CN103305469A - 适应无血清培养的重组蛋白高表达细胞株qb-tn9-4s-cl-f及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株适应无血清培养的重组蛋白高表达细胞克隆株QB-TN9-4S-CL-F及其应用。本发明所述的细胞株，其微生物保藏号是：CCTCC No:C201327。本发明所获的适应无血清培养的细胞株在Sf900ⅢSFM（简称Sf900III）培养基中连续传代50次后仍在形态、生长特性及对病毒敏感性方面与在含10%血清培养基中培养无明显差别，但此无血清培养的克隆株重组蛋白表达水平却比在含10%血清的完全培养基中明显提高，从而避免了基因工程表达产物的纯化和后处理的难题，在外源基因活性蛋白工业化生产方面展示了广阔的前景。同时，本发明的细胞克隆株对病毒高度敏感，产量与在血清培养中相似，为大规模低成本生产病毒杀虫剂提供了良好途径。

Description

适应无血清培养的重组蛋白高表达细胞株QB-TN9-4S-CL-F及其应用

技术领域

本发明涉及无血清培养的昆虫细胞系，尤其涉及粉纹夜蛾细胞克隆株QB-TN9-4S-CL-F（简称QB-Tn9-CL-F）的无血清培养。本发明还涉及无血清条件下该细胞克隆在制备病毒杀虫剂和重组蛋白生产中的用途，属于细胞生物学和生物技术领域。

背景技术

自世界上第一个昆虫细胞系建立以来（Grace1962），昆虫细胞培养已广泛的应用于生物学基础研究和生产领域。利用杆状病毒对昆虫细胞的感染，大量复制病毒作为生物杀虫剂，其产品与活虫体生产的产品比较具有很多优点（Wise anduaughn,1986；Granados efal.1987)。特别是杆状病毒--昆虫细胞表达载体***的建立，可通过病毒感染昆虫细胞，大量表达病毒携带的外源基因，生产重组蛋白(Luckowand Summers,1988）。由于这一***具有高效、安全、容量大、表达的产物具有生物活性等优点，所以昆虫的细胞培养无论在病毒杀虫剂的生产还是在生物学、医学及农业领域中的外源基因产物表达方面都是引人注目的很有发展潜力的载体（PingWang.efal.1992）。

目前人们已利用几种昆虫细胞系成功表达和生产多种昆虫病毒杀虫剂、疫苗和医学产品（Granados1994；Altman etal.1999）(Granados efal.2007)。通常昆虫培养基含10%的胎牛血清（FBS），以提供细胞生长的必要营养。由于胎牛血清价格昂贵而限制了病毒杀虫剂的离体大量生产；在生产重组蛋白过程中，培养基中血清的存在，也使表达的产物纯化和回收造成很大的困难，另一方面，在病毒复制阶段，低血清或无血清的培养基有助于提高重组蛋白的表达水平或多角体蛋白生产。开发稳定适应无血清培养的细胞株就成为降低成本提高产量的技术关键。为此，开发无血清培养基及细胞的无血清培养一直是昆虫细胞培养工程领域的研究热点。但这方面的报道甚少，在80年代报道Sf9（Spodoptera frug；perda）细胞株无血清培养的生长特性(Maiorala et.al.1988;Inlow et.al.1989)，最近有报道BTI-Tn5B1-4和HzAm1（棉铃虫的细胞系）细胞的无血清或低血清驯化（Granados et.al.1995戴虎等，2000；张佑红等，2005）。

在这些研究中尚无报道在无血清培养昆虫细胞长期传代后病毒的产量和外源基因产物表达。本发明人成功地驯化了一株新的细胞克隆QB-TN9-4S-CL-F。该克隆株在无血清培养中长期传代(P.50)后表现了稳定高产高表达的良好特性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是驯化出一株在无血清培养条件下保持旺盛的生命力，具有病毒高产，重组蛋白高表达的细胞。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株，命名为QB-TN9-4S-CL-F，简称QB-Tn9-CL-F，其微生物保藏号是：CCTCC NO：C201327；分类命名是：粉纹夜蛾细胞系；保存时间是2013年4月9日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心；保存地址是：武汉大学。

