CN103304396A - 一种从1403c的发酵液中分离纯化1403c的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法。包括：1)在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液；2)将步骤1)所得的抽提液浓缩后用非极性吸附剂吸附，经吸附过的液体用高效液相色谱检测，收集1403C峰纯度90％以上的部分，得到纯化液；3)将步骤2)所得的纯化液浓缩后在-20℃到25℃的环境中析晶，取晶体即得1403C。本发明最终得到高纯度的1403C，重量纯度可达95％以上。本发明方法操作简单易控、工艺稳定性强。生产过程的污染小、安全性高，利于工业化。

Description

一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法

技术领域

本发明属于分离纯化领域，特别涉及一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法。

背景技术

从特殊生物资源中发现先导化合物是目前国际药物研究的重要方向。海洋是人类可持续发展的重要战略空间与资源库。海洋微生物由于环境的特殊性以及在海洋生态***中的功能，发展出了一些独特代谢的方式，从而可以产生极其丰富的、结构多样与新颖的代谢产物，为创新药物的研究与开发提供了大量的新型药物先导化合物模式结构。

随着近年来海洋微生物培养技术和分子生物学技术的发展，从海洋中分离到了大量新的微生物，并且从中分离出了许多具有生物活性的的次级代谢产物。其中，由E.B.G.Jones与L.L.P.Vrijmoed等人在中国南海红树林树叶内分离得到的内生真菌Halorosellinia sp.1403，经过培养后，可以从其发酵液中分离出多种活性产物，包括灰黄霉素和多种蒽醌、萘醌和咕吨酮类等物质，这些化合物大多具有抗肿瘤、抗菌活性(肖娜娜.固体发酵两株南海红树林内生真菌的次级代谢产物研究.中山大学硕士学位论文.2010)。

1403C是从Halorosellinia sp.1403的培养液中分离出的结构新颖的蒽醌类化合物(姜广策，林永成等.中国南海红树林内生真菌No.1403次级代谢物的研究.中山大学学报，2000，39(6)：68-72)。经过中山大学对其进行的活性测试，确定其具有较好的抗肿瘤活性(佘志刚，林永成等.一类醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用.ZL200610035637.X)。因此该化合物具有良好的应用前景。

目前已报道的1403C的制备方法为生物发酵法，包括发酵培养与分离纯化两个制备环节。1403C的发酵培养方法已有较多报道，包括培养基的配方、培养条件、接种方法、补料方法等。

1403C的分离纯化方法目前采用的是萃取--硅胶/聚酰胺层析--重结晶的方法，如专利ZL200610035637.X报道，将发酵液固液分离后除去菌体，加热浓缩至原体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯反复萃取、浓缩，在硅胶柱中进行层析分离，用石油醚/乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，收集50％--100％乙酸乙酯/石油醚部分，浓缩后再经聚酰胺柱层析，70％乙酸乙酯/石油醚洗脱，重结晶纯化，得到红色1403C晶体。

采用已知的方法进行1403C分离纯化，步骤繁琐、操作困难，工艺不稳定；所用的有机溶剂挥发性和毒性均较强、用量较大，生产过程的污染大、安全性差，不利于工业化的生产操作。

发明内容

本发明提供一种从发酵液中分离纯化高纯度1403C的方法，该方法操作更简单易控、工艺稳定性强；生产过程的污染小、安全性高，更加利于工业化的生产操作。

本发明采用的技术方案如下：一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法，包括以下步骤：

1)在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液；

2)将步骤1)所得的抽提液浓缩后用非极性吸附剂吸附，经吸附过的液体用高效液相色谱检测，收集1403C峰纯度90％以上的部分，得到纯化液；

3)将步骤2)所得的纯化液浓缩后在-20℃到25℃的环境中析晶，取晶体即得1403C。

本发明中，步骤1)为：在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液。

本发明所述的1403C的发酵液可以是任何能够产生1403C的菌体的发酵液，只要该菌体能够产生1403C即可。如可以由红树林内生真菌Halorosellinia sp.1403经培养后获得，该发酵液的制备方法已公开在专利201010179396.2、200910199117.6、以及文献“中国南海红树内生真菌No.1403次级代谢物的研究”、“七种南海海洋真菌和放线菌代谢产物的研究”中。Halorosellinia sp.1403的菌种在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)有保藏，保藏号：M201018。

