CN103293317A - 一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽（氨基酸序列为：TPEVDDEALEK）、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽（氨基酸序列为：TPEV^*DDEAL^*EK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸）和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物（氨基酸序列为：CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸）；本试剂盒的定量限：0.004g/100g，重现性：RSD<6.2%，n=11天，回收率：93.6～99.8%（n=6），试样预处理简单，快速，成本低，并可同时对各类试样中非变性和热变性的牛乳β-乳球蛋白进行准确定量。

Description

一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用。

（二）背景技术

牛乳是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一，是导致儿童食物过敏的常见食物，它在儿童中的发病率为0.1～7.5%，严重危害婴幼儿健康。而其中的牛乳β-乳球蛋白被认为是主要的过敏原。

牛乳β-乳球蛋白（Bovineβ-lactglobulin，β-LG）是牛奶当中蛋白质的一种，约占鲜奶蛋白质的7-12%。在细胞及动物实验研究中发现，β-乳球蛋白的水解物或分子修饰物，具有降胆固醇与抗氧化等生理活性。前人研究发现牛乳β-乳球蛋白存在多种形式的遗传变异体，其中最主要的为变异体A（β-LG A）和B（β-LG B），它们之间的区别在于氨基酸序列中第64和118处两个氨基酸残基的不同（A中的ASP₆₄和Val₁₁₈分别改变为B中的Gly₆₄和Ala₁₁₈），而人乳则完全不含β-乳球蛋白。

牛乳β-乳球蛋白是由162个氨基酸残基组成的结构紧密的单体球蛋白，每个单体含有两个二硫键Cys₆₆-Cys₁₆₀和Cys₁₀₆-Cys₁₉₉，还有一个Cys₁₂₁自由巯基。结构相对稳定，遗传变异体β-LG A的平均分子量为18363Da，遗传变异体β-LG B的平均分子量为18277Da,牛乳β-乳球蛋白平均分子量为18320Da。由于原料质量混杂、加工工艺不同等原因造成产品质量良莠不齐，但又没有用于监测乳与乳制品中β-乳球蛋白（包括β-LG A和β-LG B）的准确有效的定量检测方法，其中主要原因是缺少用于准确定量测定的方法和必要的实验材料。

目前国内外用于牛乳β-乳球蛋白的检测方法仍以SDS-PAGE法为主，该法为半定量方法，不能进行准确定量，由于操作繁琐无法在普通的实验室进行推广；有人提出了应用GPC-UV的检测方法，由于凝胶色谱柱的分辨力低，紫外光检测灵敏度低的原因，而不能用于复杂基质或低含量的样品检测；Christoph Czerwenka（2007）等人采用LC-MS联用方法测定牛奶和乳制品中牛乳β-牛乳球蛋白的含量，在正离子电喷雾模式下，选用全扫描提取离子的方式，使用山羊奶和水牛奶的两种β-乳球蛋白变异体作为内标物，前者在样品处理前加入，避免样品在处理过程中的损失，克服了回收率低、基质干扰大等问题，后者在样品处理后加入，更加准确定量。但未对此进行***的方法学的验证。任一平（2010）等建立了LC-ESI-MS测定婴幼儿配方中的牛乳β-乳球蛋白的方法，样品经直接提取，根据蛋白在电喷雾离子化条件下会产生多电荷离子的原理，采用选择离子扫描模式（SIR）进行检测，该方法只限于试样中非变性的牛乳β-乳球蛋白的定量检测，无法测定因热处理而变性的牛乳β-乳球蛋白。经查询，至今为止还未发现应用同位素标记内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS同时测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳β-乳球蛋白的定量方法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳β-乳球蛋白的试剂盒及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物，所述牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEVDDEALEK；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEV^*DDEAL^*EK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物（图1）的氨基酸序列为：CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V^＊和L^＊为碳氮全同位素标记的氨基酸。

本发明试剂盒的关键：在碱性胰蛋白酶酶解的牛乳β-乳球蛋白产物中经实验确认了牛乳β-乳球蛋白所独自具有的氨基酸肽段；根据该肽段的氨基酸序列设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标肽的序列，经化学合成获得三种高纯度的肽段成品。试剂盒中的其他试剂和物品，可根据需求在市场选择，例如参照CN102590413A中所使用的部分试剂。

