CN103298838B - pH敏感的透明质酸衍生物和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种pH敏感的透明质酸衍生物，包括至少一个如下式(I)所示之重复单元，其中HA表示包括N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之单元，q表示2至10000之整数；A表示生物可断裂键，包括腙、缩醛、缩酮或亚胺之至少一种基团；M表示疏水片段、亲水片段或两亲性片段之至少一种，以及p表示该[A-M]直接接枝于每一该HA单元之数量，且p为0至4之整数，且每一该HA单元之p不得同时为0。

Description

pH敏感的透明质酸衍生物和其应用
技术领域
本发明涉及一种透明质酸衍生物及其应用，特别是关于具有pH敏感性的透明质酸衍生物。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid)为由乙酰基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)与D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)所形成的重复单元所组成的线性黏多糖（linear mucopolysaccharide）。透明质酸最早在牛眼球的玻璃体中被发现，之后在其它组织，例如细胞间质（ECM）、关节滑液等中发现。生物体中的透明质酸主要功能在于保护及润滑细胞、调节细胞在此黏弹性基质上的移动、稳定胶原网状结构及保护该胶原网状结构免于机械性破坏。
透明质酸的细胞表面受体主要为CD44。透过透明质酸与CD44的接合，可促使细胞聚集、移动、增殖及活化以及细胞与细胞间的黏合等的细胞活动。在肿瘤转移的机制上，透明质酸与CD44的接合促进肿瘤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition;EMT)，使得肿瘤细胞浸润血液***或淋巴***。最后，使得肿瘤细胞与原始细胞连接及作用而达到肿瘤细胞的转移。
透明质酸已知在水溶性介质中当浓度高于临界微胞浓度(critical micelle concentration,CMC)时，遵照热力学原则自我聚集(self-assembly)而形成纳米尺寸的微胞。目前已有多篇先前文献记载透明质酸形成微胞及包覆活性药物的技术，例如美国专利USP6,350,458B1、美国专利USP7,780,982B1等。
美国专利USP6,350,458B1揭示由至少一种微胞形成材料、荷尔蒙或抗体等的大分子药剂、碱金属磺酸烷酯、水杨酸碱金属盐、及医药可接受的依地酸(edetate)所形成的医药组合物，藉由此医药组合物将不易通过肠胃道(GI)的大分子药剂递送至组织或细胞中。
美国专利USP7,780,982B1揭示一种透明质酸衍生物，于透明质酸之羟基(-OH)位置以氨基甲酸酯基(urethane)连接碳数2～16的烃基，以提高该透明 质酸衍生物及其所形成可包覆药物的微胞的生物可分解性。
然而，已知包覆活性药物的微胞在透过胞吞作用(endocytosis)进入肿瘤细胞后，通常在尚未释放出活性药物以毒杀肿瘤细胞之前，该微胞已被肿瘤细胞经胞吐作用(exocytosis)排出。因此对于透明质酸及其所形成的微胞仍有改良的需求。
发明内容
本案提供一种透明质酸衍生物，其包括至少一种下式(I)所示之重复单元，
式中，HA表示包括N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之单元，q表示2至10000之整数；A表示一生物可断裂键，包括腙(hydrazone)、缩醛(acetal)、缩酮(ketal)或亚胺(imine)之至少一种基团；M表示一疏水片段、亲水片段或两亲性片段之至少一种；以及p表示该[A-M]直接接枝于每一该HA单元之数量，且p为0至4之整数，且每一该HA单元之p不得同时为0；其中，该透明质酸衍生物具有生物可分解性及在酸性环境中裂解的pH敏感性。
本案更提供一种微胞，由上述之透明质酸衍生物于一亲水介质中形成。
本案再提供一种药物递送***，包括一载体包覆一生物活性成分，其中该载体为上述之透明质酸衍生物所构成。
再者，本案更提供一种风味增强剂，由上述之透明质酸衍生物所构成，用以包覆一生物活性物质以减少该生物活性物质的味道。
附图说明
【图式简单说明】
第1图显示本案一实施例之HA-g-HZPCL的化学结构式，HA表示透明质酸之单元，g表示接枝状态，HZ表示腙连接，PCL表示聚己内酯链段。
第2图显示本案一实施例之HA-g-(HZPCL-PEG)的化学结构式，HA表示透明质酸之单元，g表示接枝状态，HZ表示腙连接，PCL表示聚己内酯链段；PEG表示乙二醇链段。
第3图显示HA-COONa及HA-TBA之1H-NMR光谱图。
第4图显示HATBA-CHO之1H-NMR光谱图。
第5图显示PCL-酰肼的FT-IR光谱图。
第6图显示本案一实施例之HA-g-(HZ-PCL)的化学结构式及其1H-NMR光谱图，HA表示透明质酸之单元，g表示接枝状态，HZ表示腙连接，PCL表示聚己内酯链段。
第7图为本案一实施例之HA-g-(HZPCL-PEG)的化学结构式及其 1H-NMR结构鉴定光谱图，HA表示透明质酸之单元，g表示接枝状态，HZ表示腙连接，PCL表示聚己内酯链段；PEG表示乙二醇链段。
第8图显示本案实施例之微胞配方的药物释放行为。
第9图显示本案实施例之微胞配方的药物释放行为。
具体实施方式
本案一实施例为改良应用于药物释放控制的pH敏感材料，选用生物兼容性优异的透明质酸作为主体，以生物可断裂键(biocleavable linkage)连接疏水片段、亲水片段、两亲性片段或其组合，形成具有如式(I)所示之重复单元的透明质酸衍生物。