本发明所述的极性有机溶剂是已知的任何极性有机溶剂。包括醇类、酮类、醛类等。较佳的为醇类，优选低级醇。本发明所述的低级醇是指C1-C4醇，可以为甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇。所述的极性有机溶剂和水的混合物是指本发明所述的极性有机溶剂在混合物中的体积百分比在0％-100％(不包括端点值)范围内的混合物。较佳的是极性有机溶剂在混合物中的体积百分比是30％-98％，更佳的是50％-95％，最佳的如75％。所述的极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物的添加量是使有机溶剂占整个混合液中的的体积含量为30％-90％，更佳的是50％-90％，最佳的如75％。

步骤1)的目的是用上述有机溶剂将菌体产生的1403C全部溶解于液相中。在研究过程中，我们发现，1403C在极性有机溶剂及其与水的混合溶剂中溶解度较高，而在水中的溶解度很小。菌体产生的1403C大部分积累在菌体内部或以固体形式粘连在菌丝体上，而不能全部溶解于水相中。因此，向发酵液中加入极性有机溶剂可以提高液相对1403C的溶解度，使菌体积累的1403C释放到液相中。调节pH至酸性会使菌体破裂释放1403C。因此，本发明将发酵液中的1403C抽提进入有机相或者有机相和水的混合液中，所采用的抽提的方法包括搅拌、分离各个抽提相等步骤。较佳的是发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物后，调节混合液pH至1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，更佳的如调节混合液pH至2.5，70℃恒温搅拌1小时。

步骤1)还包括将加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物搅拌后的发酵液固液分离，固液分离后液相含有1403C。本发明中采用的固液分离方法为本领域常规的固液分离方法，如离心、抽滤、微滤等。

本发明中，步骤2)为：将步骤1)所得的抽提液浓缩后用非极性吸附剂吸附，经吸附过的液体用高效液相色谱检测，收集1403C峰纯度90％以上的流出液，得到纯化液。

其中，先将步骤1)所得的抽提液浓缩。所采用的浓缩方法是本领域常规方法，如常压蒸发浓缩，减压真空浓缩等。抽提液经浓缩后，不仅可以提高1403C的浓度，还可以调整有机溶剂的含量，从而影响1403C与杂质的在非极性吸附剂中吸附状态。浓缩后有机溶剂的体积含量在15％～85％时，收率较高，优选30％。

步骤2)的目的是用非极性吸附剂吸附去除抽提液中的一部分杂质。非极性吸附剂可以从极性溶剂中吸附非极性的物质，极性越弱，吸附越强。在研究过程中我们发现，抽提液中的杂质大部分极性较1403C更弱，更容易被非极性吸附剂吸附。因此本发明采用非极性吸附剂将抽提液中极性较弱或部分极性较强但含量较低的杂质吸附除去，达到纯化的目的。所述的非极性吸附剂可以是芳香族大孔吸附树脂如Amberlite XAD-1600、Amberchrom CG-161等，或含卤素的芳香族大孔吸附树脂如SP-207等，也可以为活性炭或碳化树脂。优选芳香族大孔吸附树脂与含卤素的芳香族大孔吸附树脂，更优选芳香族大孔吸附树脂Amberchrom CG161。本发明较佳的采用穿流吸附的方法进行吸附除杂。更优选过非极性吸附剂流化床。

步骤2)中的所述的“峰纯度”指的是1403C溶液的高效液相色谱图中，1403C组分的峰面积通过归一化法得到的百分含量。本发明优选收集1403C的高效液相峰纯度大于90％，更优选大于95％的流出液。

本发明一较佳的1403C的HPLC分析方法如下：

色谱柱：反相C₁₈色谱柱，260mm×4.6mm

流速：1mL/min

进样量：15μL

柱温：26℃

检测波长：280nm

A溶液：1％乙酸∶水溶液(V∶V)

