均有几例分不同程度的肝细胞脂变，胞浆中见大小不等的脂滴空泡，肝脏肝窦无扩张充血，1-8组肝脏间质均无炎细胞浸润，9组4例肝脏间质见炎性灶，炎细胞主要为单核细胞，5组1例间质少量纤维增生。
与正常组比较，模型组4例肝脏肝细胞脂变，阳性药组和各治疗组见相同的病理特征，评分由高到低为：模型组> 9>阳性药组>7、8 > 4、5 >3 > 6>2 >1>正常组。
六、讨论
本实验组方的配比结论的依据主要根据酶活力的结果进行。肝脏指数和脾脏指数虽然有一定的意义，但是动物两个指数的差异主要是由于体重在模型制作过程中由于肝脏功能的异常而营养不良的情况下产生的差异。因此只能作为辅助评判指标。酶活力的检测能直接的反应肝脏的功能情况，因此作为进行实验结论的主要依据。
为进一步明确花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物在组方中的作用，我们采用L9（34）正交试验对药效实验的结果进行分析，以检测血清中的谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)的活性为指标，数据统计和结果分析如下：
表6：因素水平表
不同组方对小鼠CCl4致急性肝损伤的GOT与GPT的影响见下表
不同组方对大鼠CCl4致慢性肝损伤的GOT与GPT的影响见下表
采用直观法对正交结果分析：
因素A（花锚提取物）——因素A对血清中的谷丙转氨酶(GOT)有显著影响，对谷草转氨酶(GPT)有显著影响，为三种因素中的主要因素，是起药效作用的主要成分，且其药效随提取物增加而增加，说明花锚提取物量的增加，可能会提高药效。
因素B（黄芪提取物）——因素B对血清中的谷丙转氨酶(GOT)明显影响不明显，对谷草转氨酶(GPT)影响不明显。说明黄芪提取物的量，和药效没有明显量效关系，起辅助治疗的效果。
因素C（甘草提取物）——因素C对血清中的谷丙转氨酶(GOT)影响不明显，对谷草转氨酶(GPT)影响不明显，说明甘草提取物的量，和药效没有明显量效关系，起辅助治疗的效果。
七、实验结论
对于CCl4引起的小鼠急性肝损伤治疗效果较好的三种提取物的配比为组方4，5，6，7，8，9。但是以上拆方均能有效降低小鼠急性肝损伤引起的GPT和GOT（组方1、3组 P≮0.05）的释放（P<0.05）。
对于CCl4引起的大鼠慢性肝损伤治疗效果较好的三种提取物的配比为组方4，5，6，7，8，9。以上组方均能有效降低大鼠慢性肝损伤引起的GPT和GOT的释放（P<0.05）。
Claims (7)
1.一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于，由花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物组成，其中花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物重量配比为下面重量配比中的任何一组：160:204:50、320:204:100、320:408:25、320:816:50；
所述花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物的制备方法包括：
（1）花锚按下述工艺流程提取：将净选后的花锚切制称量，置提取罐内，分别加入70%乙醇10倍量、8倍量，回流提取两次，第一次3小时，第二次2小时，过滤，放出回流液，合并二次回流液，回收乙醇，浓缩至稠膏, 干燥、粉碎成细粉，即得花锚提取物；
（2）黄芪按下述工艺流程提取：将净选后的黄芪饮片称量，置提取罐内，加水煮提两次，第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，静置，过滤，合并上清液, 浓缩至稠膏，干燥、粉碎成细粉，即得黄芪提取物；
（3）甘草按下述工艺流程提取：取净选后的甘草，润透，切片，加水煎煮两次；
第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得甘草提取物；
（4）提取物经含量测定后，根据含量数据按重量配比分别称取提取物，加入药用辅料后按制剂工艺制成制剂；
花锚提取物中1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮含量不低于1.0%；黄芪提取物中黄芪甲苷含量不低于0.15%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不低于0.03%；甘草提取物中甘草酸含量不低于7.0%，甘草苷含量不低于0.5%。
2.根据权利要求1所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于：花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物制成组合药物后每一剂量单位中含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸、甘草苷的量分别为下述重量范围2.72–5.44mg、0.428–1.714mg、0.122–0.49mg、1.78–7.12mg、0.285–1.14mg。
3.根据权利要求1所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于：花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物制成组合药物后每一剂量单位中含1-羟基-3，4，5-三甲氧基口山酮、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸、甘草苷量分别为下述重量组合中的任何一组：2.72mg、0.428 mg、0.122 mg、3.56 mg、0.57 mg，5.44 mg、0.428 mg、0.122 mg、7.12 mg、1.14 mg，5.44 mg、0.857 mg、0.245 mg、1.78 mg、0.285 mg，5.44 mg、1.714 mg、0.49 mg、3.56 mg、0.57 mg。
4.根据权利要求1所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于：其制剂为口服制剂。
5.根据权利要求4所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于：含有口服制剂的药用辅料。
6.根据权利要求5所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物，其特征在于：口服制剂包括硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂。
7.权利要求1所述的一种花锚提取物、黄芪提取物与甘草提取物的组合药物在制备治疗急慢性乙型肝炎和其他肝炎药物中应用。
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