如下式(I)所示之单元中，
HA表示包括N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之透明质酸单元。q表示上述透明质酸单元的数目，可为2至10000之整数，优选为10～5000之整数，但不限于此。A表示生物可断裂键，与该N-乙酰基-D-葡醣胺及该D-葡醣醛酸之至少一个的羟基(-OH)形成共价连接。M表示疏水片段、亲水片段或两亲性片段之至少一种。p为表示上述[A-M]直接接枝于HA上的数目。由于该生物可断裂键系连接于N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸的羟基(-OH)上。已知透明质酸中的N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸具有4个羟基，因此，p表示0至4之整数，且每一该HA单元之p不得同时为0。然而，本案不特别限定上述生物可断裂键的羟基连接位置。但为了使本案技术内容容易了解，以下说明皆以一个生物可断裂键(p=1)为例。
此述的“生物可断裂键”表示在酸性的环境下可断键的基团，其与该N-乙酰基-D-葡醣胺及该D-葡醣醛酸之至少一个的羟基(-OH)形成共价连接。具体地包括腙(hydrazone)、缩醛(acetal)、缩酮(ketal)或亚胺(imine)之至少一种基团。此述的“酸性环境”系指pH值7以下的环境，优选为pH6.9～pH1.0的范围，更优选为pH6.5～pH3.0的范围，例如，生物体细胞之胞器内环境或肿瘤组织部位。
此述的M表示疏水片段、亲水片段或两亲性片段之至少一种。M的分子量没有特别限制，可为100至50,000道尔顿(Dalton;Da)，优选为300至30,000Da，更优选为500至20,000Da。
此述“疏水片段”表示由生物可吸收的高分子为重复单元所形成的链段。该生物可吸收的高分子之重复单元可包括己内酯(caprolactone)、丁内酯(butyrolactone)、D-丙交酯(D-lactide)、L-丙交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、乙醇酸(glycolic acid)、羟基已酸(hydroxy hexonoic acid)、羟基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊内酯(valerolactone)、羟基戊酸(hydroxy valeric acid)、苹果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之组合。该生物可吸收的高分子也可具有一个以上于酸性环境中可断键的连接，例如腙、缩醛、缩酮或亚胺之至少一种基团。
此述“亲水片段”表示亲水性的分子链段，没有特别限定，可选自聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚环氧乙烷(polyethylene oxide,PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMA)或上述之组合。
此述“两亲性片段”表示具有亲水区域与疏水区域的两性链段。上述亲水区域的重复单元可列举乙二醇(ethylene glycol)、环氧乙烷(ethylene oxide)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidone)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、上述之共聚物、或上述之组合。上述疏水区域的重复单元可列举己内酯(caprolactone)、丁内酯(butyrolactone)、D-丙交酯(D-lactide)、L-丙交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、乙醇酸(glycolic acid)、羟基已酸(hydroxy hexonoic acid)、羟基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊内酯(valerolactone)、羟基戊酸(hydroxy valeric acid)、苹果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之组合。此述“两亲性片段”可更具有一个以上于酸性环境中可断键的连接，例如腙、缩醛、缩酮或亚胺之至少一种 基团。
本案另一实施例中，除上述的A及M的连接之外，上述的HA也可更透过一非生物可断裂键或一不易快速断键以连接一亲水片段。此述的“非生物可断裂键”是指在酸性环境中无法酸解断键的连接，包括氨基甲酸酯(urethane)键。此述之“不易快速断键”是指在酸性环境中无法在24小时内快速断键的连接，包括酯(ester)键。此述之非生物可断裂键或不易快速断键所连接的“亲水片段”，可列举聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚环氧乙烷(polyethylene oxide,PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMA)、或上述之组合。此述之非生物可断裂键或不易快速断键亦可接枝于HA的羟基位置，透过此述之非生物可断裂键或不易快速断键来连接一亲水片段，可提高本案所述的透明质酸衍生物在水溶性介质中的溶解性，以及降低本案所述的透明质酸衍生物所形成之微胞于生物体血液循环***中被生物体免疫***辨识的机会，提高该微胞在血液中的循环时间。