B溶液：甲醇

洗脱方法：

本发明中，步骤3)为：将步骤2)所得的纯化液浓缩后在-20℃到25℃的环境中析晶，取晶体即得1403C。

步骤3)的目的是使1403C从纯化液中结晶析出，同时将纯化液中一部分极性较强的杂质留在母液中，达到精制的效果。纯化液通过浓缩，可以提高浓度，并且可以调整有机溶剂的含量。浓缩后的纯化液中有机溶剂的体积含量在25％～100％时，收率较高，优选75％。为了进一步提高纯度与收率，还可以将纯化液浓缩至干，然后再于50℃-75℃，优选70℃下，用25％～100％的极性有机溶剂的水混合溶液完全溶解1403C，并过滤除去不溶的杂质，得到清液再进行析晶。所述的极性溶剂选自醇类、酮类和醛类，较佳的为醇类，优选低级醇，所述的低级醇优选甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇。

步骤3)中析晶在-20℃到25℃的环境中进行，优选放置4-8小时，即得到1403C晶体。为提高收率，可以将纯化液置于等于或低于4℃的环境中，但要保证环境温度在结晶液的冰点以上，以免溶剂凝固。

步骤3)中析出的晶体可以如常规的经过洗涤和干燥等步骤。晶体洗涤的目的在于除去滤饼上的残留母液。洗涤方法为用一种与母液(母液是指的结晶后晶浆去除晶体后所余留的溶液)互溶但对1403C溶解性较差的溶剂洗涤晶体2～3次，并抽滤。所用的洗涤溶剂优选极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，更优选如甲醇、乙醇、异丙醇及其与水的混合液等。干燥的方法是常规的晶体干燥方法，如减压真空干燥，较佳的如20-40℃，-0.08～-0.1MPa气压，2-4小时或干燥至恒重。步骤3)析出的红色片状晶体，经洗涤、干燥后，得到重量纯度大于95％的1403C。

本发明中所述的浓缩方法为本领域常规方法，如常压蒸发浓缩，减压真空浓缩等。

浓缩后有机溶剂的体积百分含量，可以通过控制溶剂蒸发量调节；或者浓缩后加入水/有机溶剂调节；或者浓缩至干，在加热条件下用一定体积含量的混合溶剂重新将1403C全部溶解来调节。

此外，本发明中产生的含有1403C的废液，如非极性吸附剂吸附结束后的解吸液、结晶后的母液等，可以回收套用至其他批次中，以进一步提高收率。

本发明的一较佳实例为，一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法，包括以下步骤：

1)发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节混合液pH至1-4，50℃-75℃下搅拌0.5-2小时，然后固液分离得到抽提液；

2)将抽提液浓缩至有机溶剂的体积含量为15％～80％，浓缩液过非极性吸附剂流化床，收集1403C的高效液相峰纯度大于90％的流出液，得到纯化液；

3)将纯化液浓缩至干，于50℃-75℃下用25％～100％的极性有机溶剂和水的混合溶液完全溶解1403C，过滤取清液置于-20℃到25℃的环境中，放置4-8小时，使1403C结晶析出；

4)析出的晶体用极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物洗涤，20-40℃，-0.08～-0.1MPa下，真空干燥2-4小时。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：本发明最终得到高纯度的1403C，重量纯度可达95％以上。本发明方法较目前报道的方法，操作更简单易控、工艺稳定性强；采用的极性有机溶剂如乙醇、异丙醇等，较之原有方法的有机溶剂，挥发性低、毒性小，生产过程的污染小、安全性高，更加利于工业化的生产操作。本发明制备的1403C具有抗肿瘤作用，可以应用于抗肿瘤药物的制备，其抗肿瘤活性已公开与专利CN 200610035637.X中。

具体实施方式

本发明提供一种从发酵液中分离纯化高纯度1403C的方法，该方法的特点在于利用非极性吸附剂对杂质的吸附除去发酵抽提液中的极性较弱杂质，再通过结晶的方法除去其它的杂质，最终得到高纯度的1403C。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的室温一般是指25℃。

在本实施方式中，发酵液的获得按如下方式进行。

菌种：Halorosellinia sp.1403，CCTCC NO：M201018。

斜面培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH 7；人工海水(ASW)1000mL；琼脂15～20g。

种子培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH 7；人工海水(ASW)1000mL。

发酵培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH 7；人工海水(ASW)200mL；去离子水800mL。