稳定适应无血清培养的细胞可克服昂贵血清造成的生产成本高，表达产物不易纯化，表达水平低等细胞培养工程领域中的难题。为此本发明利用多种无血清培养基（TC-100，Grace‘s，Sf900Ⅲ）在不同的细胞株中测试筛选，经多次递减血清重复培养、筛选，最终获得可在Sf900ⅢSFM（简称Sf900III）培养基中长期稳定培养的细胞株。本发明所获的适应无血清培养的细胞株在Sf900Ⅲ培养基中连续传代50次以上生长良好，特征稳定，与在含10%血清培养基中培养时无明显差别。在表达水平上，无血清培养的QB-Tn9-CL-F克隆株重组蛋白表达水平比在完全培养基中培养时明显提高，由于无胎牛血清也避免了基因工程表达产物的纯化和后处理的难题。因此在外源基因活性蛋白工业化生产方面展示了广阔的前景。

此外，本发明还提出了所述的适应无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途。

在用于制备杀虫病毒时，可直接利用杀虫病毒感染所述的细胞克隆株，进行无血清悬浮培养，进行杀虫病毒的大量生产。

所述的杀虫病毒包括能感染该细胞所有昆虫病毒，优选的，所述的杀虫病毒为可作为生物杀虫剂的苜蓿夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）或其它种类的杀虫病毒。

本发明的无血清培养的细胞克隆株对AcMNPV高度敏感，产量可与在血清培养的相似，为大规模低成本生产病毒杀虫剂提供了良好的途径。

在用于制备重组蛋白时，包括构建含有目的基因的表达载体或重组病毒，将该重组表达载体直接转化到所述的细胞克隆株或用重组病毒侵染所述的细胞克隆株，然后进行无血清悬浮培养，生产重组蛋白。

所述的重组蛋白包括β-半乳糖苷酶（β-galactoridase）或重组碱性磷酸酶（SEAP）；或者是农业、医药和其他领域所需要的蛋白。

本发明的细胞株在无血清培养基中培养与在含10%血清的完全培养基中比较，重组蛋白SEAP和β-gal产量提高近2倍，所以本发明的细胞株也是其他重组蛋白生产的良好载体。

附图说明

图1为QB-Tn9-CL-F细胞的形态；

A：在完全培养基（TNM-FH）中培养（第86代）；B：在无血清培养基（Sf900Ⅲ）中培养20代；C：在无血清培养基中培养30代；D：在无血清培养基中培养50代；

说明QB-Tn9-CL-F细胞系在无血清培养基中长期传代后其形态与在完全培养基（TNM-FH）中培养无明显差别；

图2为无血清培养的QB-Tn9-CL-F细胞与完全培养基培养的Tn-5B1-4和Sf-9细胞的生长曲线比较：

说明无血清培养的QB-Tn9-CL-F细胞的生长速率与完全培养基中Tn-5B1-4细胞（商品名为HighFive，目前广泛应用的优良细胞）相似，且显著高于完全培养基培养的Sf-9细胞；

图3为感染AcMNPV病毒的QB-Tn9-CL-F细胞；

A、C分别为20代和50代细胞在完全培养基中的细胞感染；

B、D分别为20代和50代细胞在无血清培养基中的细胞感染；

图4为各细胞系分别在无血清和完全培养基中生长时的β-gal.表达：

说明无血清培养的QB-Tn9-CL-F细胞β-gal.表达显著高于其他完全培养基中的细胞，在感染第8天的表达是该细胞在完全培养基中的1.8倍；

图5为各细胞系分别在无血清和完全培养基中生长时的SEAP表达：

说明无血清培养的QB-Tn9-CL-F细胞SEAP表达在第7天就显著高于其他完全培养基中所有细胞表达，其表达量约为该细胞在完全培养基中的2.0倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例实施只是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1无血清培养昆虫细胞QB-Tn9-CL-F的适应过程

