CN103305442A

CN103305442A - 一种巴氏醋杆菌及其应用

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Publication number: CN103305442A
Application number: CN2013102384764A
Authority: CN
Inventors: 梁新乐; 施结燕
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103305442B

Abstract

一种巴氏醋杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明中巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）Ab3，保藏编号为CCTCCNO：M2013116，同时本发明公开了巴氏醋杆菌Ab3在发酵生产二羟基神经酰胺中的应用及在发酵生产食醋中的应用。本发明单位体积发酵液中得到的二羟基神经酰胺产率高，采用HPLC进行定量分析，单位体积发酵液中二羟基神经酰胺产率达8.69mg/L，采用超临界CO₂萃取技术和高速逆流色谱技术二羟基神经酰胺得率达83.7%，纯度达92.5%。

Description

一种巴氏醋杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种巴氏醋杆菌Ab3及其应用。

背景技术

神经酰胺的生理功能及应用领域阐述。神经酰胺类物质是皮肤角质层的重要组成成分，同时作为细胞内的第二信使，通过活化多种蛋白激酶和转录因子参与细胞内信号传导，从而调控细胞生长、增殖、分化、凋亡及损伤等多种生理、病理过程。近年相关研究发现神经酰胺在皮肤护理中起着活性因子的作用，具有皮肤保湿、防护、修复损伤等重要功效。因此它已成为一种重要的化妆品添加组分。神经酰胺是生物体内重要的的功能物质，具有抗肿瘤、抗肝病毒、降血脂、降血糖、减肥、抗衰老、美白等作用，具有很高的实际应用价值。

神经酰胺现有的生产方式描述。目前神经酰胺主要有三种来源：一是化学合成，二是从植物中提取，三种从真核生物如酵母菌真菌中提取。从植物、酵母菌和真菌中提取的神经酰胺主要是葡糖神经酰胺。目前极少数细菌（如支原体和蛭弧菌）细胞磷脂中也被发现存在鞘脂类。在现有的技术中，主要研究集中在从魔芋等植物中提取神经酰胺的方法。

作为一类新型的药物素、食品和化妆品活性成份，二羟基神经酰胺既能满足人们对安全性的要求，又具有巨大的应用价值。但目前二羟基神经酰胺的生产几乎未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用巴氏醋杆菌及其应用的技术方案。

本发明中的巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）Ab3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日：2013年4月1日，保藏号：CCTCC No：M2013116。

所述的巴氏醋杆菌Ab3在发酵生产二羟基神经酰胺中的应用。

所述的巴氏醋杆菌Ab3在发酵生产食醋中的应用。

所述的一种利用如权利要求1所述的巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）将所述的巴氏醋杆菌Ab3接种于营养培养基上，进行斜面培养；

2）对斜面培养得到的菌苔进行种子培养，得到种子液；

3）将种子液接种到发酵培养基中培养，得到巴氏醋杆菌Ab3发酵液和细胞菌泥，所述的发酵液即为食醋，所述的细胞菌泥分离提取后获得二羟基神经酰胺。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤1）中营养培养基的重量百分配比为5～6Bx^o麦芽汁，0.02～0.05% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、 0.05～0.1% CaCl₂、乙醇3～5%、琼脂1.5～2%，所述的营养培养基的pH=4.5～6.5，斜面培养温度为28～32 ℃，培养时间2～4天。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤2）中用0.9%生理盐水将斜面上培养的菌苔制成细胞悬液，并接种到100 mL种子培养基中培养，所述的种子培养基的重量百分配比为2～4%葡萄糖、0.5～1%酵母膏、0.1～0.3%蛋白胨、0.08～0.2% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、5～7%乙醇，水余量，所述的种子培养基的pH=4.0～5.0，培养温度30～33 ℃，转速120rpm，培养时间1～2天。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤3）中发酵培养基的重量百分配比为3～5%葡萄糖、0.5～1.5%复合氨基酸溶液、0.5～1%酵母膏、0.02～0.05% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、0.05～0.1% CaCl₂、6～20%乙醇，水余量，所述的发酵培养基pH=4.0～5.0，培养温度32～35℃，转速150～450rpm，培养时间2～4天，其中乙醇的使用量在于间歇式补加。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤3）中细胞菌泥经冷冻干燥后得到干细胞，采用干细胞:提取液按重量比1:1混合，室温下超声浸泡1.5小时，加萃取液进行萃取，过滤后所得有机相真空浓缩，获得二羟基神经酰胺粗品，所述的提取液中氯仿:乙醇:水的体积比为1:1:0.8，所述的萃取液中氯仿:水的体积比为1:1.25。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的干细胞采用超临界CO₂萃取，所得CO₂/乙醇流动相动挥发后，获得获得二羟基神经酰胺粗品。