培养方法：

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经121℃(0.1MPa)高温灭菌25分钟的种子培养基，培养3天后接入同样经过高温灭菌的发酵培养基，接种量5％(相对于培养基的体积百分比)，培养温度28℃，培养时间96小时，并于发酵24小时向发酵液中添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的混合液，使其在发酵液中的终浓度为6mM。

实施例1

发酵结束后收集发酵液共1.2L，1403C浓度为1.1g/L(1403C浓度测定方法为：取10ml发酵液，加入30ml乙酸，70℃下搅拌1小时，离心，上清液用高效液相检测)，加入乙醇3.0L，用盐酸调节混合液pH至1.0，75℃恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液4.0L。用旋转蒸发仪浓缩抽提液后配制成2.8L乙醇体积含量85％的溶液，过滤后清液过50mL碳化树脂的树脂床，流出液用HPLC检测，检测方法如发明内容中所述，收集1403C峰纯度90％以上的流出液共0.7L。流出液用旋转蒸发仪浓缩至150mL(乙醇体积含量为25％)后，置于室温下5小时，抽滤晶浆，晶体用20mL去离子水洗涤2次，抽滤后晶体于30℃下真空干燥4小时，得到重量纯度96.2％的1403C晶体0.26g，收率19％。

实施例2

收集发酵液共1.4L，1403C的浓度为0.9g/L，离心得到菌体80g，加入75％的乙醇水溶液1.0L，调节pH至2.6，70℃下搅拌1小时，抽滤混合液，菌渣重复上述操作一次，两次抽提液合并共1.74L。减压浓缩至1.1L，加入适量水后过滤，配成2L乙醇体积含量30％的溶液。此溶液经过80mLAmberchrom CG161树脂床，流出液用HPLC检测，收集1403C峰纯度95％以上的流出液共1.4L。将此溶液减压浓缩至干后，加入250mL，75％的乙醇水溶液，70℃下搅拌溶解后，热过滤得到澄清的溶液，缓慢搅拌下，置于4℃条件下8小时，抽滤晶浆，晶体用50mL，30％乙醇水溶液洗涤2次，抽滤后晶体于30℃下真空干燥4小时，得到重量纯度99.7％的1403C晶体0.58g，收率46％。

实施例3

发酵结束后收集发酵液共1.2L，1403C浓度为1.0g/L，加入乙醇3.0L，混合液中乙醇体积含量为75％，用盐酸调节混合液pH至2.5，70℃恒温搅拌2小时，抽滤后得到澄清的抽提液4.0L。减压浓缩抽提液后配制成3.0L乙醇体积含量30％的溶液，过滤后清液经过80mL Amberchrom CG161的树脂床，流出液用HPLC检测，收集1403C峰纯度95％以上的流出液共2.5L。减压浓缩至干，70℃下用75％乙醇水溶液320mL使1403C完全溶解，过滤不溶物，清液置于室温下缓慢搅拌5小时，再置于4℃环境下3小时，抽滤晶浆，晶体用50mL，20％乙醇水溶液洗涤2次，抽滤后晶体真空干燥，得到重量纯度99.4％的1403C晶体0.65g，收率54％。

实施例4

发酵结束后收集发酵液共1.2L，1403C浓度为0.9g/L，加入乙醇3.0L，用盐酸调节混合液pH至4.0，50℃恒温搅拌2小时，抽滤后得到澄清的抽提液4.0L。减压浓缩抽提液后配制成3.0L乙醇体积含量30％的溶液，过滤后清液经过80mL SP-207的树脂床，流出液用HPLC检测，收集1403C峰纯度90％以上的流出液共1.7L。流出液减压浓缩并调节乙醇体积含量65％，定容至250mL，置于-20℃下静置4小时，抽滤晶浆，晶体用20mL，30％乙醇水溶液洗涤2次，抽滤后晶体真空干燥，得到重量纯度96.7％的1403C晶体0.31g，收率28％。