1.1无血清培养的适应过程：

首先将来自完全培养基（含10%FBS）对数生长期的粉纹夜蛾细胞系QB-TN9-4S的克隆株（按2.0×10⁵cells/ml浓度）传代于含不同浓度血清的几种无血清培养基（TC-100，EX CELL-420，SF-900III）中培养，开始时调整培养基中血清浓度为5%，28℃静置培养，每天观察细胞生长状况，待细胞生长到铺满瓶底后，将细胞吹打成悬浮液，测定细胞存活数，根据活细胞比率再按上述细胞浓度传代，当细胞活性稳定在90%以上，再将细胞传入含2.5%FBS的培养基中。用同样的方法使细胞在2.5%、1.25%、0.625%FBS的培养基中得以适应，最后获得在无血清的培养基SF-900Ⅲ中生长稳定的细胞株。此为无血清培养的第一代细胞株。

1.2长期传代后细胞稳定性测定：

按常规的传代方法，将5ml第一代2.0×10⁵cells/ml无血清培养的细胞接入25㎝²培养瓶中，28℃培养，三天后测定活细胞浓度。如此重复50次，每次传代后观察细胞的生长状况而每隔五次测定一次活细胞数并记录。测定第50代，结果可看出，长期培养后，此无血清培养的细胞生物活性比较稳定。

本发明所获得的一株适应无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株，命名为QB-TN9-4S-CL-F，简称QB-Tn9-CL-F，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C201327；保存时间是2013年4月9日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心；保存地址是：武汉大学。

1.3.细胞克隆株形态及生物学特性

a、细胞形态：细胞在Sf900Ⅲ无血清培养基中，28℃条件下培养3天，正值对数生长期，在倒置相差显微镜（Olympus，1×71Papam）下，观察细胞形态，测定大小。

结果：细胞形态、大小与在完全培养基中无明显差别。梭形细胞占80%以上，大小为18.4×49.4μm。

将在无血清培养基（Sf900Ⅲ）中培养的第20代、30代以及50代的QB-Tn9-CL-F细胞形态与在完全培养基（TNM-FH）中培养的第86代QB-Tn9-CL-F细胞的形态进行对比，结果表明QB-Tn9-CL-F细胞系在无血清培养基中长期传代后其形态与在完全培养基（TNM-FH）中培养无明显差别，结果如图1所示。

b.细胞生长：按Robert R.Granados.的方法（1994,J.Invert.

Pathol.,64:260-266），测定细胞生长曲线和群体倍增时间。将对数生长期的细胞（P.50）按1.0×10⁶细胞/5ml培养基的浓度接入25cm²培养瓶中，28°C条件下培养，每24小时取样测定细胞浓度。根据记录结果绘制细胞生长曲线，并按公式T=1/K(logN=Log N₀+K+log2)计算出群体倍增时间（T）。

结果：从细胞的生长特性可以看出，该细胞克隆株在无血清培养基中生长良好，与在完全培养基中的Tn5B1-4比较无显著差异，细胞生长最大密度在第五天分别达到1.90×10⁶细胞/ml和2.0×10⁶细胞/ml,其群体倍增时间分别为21.9hr和21.5hr。在无血清培养基Sf900Ⅲ中和在含10%胎牛血清的完全培养基（TNM-FH）中QB-TN9-CL-F细胞株和Sf-9细胞（TNM-FH培养基）的生长速率比较有明显的优势（Sf-9细胞的群体倍增时间为25.4hr），结果如图2所示。

实施例2本发明克隆株的病毒感染滴度（TCID₅₀）和多角体(OB)产量测定

根据Ping Wang的方法（1992,J.Invert.Pathol.，59：46-53），利用AcMNPV-1A(苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒)为毒源（Boyce Thomason Institate,Cornell University，Ithaca,NY,USA）,以MOI=10（Multiplicity of Infection）的感染指数接种对数期细胞，28°C下培养，每天观察感染状况，3天后将其悬浮，离心后，上清样品用于测定滴度；培养4天后，多角体完全形成，细胞尚未破裂时，在显微镜下观察并计算感染率。最后用超声波裂解细胞，释放出全部多角体后,用血球计算板计数可获得多角体产量(OBs/ml)。