所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的二羟基神经酰胺粗品采用高速逆流色谱分离精制，获得二羟基神经酰胺精品。

本发明中复合氨基酸溶液为市购产品，其含有甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、精氨酸和天门冬氨酸等18中氨基酸。

采用本发明的上述技术方案，根据菌株生长代谢过程中对氧需求量的不同进行分阶段控制溶氧，本发明在起始低乙醇和醋酸浓度发酵生产过程中通过流加乙醇、酵母浸出液等营养物质的方法流加碳源、氮源、生长因子的方法，并通过发酵不同阶段对溶氧的需求差异的情况下实现了二羟基神经酰胺生产菌的高密度培养，单位体积发酵液中二羟基神经酰胺产率高，采用HPLC进行定量分析，单位体积发酵液中二羟基神经酰胺产率达8.69mg/L。采用超临界CO₂萃取技术和高速逆流色谱技术二羟基神经酰胺得率达83.7%，纯度达92.5%。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

巴氏醋杆菌Ab3可在28～35℃，pH酸性条件下生长。巴氏醋杆菌Ab3属于醋酸单胞菌属，细胞从椭圆到杆状，单生、成对或成链。在老培养物中易呈多种畸形，如球形、丝状、棒状、弯曲等。醋酸菌有两种类型的鞭毛：一群是周生鞭毛细菌，它们可以把醋酸进一步氧化成二氧化碳和水；另一群是极生鞭毛细菌，它们不能进一步氧化醋酸。两群都是革兰氏阴性杆菌。巴氏醋杆菌Ab3属于醋杆菌属，与巴氏醋杆菌同源性>99%。

实施例2：

从玫瑰香醋中筛选得到的巴氏醋杆菌，通过涂布于营养培养基中进行培养，然后挑出透明圈大的菌落接种于营养培养基进行培养，营养培养基含有6Bx^o麦芽汁，0.04% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、0.05% CaCl₂、乙醇4%、琼脂2%，营养培养基的pH=4.5，培养温度30℃，培养时间3天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水（每18*180mm的试管斜面菌种），用接种棒轻轻将菌苔洗下，制成细胞悬液。采用血球计数板法，调整菌悬浮液中菌体浓度为108个/mL。取新鲜制备的菌悬浮液，离心沉淀后重新悬浮于适量无菌水中，分装3管以300 Gy、500 Gy、700 Gy的辐照剂量进行60Coγ射线辐照。该辐照过程在浙江省农科院核能研究所完成。辐照完成之后将孢子悬浮液进行适当稀释后涂布于营养培养基上，营养培养基的重量百分配比为5～6Bx^o麦芽汁，0.02～0.05% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、 0.05～0.1% CaCl₂、乙醇3～5%、琼脂1.5～2%，所述的营养培养基的pH=4.5～6.5，平板培养温度为28～32 ℃，培养时间2～4天，即分离得到本发明的巴氏醋杆菌Ab3，该巴氏醋杆菌Ab3通过培养可发酵产生二羟基神经酰胺，即为巴氏醋杆菌Ab3。

实施例3：

将巴氏醋杆菌Ab3接种于5Bx^o麦芽汁，0.02% KH₂PO₄、0.01% MgSO₄、 0.05% CaCl₂、乙醇3%、琼脂1.5%，营养培养基的pH=6.5，培养温度28℃，培养时间2天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水（每18*180mm的试管斜面菌种），用接种棒轻轻将菌苔洗下，制成细胞悬液。取10ml接种到90 ml种子培养基中培养1天，该种子培养基含2%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.1%蛋白胨、0.08% KH₂PO₄、0.01% MgSO₄、5%乙醇，水余量，种子培养基的pH=5.0，培养温度30℃，转速120 rpm。再将 20ml种子液接入到装液量为80ml发酵培养基的500ml摇瓶中，温度32℃，转速220 rpm，培养2天，得到巴氏醋杆菌Ab3发酵液，采用离心分离的方法收集菌泥。菌泥经冷冻干燥后，采用溶剂提取神经酰胺，获得二羟基神经酰胺。