在一实施例中，本案所述之透明质衍生物还可以一隔离链段连接一具有生物辨识功能的蛋白质分子。此述“隔离链段”表示与上述A生物可断裂键或非生物可断裂键在HA的连接位置不同之链段，其可为碳链或碳氧链，例如碳数1至1000的碳链或碳氧链。此述隔离链段的分子量可为100至50,000Da，优选为300至30,000Da，更优选为500至20,000Da。此述“生物辨识功能的蛋白质分子”可为抗体或配体(ligand)，没有特别限制，但优选为可辨识特定肿瘤细胞之抗体或配体。
本案所述之透明质酸衍生物，由于羟基位置施以疏水片段或两亲性片段改质，当在亲水介质中的浓度大于临界微胞浓度后，可自我聚合形成纳米尺度的微胞结构。此述的“亲水介质”系指具有亲水性的溶剂，可例如水、生理食盐水、血液、血浆、乙醇等，但不限于此。此述的“临界微胞浓度”系指上述透明质衍生物在亲水介质中形成微胞结构的浓度，优选为10至0.0001重量%之范围。
在一实施例中，本案所述之透明质酸衍生物可与具生物活性的物质混合、震荡，形成包覆上述生物活性物质之微胞。此述之具有生物活性的物质可为具有疗效的药剂、维生素等的活性成分，特别是癌症治疗的化疗药剂，例如若丹明(rhodamine)、阿霉素(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)等。在本案 所述之包覆生物活性物质的微胞中，该生物活性物质与形成微胞的透明质酸衍生物的重量比优选可为1：1至1：20。
本案所述之“pH敏感”系指在酸性环境中发生酸解的现象。本案之透明质酸衍生物因具有该生物可断裂键，于酸性环境中酸解断键，因此呈现pH敏感的特性。
另一方面，本案所形成的包覆生物活性物质的微胞在进入动物体血液中循环时，该微胞可因促进性渗透与滞留效应（Enhanced Permeation and Retention effect,EPR effect）而渗透并累积在细胞或组织间隙较大之部位，特别是肿瘤组织。由于肿瘤组织周围多呈现偏酸性，上述透明质酸衍生物所连接的生物可断裂键因快速酸解而断键，促使所携带的生物活性物质快速释出，达到毒杀肿瘤细胞的效果。再一方面，本案所述之包覆生物活性物质的微胞也可透过胞吞作用(endocytosis)进入动物体细胞中。当细胞内呈现酸性环境时，本案所述之透明质酸衍生物所连接的生物可断裂键因快速酸解而断键，促使所携带的生物活性物质快速释出。快速的酸解及释放活性物质，除可达到预期的治疗效果外，也可避免已知微胞经胞吐作用(exocytosis)被排出细胞外的问题。再者，当本案所述之透明质酸衍生物连接具有生物辨识功能的蛋白质分子的情形时，可透过该蛋白质分子专一性辨识特定细胞，将包覆生物活性物质的微胞专一性的递送至特定细胞，特别是肿瘤细胞。
本案还提供以上述透明质酸衍生物形成微胞，包覆有强烈气味或味觉臭味的药物或生物活性物质以降低气味的风味增强剂用途。作为风味增强剂的用途时，包覆的药物或生物活性物质没有特别限定。特别是在经口服或肠胃道投药时，肠胃道的酸性环境可促使本案所述之微胞形成快速酸解断键，进而释放出所包覆的药物或生物活性物质。因此，本案所述之风味增强剂也可适用于经口或肠胃道投药的营养品。
以下说明制备本案之透明质酸衍生物之一优选实施态样。
首先使用离子吸附方式将水溶性多醣类的透明质酸与四丁基氢氧化铵（tetrabutylammonium hydroxide；TBAOH）结合成有机溶剂可溶解之透明质酸-四丁基氢氧化铵(HA-TBA)(如下示流程图1)。
流程图1
之后，将于透明质酸之羟基位置进行pH敏感之基团改质。选用对一级或二级醇类具有选择性氧化成醛类之氧化试剂-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物（2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl,TEMPO），并辅以二乙酸碘苯（Iodobenzene diacetate,BAIB）进行HA-TBA之羟基位置氧化反应获得中间产物HA-TBA-CHO(如下式)。
然后，制备一末端含有酰肼(hydrazide)之疏水链段以与HA-TBA-CHO之醛基反应进而形成具有pH敏感性质之腙基(hydrazone)。首先于高温下利用锡触媒(辛酸锡)（stannous octoate）作为催化剂，正十二醇(1-dodecanol)作为起始剂与ε-己内酯（ε-caprolactone）进行开环聚合反应得聚己内酯（poly(ε-caprolactone)；PCL)疏水性聚合物。继之进行两步骤的末端官能基改质反应。第一步骤以三乙基胺（triethylamine）将PCL-OH去质子化，接着以4-二甲胺基吡啶（4-dimethylaminopyridine）作为催化剂和丁二酸酐（succinic anhydride）进行加成开环反应，获得末端改质为羧酸官能基之羧酸聚己内酯(PCL-COOH)。第二步骤以N-甲基吗琳（N-methylmorpholine；NMM）将PCL-COOH去质子化，再和氯甲酸异丁酯（isobutylchloroformate；IBCF）行加成-脱去（addition-elimination）反应，生成反应性较高的中间产物PCL-酸酐。该中间产物PCL-酸酐再和1M四氢呋喃肼(hydrazine tetrahydrofuran)溶液反应，得到末端改质为酰肼官能基之疏水性PCL-肼前体物(如下式)。
本案另一实施例中，在上述末端改质为酰肼官能基之前体物可于PCL连接一亲水片段，例如乙二醇(PEG)，形成两亲性片段(如下式)。
最后，将前述PCL-肼或PEG-PCL-肼前体物与前述HATBA-CHO前体物混合，并控制目标接枝率之化学计量，使PCL-肼或者PEG-PCL-肼形成腙连接(hydrazone linkage)，获得具有pH敏感生物可分解性透明质酸衍生物HA-g(Hz-PCL)共聚物或HA-g(Hz-PCL-PEG)共聚物，如下所示。