实施例5

发酵结束后收集发酵液共1.0L，1403C浓度为1.0g/L，加入乙醇2.5L，用盐酸调节混合液pH至2.5，70℃恒温搅拌1小时，抽滤后得到澄清的抽提液3.3L。减压浓缩抽提液后配制成3.0L乙醇体积含量30％的溶液，过滤后清液过80mL Amberlite XAD-1600的树脂床，流出液用HPLC检测，收集1403C峰纯度90％以上的流出液共1.2L。流出液常压蒸发浓缩至150mL，置于室温下静置5小时，抽滤晶浆，晶体用20mL，30％乙醇水溶液洗涤2次，抽滤后晶体真空干燥，得到重量纯度95.8％的1403C晶体0.22g，收率21％。

实施例6

发酵结束后收集发酵液共1.2L，1403C浓度为1.1g/L，加入甲醇3.0L，用盐酸调节混合液pH至2.5，70℃恒温搅拌1小时，抽滤后得到澄清的抽提液4.0L。减压浓缩抽提液后配制成3.0L甲醇体积含量30％的溶液，过滤后清液过80mL Amberchrom CG161的树脂床，流出液用HPLC检测，收集1403C峰纯度90％以上的流出液共2.2L。流出液减压浓缩至200mL，过滤不溶物，清液置于室温下缓慢搅拌5小时，抽滤晶浆，晶体用50mL，20％甲醇水溶液洗涤2次，抽滤后晶体于30℃下真空干燥4小时，得到重量纯度97.7％的1403C晶体0.58g，收率43％。

实施例7

其他操作同实施例6，仅使用的与水互溶的低级醇为异丙醇，得到重量纯度97.2％的1403C晶体0.48g，收率35％。

实施例11

其他操作同实施例3，仅抽提液浓缩后调节乙醇体积含量为15％，得到重量纯度99.2％的1403C晶体0.29g，收率24％。

实施例12

其他操作同实施例3，仅抽提液浓缩后调节乙醇体积含量为80％，得到重量纯度98.9％的1403C晶体0.42g，收率35％。

实施例13

其他操作同实施例3，仅纯化液减压浓缩后用25％乙醇水溶液于75℃下搅拌溶解，得到重量纯度99.2％的1403C晶体0.36g，收率30％。

实施例14

其他操作同实施例3，仅纯化液减压浓缩后用无水乙醇于50℃下搅拌溶解，得到重量纯度99.4％的1403C晶体0.51g，收率42％。

实施例15

其他操作同实施例3，仅结晶清液置于室温下缓慢搅拌5小时后，再置于0℃环境下3小时，得到重量纯度99.4％的1403C晶体0.66g，收率54％。

实施例16

其他操作同实施例3，仅向发酵液加入70％的乙醇水溶液3.0L，混合液中乙醇体积含量为50％。得到重量纯度99.0％的1403C晶体0.41g，收率43％。

实施例17

其他操作同实施例3，仅向发酵液加入乙醇11.0L，混合液中乙醇体积含量为90％。得到重量纯度99.4％的1403C晶体0.64g，收率53％。

实施例18

其他操作同实施例3，仅向发酵液加入45％的乙醇水溶液3.0L，混合液中乙醇体积含量为30％。得到重量纯度98.6％的1403C晶体0.41g，收率34％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液；

2)将步骤1)所得的抽提液浓缩后用非极性吸附剂吸附，经吸附过的液体用高效液相色谱检测，收集1403C峰纯度90％以上的部分，得到纯化液；

3)将步骤2)所得的纯化液浓缩后在-20℃到25℃的环境中析晶，取晶体即得1403C。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的极性有机溶剂选自甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物的添加量是使有机溶剂占整个混合液中的体积百分比的30％-90％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的非极性吸附剂选自芳香族大孔吸附树脂、含卤素的芳香族大孔吸附树脂、活性炭和碳化树脂中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的抽提液浓缩后其中有机溶剂的体积含量为15％～85％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的纯化液浓缩后其中有机溶剂的体积含量为25％～100％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的纯化液浓缩至干，然后于50℃-75℃，用25％～100％的极性有机溶剂的水混合溶液完全溶解1403C，并过滤取清液进行所述析晶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的析晶是将浓缩液在-20℃到25℃的环境中，放置4-8小时。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括将步骤3)中析出的晶体洗涤、干燥。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备的1403C在制备抗肿瘤药物中的用途。