采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中二羟基神经酰胺的浓度。单位细胞中二羟基神经酰胺产率为4.45mg/g 干菌体, 巴氏醋杆菌Ab3 产酸（以醋酸计）为3.65g/100mL。

所述的发酵培养基的配比为3%葡萄糖、0.5%复合氨基酸溶液、0.5%酵母膏、0.02% KH₂PO₄、0.01% MgSO₄、0.05% CaCl₂、6%乙醇，水余量，发酵培养基pH=5.0，培养温度32℃，转速150rpm，培养时间2天。

神经酰胺溶剂提取为：细胞菌泥经冷冻干燥后得到干细胞，采用干细胞:提取液按重量比1:1混合，室温下超声浸泡1.5小时，加萃取液进行萃取，过滤后所得有机相真空浓缩，获得二羟基神经酰胺粗品，所述的提取液氯仿:乙醇:水的体积比为1:1:0.8，所述的萃取液氯仿:水的体积比为1:1.25。

实施例4：

将巴氏醋杆菌Ab3接种于6Bx^o麦芽汁， 0.05% KH₂PO₄、0.03% MgSO₄、 0.1% CaCl₂、乙醇5%%、琼脂2%，营养培养基的pH=4.5，培养温度32℃，培养时间4天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水（每18*180mm的试管斜面菌种），用接种棒轻轻将菌苔洗下，制成细胞悬液。取10ml接种到90 ml种子培养基中培养1天，该种子培养基含4%葡萄糖、1%酵母膏、0.3%蛋白胨、0.2% KH₂PO₄、0.03% MgSO₄、7%乙醇，水余量，种子培养基的pH=4.0，培养温度33℃，转速150rpm，培养时间1天。再将 20ml种子液接入到装液量为80ml发酵培养基的500ml摇瓶中，温度35℃，转速150 rpm，培养3天，得到巴氏醋杆菌Ab3发酵液，采用离心分离的方法收集菌菌泥。菌泥经冷冻干燥后，采用溶剂--超临界CO2萃取方法提取神经酰胺，获得二羟基神经酰胺。

采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中二羟基神经酰胺的浓度。单位细胞中二羟基神经酰胺产率为8.17mg/g 干菌体。醋酸菌Ab3 产酸（以醋酸计）为9.65g/100mL。

所述的发酵培养基的配比为5%葡萄糖、1.5%复合氨基酸溶液、1%酵母膏、0.05% KH₂PO₄、0.03% MgSO₄、0.1% CaCl₂、20%乙醇，水余量，发酵培养基pH=4.0，培养温度35℃，转速150rpm，培养时间4天。乙醇的使用量在于间歇式补加。

实施例5：

将巴氏醋杆菌Ab3接种于6Bx^o麦芽汁，0.04% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、0.05% CaCl₂、乙醇4%、琼脂2%，营养培养基的pH=4.5，培养温度30℃，培养时间3天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水（每18*180mm的试管斜面菌种），用接种棒轻轻将菌苔洗下，制成细胞悬液。取10ml接种到90 ml种子培养基中培养1天，该种子培养基含3.5%葡萄糖、0.8%酵母膏、0.25%蛋白胨、0.16% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、6%乙醇，水余量，种子培养基的pH=4.5，培养温度33℃，转速150rpm，培养时间30h。再将 100ml种子液接入到装液量为1500ml发酵培养基的5000ml发酵罐中，温度35℃，空气流速以1.vvm流入，转速380 rpm，补乙醇、营养盐和复合氨基酸，得巴氏醋杆菌Ab3发酵液，采用离心分离的方法收集菌菌泥。菌泥经冷冻干燥后，采用溶剂--超临界CO2萃取方法提取神经酰胺，采用逆流色谱方法进行精制分离，获得二羟基神经酰胺。

采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中二羟基神经酰胺的浓度。单位细胞中二羟基神经酰胺产率为12.78mg/g 干菌体, 二羟基神经酰胺纯度为90.3%。醋酸菌Ab3 产酸（以醋酸计）为11.56g/100mL。

所述的发酵培养基的配比为4.5%葡萄糖、1.2%复合氨基酸溶液、0.8%酵母膏、0.03% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、0.08% CaCl₂、18%乙醇，水余量，发酵培养基pH=4.0，培养温度35℃，空气流速以1.0vvm流入，转速380 rpm，3天。乙醇的使用量在于间歇式补加。