本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步公开本发明之技术内容，不应藉以限制本案的发明范畴。
【实施例1】
透明质酸-四级铵盐(HA-TBA)的制备
首先取500mL体积的氢离子交换树脂（ROHM HAAS，食品等级）倒入层析管柱中，以二次水清洗氢离子交换树脂。接下来取透明质酸钠(HA-COONa)粉末6g(分子量Mw=16,000）加入600mL二次水配制成1%水溶液，倒入已清洗完毕的氢离子交换树酯的层析管柱中进行钠离子与氢离子的置换，得到HA-COONa置换成HA-COOH的中间产物。继之将上述所得之HA-COOH水溶液中间产物加入等摩尔体积量之40%四丁基氢氧化铵9.8mL(Fluka）。于室温下搅拌反应16小时后，冷冻干燥后可得白色片状之HA-TBA固体9.2g(产率99%）。HA-TBA的NMR结构鉴定光谱如第3图所示。
【实施例2】
透明质酸四级铵盐-醛(HATBA-CHO)制备
准备一250mL双颈瓶并称取实施例1的HATBA4g（6.44mmol），以真空***室温除水2小时。之后，加入71.7mL无水二甲基甲酰胺溶解。再加入5.41g的碳酸氢钠（64.4mmol）和0.403g的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物（2.58mmol）后，降至0℃。之后加入2.07g的二乙酸碘苯（6.44mmol），自然回温反应6小时，得到HATBA-CHO粗产物。真空减压旋转浓缩二甲基甲酰胺溶剂至20mL呈橘红色浓稠态后，缓慢滴入1000mL冰乙酸乙酯进行沉淀并离心。得到HATBA-CHO白色固体粗产物。继之，将前述HATBA-CHO白色固体粗产物加入20mL的乙醇溶解，再行缓慢滴加至***与四氢呋喃混和溶剂（***：四氢呋喃=2：1）中析出大量白色固体。以离心移除溶剂后减压浓缩，并在真空室温干燥1天后，得到3.05g白色HATBA-CHO固体产物。经化学计量添加调整，HA-TBA转化为HATBA-CHO的转化率如下表1所示。
[表1]
*HA-TBA:透明质酸-四级铵盐；TEMPO:2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物；BAIB:[双(乙酸基)碘]苯([bis(acetoxy)iodo]benzene)；S.C.:固含量。
HA-TBA进行氧化反应后，新生成的醛类讯号位于δ9.46ppm与δ9.26ppm，相较于HA的12号氢的积分比值可计算得转换率，并可提供调整氧化剂量后的转换率数值变化信息，HA-TBA-CHO的NMR结构鉴定光谱如第4图所标示。
【实施例3】
羧基聚己内酯(PCL-COOH)制备
将十二醇(1-dodecanol)置于柱状玻璃反应器，加入二价锡触媒Sn(Oct)2（stannous octoate）并升温至130℃，缓慢加入己内酯（epsilon-caprolactone）单体。待聚合反应完成后粗产物冷却回到室温，以等体积二氯甲烷(dichloromethane)溶解。于4℃二***(diethyl ether)进行沉淀，并于-20℃静置1小时。将白色沉淀物以抽气过滤法收集，真空室温干燥24小时，得到白色固体聚己内酯单醇(PCL-OH)产物。各化学计量可得到不同分子量
PCL-OH产物如下表2所示。
[表2]
PCL-OH C/Da Sn(Oct)2 Mw Mn PDI
样品1 20.18/1 0.5mol%b 4281 3071 1.39
样品2 15.00/1 0.5mol%b 4815 3521 1.37
样品3 10.53/1 0.5mol%b 4108 2933 1.40
样品4 5.26/1 0.5mol%b 1387 1172 1.19
样品5 10.53/1 0.5mol%b 2573 2093 1.23
样品6 5.26/1 1mol%c 1267 1079 1.17
样品7 5.26/1 0.5mol%c 1152 1005 1.15
样品8 43.81/1 0.5mol%c 5154 3979 1.30
样品9 20.18/1 0.5mol%c 2706 2203 1.23
样品10 43.81/1 0.5mol%c 3419 2808 1.22
样品11 20.18/1 0.5mol%c 2740 2199 1.25
样品12 43.81/1 0.5mol%c 7686 4696 1.63
aC/D=表示己内酯/十二醇的比值，bmol%表示相对于己内酯的摩尔比，cmol%表示相对于十二醇的摩尔比，PDI表示分子量的分布。
之后，称取上述获得的PCL-OH6g（Mw=4281,1.37mmol）于100mL双颈瓶中。真空干燥除水，氮气下加入15.5mL无水四氢呋喃，加热至60℃溶解。之后加入1.2mL三乙基胺（7.44mmol）。同时将0.121g的4-二甲胺基吡啶（DMAP）(0.992mmol）及0.844g的丁二酸酐（succinic anhydride）（8.43mmol）以16mL的无水四氢呋喃溶解完毕。之后，将PCL-OH溶液缓慢滴加至DMAP与丁二酸酐的混和溶液中，室温反应48小时。之后减压浓缩移除四氢呋喃溶剂，获得PCL-COOH粗产物。
继之准备600mL冰***/石油醚（1:1,v/v）混合液，缓慢将前述PCL-COOH粗产物加入冰***/石油醚混合液中。在析出大量白色固体后移至-20℃静置2小时，以抽气过滤法收集白色沉淀固体。在室温真空干燥，获得到4.6g PCL-COOH。
【实施例4】
酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)制备