试验结果：本发明细胞克隆株QB-TN9-4S-CL-F（简称为QB-Tn9-CL-F）在无血清培养基中对AcMNPV病毒敏感性和在完全培养基中比较无明显差异。在感染后4天测定。感染率平均在95%以上。此时在无血清培养基中已有30%细胞裂解，并释放出多角体到培养基中。两种培养基中细胞的出芽性病毒（BV）产量差异不显著，约为5.0×10⁷TCID₅₀/ml。细胞在无血清培养基中的多角体（OB）产量略高于在完全培养基中的细胞，平均分别为93.9OBs/细胞和91.4OBs/细胞，说明本发明为降低病毒杀虫剂生产成本提供良好的途径，图3及表1。

表1不同培养基中的感染率和病毒产量

实施例3重组蛋白在本发明无血清培养的细胞克隆QB-Tn9-4s-CL-F中的表达试验

一、试验方法

细胞系：

Sf-9细胞系、QB-Tn9-CL-A细胞系、QB-Tn9-CL-B细胞系、QB-Tn9-CL-C细胞系、QB-Tn9-CL-F细胞系、High Five（BTI-Tn5B1-4）细胞系。

按照Wickham和David的方法（1992，Bio/technology,10:1148-1150;1993,InNitro Cell Dev.Biol.29A：388-390），重组蛋白碱性磷酸酶(SEAP)和半乳糖苷酶（β-gal.）表达水平被测定。

1、β-gal.表达的测定：

将对数生长期的细胞分成两组，按2.0×10⁵细胞/2ml/孔的量接入24孔板中，分别用无血清的培养基（Sf900Ⅲ）及完全培养基（TNM-FH）进行培养，待细胞沉淀孔底时，轻轻吸除培养基上清。按MOI=10的侵染指数接入重组病毒AcMNPV-β-gal，每24小时间隔取样，在OD₄₂₀的光密度下测定密度值，根据以下公式可计算出表达水平（IU/ml）。

$\frac{\left(\mathrm{OD}\right)\left(1.5\mathrm{ml}\right)}{0.0045\×18.2\×0.002}$

2、SEAP表达的测定：

供试细胞按照上述步骤（β-gal.测定法）制备样品，然后以同样的侵染指数接入重组病毒AcMNPV-SEAP。每24小时间隔取样。在OD405光密度下测定密度值，根据以下公式测定表达水平（IU/ml）。

$\frac{\mathrm{OD}/\min .\×0.222}{0.56\×18.2\×0.002}$

二、试验结果

1、β-半乳糖苷酶（β-gal.）的表达水平

本发明的细胞克隆株QB-Tn9-CL-F在无血清培养中细胞与在完全培养基中细胞比较，表现显著的高表达水平。无血清培养中细胞的β-gal在第8天是在完全培养基中细胞的约1.8倍（图4）。

2、碱性磷酸酶（SEAP）的表达水平

本发明的细胞克隆株QB-Tn9-CL-F在无血清培养中细胞在第7天产生SEAP的产量明显高于在完全培养基中生长的其他细胞，可达约2.0倍（图5）。

从上述两种重组蛋白表达水平看，也证明低血清有利于外源基因产物的表达和多角体蛋白的生产的理论。

Claims (7)

1.一株适应无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株，命名为QB-TN9-4S-CL-F，简称QB-Tn9-CL-F，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C201327；保存时间是2013年4月9日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心；保存地址是：武汉大学。

2.权利要求1所述的适应无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：直接利用杀虫病毒感染所述的细胞克隆株，利用无血清悬浮培养，进行杀虫病毒的大量生产。

4.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：构建含有目的基因的表达载体或重组病毒，将该重组表达载体直接转化到所述的细胞克隆株中或用重组病毒侵染所述的细胞克隆株，然后进行无血清悬浮培养，生产重组蛋白。

5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的重组蛋白是β-半乳糖苷酶。

6.按照权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的重组蛋白是碱性磷酸酶。

7.按照权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的杀虫病毒是苜蓿夜蛾核型多角体病毒或其它种类的杀虫病毒。

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