实施例6：

将巴氏醋杆菌Ab3接种于6Bx^o麦芽汁，0.04% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、0.05% CaCl₂、乙醇4%、琼脂2%，营养培养基的pH=4.5，培养温度30℃，培养时间3天。取斜面菌种，加入5ml生理盐水（每18*180mm的试管斜面菌种），用接种棒轻轻将菌苔洗下，制成细胞悬液。取10ml接种到90 ml种子培养基中培养1天，该种子培养基含3.5%葡萄糖、0.8%酵母膏、0.25%蛋白胨、0.16% KH₂PO₄、0.02% MgSO₄、6%乙醇，水余量，种子培养基的pH=4.5，培养温度33℃，转速150rpm，培养时间30h。再将 100ml种子液接入到装液量为1500ml发酵培养基的5000ml发酵罐中，温度35℃，空气流速以1.vvm流入，转速450 rpm，补乙醇、营养盐和复合氨基酸，当酸度达10 g/100mL时维持1天，得到巴氏醋杆菌Ab3发酵液，采用离心分离的方法收集菌菌泥。菌泥经冷冻干燥后，采用溶剂--超临界CO₂萃取方法提取神经酰胺，采用逆流色谱方法进行精制分离，获得二羟基神经酰胺。

采用HPLC进行定量分析，可以得知样品中二羟基神经酰胺的浓度。单位细胞中二羟基神经酰胺产率为21.61mg/g 干菌体。二羟基神经酰胺纯度为92.8%。醋酸菌Ab3 产酸（以醋酸计）为12.83g/100mL。

所述的发酵培养基的配比为4.5%葡萄糖、1.5%复合氨基酸溶液、1%酵母膏、0.05% KH₂PO₄、0.03% MgSO₄、0.1% CaCl₂、20%乙醇，水余量，发酵培养基pH=4.0，培养温度35℃，空气流速以0.8vvm流入，转速450 rpm，4天。复合氨基酸溶液、复合营养盐、乙醇的使用量在于间歇式补加。

Claims

1.巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）Ab3,保藏编号为CCTCC NO：M2013116。

2.如权利要求1所述的巴氏醋杆菌Ab3在发酵生产二羟基神经酰胺中的应用。

3.如权利要求1所述的巴氏醋杆菌Ab3在发酵生产食醋中的应用。

4.一种利用如权利要求1所述的巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

2）对斜面培养得到的菌苔进行种子培养，得到种子液；

5.如权利要求4所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤1）中营养培养基的重量百分配比为5～6Bx^o麦芽汁，0.02～0.05% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、 0.05～0.1% CaCl₂、乙醇3～5%、琼脂1.5～2%，所述的营养培养基的pH=4.5～6.5，斜面培养温度为28～32 ℃，培养时间2～4天。

6.如权利要求4所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤2）中用0.9%生理盐水将斜面上培养的菌苔制成细胞悬液，并接种到100 mL种子培养基中培养，所述的种子培养基的重量百分配比为2～4%葡萄糖、0.5～1%酵母膏、0.1～0.3%蛋白胨、0.08～0.2% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、5～7%乙醇，水余量，所述的种子培养基的pH=4.0～5.0，培养温度30～33 ℃，转速120rpm，培养时间1～2天。

7.如权利要求4所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤3）中发酵培养基的重量百分配比为3～5%葡萄糖、0.5～1.5%复合氨基酸溶液、0.5～1%酵母膏、0.02～0.05% KH₂PO₄、0.01～0.03% MgSO₄、0.05～0.1% CaCl₂、6～20%乙醇，水余量，所述的发酵培养基pH=4.0～5.0，培养温度32～35℃，转速150～450rpm，培养时间2～4天，其中乙醇的使用量在于间歇式补加。

8.如权利要求4所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤3）中细胞菌泥经冷冻干燥后得到干细胞，采用干细胞:提取液按重量比1:1混合，室温下超声浸泡1.5小时，加萃取液进行萃取，过滤后所得有机相真空浓缩，获得二羟基神经酰胺粗品，所述的提取液中氯仿:乙醇:水的体积比为1:1:0.8，所述的萃取液中氯仿:水的体积比为1:1.25。

9.如权利要求8所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的干细胞采用超临界CO₂萃取，所得CO₂/乙醇流动相动挥发后，获得获得二羟基神经酰胺粗品。

10.如权利要求8或9所述的一种利用巴氏醋杆菌Ab3发酵生产二羟基神经酰胺的方法，其特征在于所述的二羟基神经酰胺粗品采用高速逆流色谱分离精制，获得二羟基神经酰胺精品。