取上述所得的PCL-COOH12g（Mw=3576,3.36mmol）于100mL双颈瓶中，抽真空移除空气。于氮气下加入54mL无水四氢呋喃，加热至60℃使之完全溶解后降至室温。接下来缓慢滴加1.9mL N-甲基吗琳（N-methylmorpholine,NMM,16.78mmol）后降温至0℃，并加入2.2mL氯甲酸异丁酯（Isobutyl chloroformamide,IBCF,16.78mmol）。于室温搅拌30分钟，生成PCL-酸酐中间产物并析出大量白色的盐类固体。
然后，取前述PCL-酸酐中间产物的澄清溶液缓慢滴加至装有33.6mL联胺四氢呋喃溶液（1M hydrazine in THF,33.6mmol）的150mL双颈瓶中，升温至40℃反应16小时。减压浓缩移除四氢呋喃溶剂，得到酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)粗产物。最后准备1200mL冰***/石油醚（1:1,v/v）混合液，缓慢滴加酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)粗产物至冰***/石油醚混合液中，析出大量白色固体。移至-20℃静置2小时，并以抽气过滤法收集白色沉淀固体，室温真空干燥，得到7.44g的酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)产物。酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)之FT-IR光谱如第5图所示，其中酰肼聚己内酯(PCL-hydrazide)的酰胺基(amide)官能基吸收峰位于1637cm-1。
【实施例5】
酰肼聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL-hydrazide)制备
首先使用250ml之柱状玻璃器做为反应装置，聚合前先升温至100℃，并通氮气30分钟。120g聚乙二醇单甲醚(Methoxypolyethylene Glycol,mPEG,分子量5000g/mole)、48g己内酯(ε-caprolactone)依序加入反应器中缓慢升高温度直至完全溶解。温度继续升高至100℃时加入触媒辛酸亚锡(Stannous Octoate,SnOct）0.67ml，130℃反应24小时。产物先以二氯甲烷溶解，再以***进行再沉淀后，于25℃之温度下真空干燥24小时，得到PEG-PCL-OH为白色粉末状产物。不同PEG链长与不同化学剂量比例产出之PEG-PCL-OH如下表3所示。
[表3]
*PDI表示分子量的分布。
取前述PEG-PCL-OH产物样品1712g（Mw=4928,2.435mmol）于100mL双颈瓶中真空干燥除水。于氮气下加入14.1mL无水四氢呋喃并加热至60℃，待PEG-PCL-OH均匀溶解后加入1.1mL三乙基胺（7.305mmol）。同时将0.119g的4-二甲胺基吡啶（DMAP）（0.974mmol）及0.828g的丁二酸酐（succinic anhydride）（8.28mmol）以25mL的无水四氢呋喃溶解完毕后。将前述PEG-PCL-OH溶液缓慢滴加至DMAP与丁二酸酐混和溶液中，室温反应48小时后减压浓缩移除四氢呋喃溶剂。获得PEG-PCL-COOH(PEG1900-PCL3000-COOH)粗产物。继之，准备800mL冰***/石油醚（1:1,v/v）混合液，缓慢滴加PEG1900-PCL3000-COOH粗产物至冰***/石油醚混合液中，析出大量白色固体。移至-20℃静置2小时，以抽气过滤法收集白色沉淀固体，室温真空干燥得到11.06g的PEG-PCL-COOH (PEG1900-PCL3000-COOH)。不同PEG-PCL-OH链长与不同化学剂量比例产出之PEG-PCL-COOH结果如下表4所示。
[表4]
SA:丁二酸酐；DMAP:4-二甲胺基吡啶；Et3N:三乙胺(triethylamine)；THF:四氢呋喃。
最后称取上述样品2310g产物PEG1900-PCL3000-COOH（Mw=4928,2.03mmol）于100mL双颈瓶中，抽真空移除空气。氮气下加入45mL无水四氢呋喃加热至60℃，使之完全溶解后降温至室温。接下来缓慢滴加1.1mL N-甲基吗琳（N-methylmorpholine,NMM,10.15mmol）后，降温至0℃，加入2.2mL氯甲酸异丁酯（isobutyl chloroformamide,IBCF,10.15mmol）。于室温下搅拌30分钟生成PEG1900-PCL3000-酸酐中间产物，并析出大量白色的盐类固体。取澄清之PEG1900-PCL3000-酸酐中间产物溶液，缓慢滴加至装有20.3mL联胺四氢呋喃溶液（1M hydrazine in THF,20.03mmol）的150mL的双颈瓶中，升温至40℃中反应16小时。经过减压浓缩移除四氢呋喃溶剂，得PEG1900-PCL3000-酰肼(PEG1900-PCL3000-hydrazide)粗产物。继之，准备1200mL冰***/石油醚（1:1,v/v）混合液，缓慢滴加PEG1900-PCL3000-酰肼粗产物至冰***/石油醚混合液中，析出大量白色固体。之后移至-20℃静置2小时，以抽气过滤法收集白色沉淀固体。室温真空干燥24小时后，得到8.76gPEG1900-PCL3000-酰肼白色粉末状产物。不同PEG-PCL-COOH链长与不同化学剂量比例产出之PEG-PCL-酰肼结果如下表5所示。
[表5]
IBCF:氯甲酸异丁酯；NMM:N-甲基吗琳；NH2NH2in THF:联胺四氢呋喃溶液；THF:四氢呋喃。
【实施例6】
透明质酸-g-(腙-聚己内酯)[HA-g-(HzPCL)]制备
称取实施例2所得的HATBA-CHO（0.805mmol）0.5g于25mL双颈瓶中，加入5.6mL绝对乙醇溶解。另取实施例4所得的PCL-酰肼（0.0805mmol）0.344g，加入4mL绝对乙醇溶解后，再缓慢滴加至HATBA-CHO乙醇溶液中。65℃反应8小时后回室温冷却，得到HATBA16k-g-(HzPCL)粗产物(PCL接枝率为10%)。
接下来将上述HATBA16k-g-(HzPCL)粗产物装入透析膜（molecular weight cut out(MWCO)12,000～14,000）于16℃环境下进行透析纯化。透析程序为500mL DMSO透析一天，接下来以pH=8之饱和食盐水透析二天，再对pH=8的二次水透析两天后。以钠离子交换树脂置换TBA后得到以得纯化后的HA-g-(HzPCL)产物水溶液。再将HA-g-(HzPCL)水溶液冷冻干燥后，获得最终产物HA16k-g-(HzPCL)/(HzPCL接枝率为10%)。
HA16k-g-(HzPCL)结构以1H-NMR进行鉴定如第6图所示。以12号之proton讯号（δ1.97ppm,s）作为计算PCL接枝比，其积分值相对于腙连接(hydrazone linkage)之proton讯号（δ8.33ppm,s）。求得HA16k-g-(HzPCL)结构中PCL接枝率。
【实施例7】
透明质酸-g-(腙-聚己内酯-聚乙二醇)[HA-g-(HzPCL-PEG)]制备
称取实施例2所得的HATBA-CHO2g（3.22mmol）于100mL双颈瓶中，加入20mL绝对乙醇溶解。另取实施例5所得的样品131.06g(PEG550-PCL3000-酰肼)（0.39mmol），加入15mL绝对乙醇溶解后，再缓慢 滴加至HATBA-CHO乙醇溶液中。65℃反应8小时后，回降温至室温，得到HATBA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)粗产物(PCL3000-PEG550接枝率12%)。
将HATBA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)粗产物装入透析膜（MWCO12,000～14,000）中，于16℃环境下进行透析纯化。透析程序为500mL DMSO透析一天，接下来以pH=8之饱和食盐水透析二天，再对pH=8的二次水透析两天。之后以钠离子交换树脂置换TBA后，得到纯化后之HA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)水溶液。再将该水溶液冷冻干燥后，可得为黄色固体之HA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)最终产物(PCL3000-PEG550接枝率12%)。不同的PEG550-PCL3000-酰肼链长组成与不同化学剂量比例产出之HA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)结果如下表6所示。
另一方面，HA16k-g-(HzPCL3000-PEG550)结构以1H-NMR进行鉴定如第7图所示。以12号之proton讯号（δ1.91ppm,s）作为计算PCL接枝比，其积分值相对于腙连接(hydrazone linkage)之proton讯号h1（δ9.10ppm,s）与h2（δ6.51ppm,s），求得HA16k-g-(HzPCL-PEG)结构中PCL接枝率。
[表6]
【实施例8】
透明质酸-g-(聚己内酯-聚乙二醇)[HA-g-(PCL-PEG)]制备
称取实施例5所得的PEG-PCL-OH样品131.87g（0.54mmol）于双颈瓶中，利用甲苯溶剂于65～70℃共沸除水。接续加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)4.8mL溶解上述PEG-PCL-OH。再加入6000ppm的三乙二胺(triethylene diamine)(DABCO)以及3000ppm的辛酸亚锡(stannous octoate (SnⅡ))做为触媒。继之，再加入氢化苯基甲烷二异氰酸酯
(dicyclohexylmthane diisocyanate,H12MDI,0.23mL,0.48mmol）至反应瓶中，60℃反应6小时，得到PEG-PCL-NCO预聚合物溶液。
接下来于50mL双颈瓶中加入实施例2所得的HA16k-TBA3g（4.84mmol）。加入13mL DMSO后将反应瓶加热至60℃溶解，待完全溶解再加入6000ppm三乙二胺以及3000ppm辛酸亚锡做为触媒。将前述PEG-PCL-NCO预聚合物溶液打入HA-TBA之反应瓶中，于60℃下反应16小时，获得HA-g-(PCL-PEG)粗产物(PCL-PEG接枝率为10%)。
最后将前述HA-g-(PCL-PEG)粗产物装入透析膜（MWCO12,000～14,000）中，于16℃环境下进行透析纯化。透析程序为500mL DMSO透析一天，接下来以pH=8之饱和食盐水透析二天，再对pH=8的二次水透析两天。之后以钠离子交换树脂置换TBA后，得到纯化后之HA-g-(PCL-PEG)粗产物水溶液。再将该水溶液冷冻干燥后，可得为黄色固体HA-g-(PCL-PEG)最终产物(PCL-PEG接枝率10%)。不同PCL-PEG链长组成与不同化学剂量比例产出之HA-g-(PCL-PEG)结果如下表7所示。
【实施例9】
临界微胞浓度(CMC)分析
称取上列样品配制成1mg/ml水溶液，以50%稀释方式将前述样品依序稀释至6×10-5mg/ml等15种浓度。分别加入15μl的1.8×10-4M芘(pyrene)丙酮溶液，混合均匀后，避光静置16小时，真空抽除丙酮。接下来使用荧光光谱仪，以波长设定390nm，激发波长扫瞄设定270-360nm进行上述15种浓度扫瞄。记录于330-340nm间吸收最强之波长值。以浓度的Log值与荧光光谱吸收强度值做图，找出荧光光谱吸收强度变异起始点为临界微胞浓度值。下表8显示不同微胞材料的临界微胞浓度(CMC)。
[表8]
【实施例10】
粒径分析
粒径分析步骤为，称取测试样品20mg，加入2mL DMSO溶剂，于室温震荡溶解20分钟。再加入1mL二次去离子水，于室温震荡20分钟至完全溶解。接下来于室温环境下将上述溶液以MWCO6000～8000透析袋对二次去离子水1000mL透析24小时，去除DMSO溶剂。待透析结束，收集透析袋内样品溶液，调配制成测试样品的临界微胞浓度(CMC)100倍的溶液，进行粒径测试。使用粒径分析仪为COULTER，N4Plus粒径仪。测试前先行以0.45μm滤膜过滤测试样品。将样品水溶液置于石英样品槽，测试温度 设定为25℃，光散射角度为90度，记录平均粒径与粒径分布，结果如下表9所示。
[表9]
【实施例11】
酸解性能测试
称取实施例7所得的样品40之HA-g-(HZPCL-PEG)材料，配制成5组相同浓度之HA-g-(HZPCL-PEG)微胞水溶液(浓度为CMC的100倍浓度，pH值5.0)。将上述微胞水溶液移入MWCO12000～14000透析袋中，于37℃/pH=5.0水中透析24小时。其间分别于不同时间取样，并迅速将水溶液调整为中性后，以DMSO透析2天，将酸催化断键之PEG-PCL-酰肼移除。继之以NMR氢谱计算透明质酸上(δ1.97ppm,s)proton讯号相对于NMR氢谱(δ1.2-2.5ppm)间变化，计算出HA-g-(HZPCL-PEG)材料所形成的微胞于pH=5.0环境中酸解比例，结果如下表10所示。
[表10]
【实施例12】
微胞材料药物包覆及酸解释放试验
称取实施例7所得的样品3450mg与2.0mg若丹明-123(rhodamine-123)于DMSO(10mL)中。使用超音波震荡5分钟使之溶解，于室温环境中静置一天后，将溶液转移至透析袋中(Spectrum,MWCO3,500)。对pH8.0的二次水透析2天(将未包覆的若丹明-123确实去除)，以冷冻干燥法使上述所得包覆若丹明-123的微胞溶液干燥。
取上述冻干后的微胞10mg回溶于水中，倒入透析袋(spectrum,MWCO3,500)，于pH5.0的二次水进行酸解试验。结果显示，装有包覆若丹明-123之微胞水溶液，外观于0小时为橘色(若丹明-123的原来颜色)，6小时转为浅黄绿色，20小时接近无色透明。此结果显示包覆于微胞内的若丹明-123因微胞酸解而释出。之后，分别于第0小时与第6小时取透析袋内溶液干燥后之产物，以1H-NMR分析比对。结果显示，开始前之第0小时与酸解开始之第6小时的微胞材料，发现6小时于δ9.10、6.51ppm的腙(hydrazone)氢讯号与δ1.10-1.32ppm的PCL氢讯号均已消失。此结果代表腙被酸解后，PEG-PCL片段藉由透析被移除。
【实施例13】
透明质酸衍生物包覆阿霉素(Doxorubicin)药物配方
称取2mg阿霉素加入1ml的DMSO搅拌。然后加入阿霉素3倍当量摩尔浓度的三乙胺(TEA)，室温搅拌过夜。之后，再称取实施例6至实施例8所得的不同微胞材料各10mg，加入2ml的DMSO与去离子水的共同溶液(v/v=2/1)，搅拌1小时至完全溶解。将上述2溶液互相混合，搅拌0.5小时至完全均匀后，置入透析膜为MWCO=3500的透析袋中，以去离子水或pH7.4的PBS进行透析一天。所得到的样品进行后续包覆率与粒径测量。
不同配方组成及其粒径与包覆率结果如下表11及表12所示。结果显示，在疏水链段PCL末端导入亲水的PEG链段(亲疏水片段)，除了可增加材料的亲水性质外，此配方在酸性环境中之具有酸解能力之连接(腙连接)断键后，可以使得包覆在微胞内部的PEG链段钻出微胞外，同时释放出药物，增加药物在酸性环境的释放量。
[表11]
D/P比:阿霉素对微胞材料的比值；P.S.:粒径；E.E.:包覆率。
[表12]
D/P比:阿霉素对微胞材料的比值；P.S.:粒径；PI:分子量分散；[DXR]:阿霉素浓度；E.E.:包覆率。
【实施例14】
透明质酸衍生物包覆阿霉素(Doxorubicin)之药物释放行为
依照前实施例13所述之配方及方法，将阿霉素药物包覆于不同材料结构组成之微胞中进行释放行为测试。取样时间为第0小时至24小时，结果如第8图与第9图所示。第8图显示实施例13之HA-g-(HzPCL-PEG)在不同pH值下的释放曲线。结果得知，酸性环境下的药物释放明显高于中性环境 的药物释放，其比值约2倍。此结果表示藉由具有酸解能力之连接(腙连接)的作用，可以加速药物在酸性环境下的释放。第9图显示实施例13之HA-g-(HzPCL-PEG)材料中不同PEG链长的药物释放效果。结果可观察到，不同亲水链(PEG)的长度，藉由具有酸解能力之连接(腙连接)的效果，可以看出pH敏感的特性。而且，亲水链(PEG)长度愈长，显示药物释放率的增加。
虽然本发明已以优选实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此项技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可做些许变动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利要求书范围所界定者为准。

Claims (20)

1.一种透明质酸衍生物，其具有如式(I)所示之结构:
其中，
HA表示包括N-乙酰基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之单元，q表示2至10000之整数；
A表示一生物可断裂键，包括腙(hydrazone)基团；
M表示一疏水片段、亲水片段或两亲性片段之至少一种，
其中，该疏水片段由生物可吸收高分子的重复单元所构成，该生物可吸收性高分子的重复单元包括：己内酯(caprolactone)、丁内酯(butyrolactone)、D-丙交酯(D-lactide)、L-丙交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、乙醇酸(glycolic acid)、羟基己酸(hydroxyhexonoic acid)、羟基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊内酯(valerolactone)、羟基戊酸(hydroxy valeric acid)、苹果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之组合；
该亲水片段包括:聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚环氧乙烷(polyethylene oxide,PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMA)、或上述之组合；
该两亲性片段由下列疏水区域及下列亲水区域所构成，
该疏水区域的重复单元包括：己内酯(caprolactone)、丁内酯(butyrolactone)、D-丙交酯(D-lactide)、L-丙交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lacticacid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、乙醇酸(glycolic acid)、羟基己酸(hydroxy hexonoic acid)、羟基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊内酯(valerolactone)、羟基戊酸(hydroxy valeric acid)、苹果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之组合，
该亲水区域的重复单元包括:乙二醇(ethylene glycol)、环氧乙烷(ethyleneoxide)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidone)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、上述之共聚物、或上述之组合；以及
p表示该[A-M]直接接枝于每一该HA单元之数量，且p为0至4之整数，且每一该HA单元之p不得同时为0；
其中，该透明质酸衍生物具有生物可分解性及在酸性环境中断键的pH敏感性。
2.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，该生物可断裂键是于酸性环境进行酸解断键。
3.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，该生物可断裂键是与该N-乙酰基-D-葡醣胺及该D-葡醣醛酸之至少一羟基形成共价连接相互连接。
4.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，该疏水片段或两亲性片段包含有一个以上于酸性环境可断键之基团。
5.如权利要求4所述的透明质酸衍生物，其中，该酸性环境可断键之基团包括：腙(Hydrazone)、缩醛(acetal)、缩酮(ketal)、亚胺(imine)之至少一种基团。
6.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，该M的分子量为100至50,000Da的范围。
7.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其还包括一亲水片段，以一不易快速断键或者一非生物可断裂键接枝于该HA。
8.如权利要求7所述的透明质酸衍生物，其中，该亲水片段的重复单元包括:乙二醇(ethylene glycol)、环氧乙烷(ethylene oxide)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidone)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、上述之共聚物、或上述之组合。
9.如权利要求7所述的透明质酸衍生物，其中，该不易快速断键包括酯键。
10.如权利要求7所述的透明质酸衍生物，其中，该非生物可断裂键包括氨基甲酸键。
11.如权利要求1所述的透明质酸衍生物，其还包含一具有生物辨识功能的蛋白质分子，以一隔离链段接枝于该HA。
12.如权利要求11所述的透明质酸衍生物，其中，该具有生物辨识功能的蛋白质分子包括抗体或配体。
13.一种微胞，由如权利要求1-12任一所述的透明质酸衍生物于一亲水介质中形成。
14.如权利要求13所述的微胞，其中该透明质酸衍生物的浓度相对于该亲水介质为10重量％至0.0001重量％之范围。
15.一种药物递送***，包括一载体包覆一生物活性成分，其中该载体为由权利要求1-12任一所述的透明质酸衍生物所构成。
16.如权利要求15所述的药物递送***，其中，该载体形成微胞构造。
17.如权利要求15所述的药物递送***，其中该生物活性成分包括药物或营养物质。
18.如权利要求15所述的药物递送***，其中该活性成分包括抗癌药物。
19.如权利要求15所述的药物递送***，其中该生物活性成分与该透明质酸衍生物的重量比为1：1至1：20。
20.一种风味增强剂(flavor enhancer)，由权利要求1-12任一所述的透明质酸衍生物所构成，用以包覆一生物活性物质以减少该生物活性物质的味道。
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