本发明试剂盒中，牛乳β-乳球蛋白特异肽（以下简称：特异肽）是指牛乳β-乳球蛋白经筛选酶解后所产生的肽段，通过研究发现TPEVDDEAALEK（特异肽）是牛乳β-乳球蛋白的特异肽段之一，经高效液相色谱串联高分辨质谱鉴定表明：在牛乳及其制品中的酪蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白等其他牛乳蛋白质序列中不存在与该氨基酸序列一致的肽段，在经牛胰蛋白酶酶解的产物中不存生该特异肽。该氨基酸序列是牛乳β-乳球蛋白经牛胰蛋白酶酶解后所独自具有的肽段（图2），经化学合成、纯化后的产品纯度可达99.0%，在本试剂盒中该产品作为定量标准物质使用（图3）。

牛乳β-乳球蛋白同位素标记特异肽是一条根据牛乳β-乳球蛋白特异肽氨基酸序列而设计的，带有两个全同位素标记氨基酸的特异肽段（以下简称：同位素特异肽）。其氨基酸序列为TPEV^*DDEAAL^*EK，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸，经化学合成、提纯后的产品纯度可达97.0%，且在产品中不存在特异肽。在本试剂盒中作为同位素内标经酶解后的质谱同位素标记物质使用（图4）；

牛乳β-乳球蛋白同位素标记内标物是专为本方法定量测定而设计合成的内标物（以下简称：同位素内标）。其氨基酸序列为CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段在酶解实验中，具有与牛乳β-乳球蛋白一致的酶解效率，可获得等量的同位素特异肽，在试样酶解前加入该肽段后，可以对试样中的牛乳β-乳球蛋白做准确定量。经化学合成、提纯后的产品纯度可达95.0%以上，且不存在非同位素标记的该序列肽段，在酶解反应过程中不产生牛乳β-乳球蛋白特异肽。在本试剂盒中作为同位素标记内标物质使用（图5）。

具体的，所述试剂盒中还包括下列组分：NH₄HCO₃溶液（使用浓度50mmol/L），DTT溶液（使用浓度500mmol/L），IAA溶液（使用浓度500mmol/L），CaCl₂溶液（使用浓度100mmol/L），胰蛋白酶溶液（使用浓度1mg/mL），以及甲酸。

本发明还涉及所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛乳β-乳球蛋白含量中的应用。

各种合成肽产品的质量控制方法：

建立高效液相色谱（HPLC）和高效液相四级杆时间飞行串联质谱联用（HPLC-Q-TOF）的检测方法对牛乳β-乳球蛋白特异肽、同位素特异肽和同位素内标进行纯度与杂质鉴定。

①应用HPLC检测合成肽的纯度

称取肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释5倍，用HPLC-UV法经反相色谱分离，在220nm波长下进行检测，面积归一法计算纯度。

②应用HPLC-Q-TOF检测合成肽的杂质

称取肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释20倍，用HPLC-Q-TOF法进行检测，通过全扫描以m/z的差异来鉴别杂质。

其中液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径

）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.08%（v/v）的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.08%（v/v）的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

其中质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0，全扫描质量数区间200-2000m/z，停留时间100ms。

乳或乳制品中牛乳β-乳球蛋白的测定方法：

本方法适用于各种含量的牛乳β-乳球蛋白样品的定量检测，原料包括浓缩乳清粉、WPC80乳清蛋白粉、脱盐乳清粉、生鲜乳等；产品包括婴幼儿配方粉、脱脂乳粉、全脂乳粉、高温杀菌奶、巴氏消毒奶、发酵型酸奶等牛乳制品。

本方法的原理：将试样稀释到一定的浓度，在其中加入同位素内标后，经变性处理、胰蛋白酶酶切、终止酶切等处理后，由液相色谱分离，导入串联四级杆质谱，多反应监测方式检测，内标法计算出结果。

所述样品前处理过程如下：

称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为0.2mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入20μL20μmol/L同位素内标和480μL50mmol/L NH₄HCO₃溶液混匀，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/L CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜后进样分析。

所述液相色谱分离参考条件如下：色谱柱：C18（孔径

）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

所述质谱检测参考条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。

所述质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为TPEVDDEAALEK，其双电荷质荷比为623.7m/z，它的两个特征碎片离子分别为918.6m/z和819.4m/z，对应的碰撞能量分别为20eV和22eV；同位素特异肽的氨基酸序列为TPEV^*DDEAAL^*EK（其中V*和L*为碳氮全同位素标记氨基酸），其双电荷质荷比为630.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为931.6m/z和826.5m/z，对应的碰撞能量分别为20eV和22eV。

所述内标法计算过程如下：用牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式C_x=n_a×M×N×10^-10,即可得到被测样品中牛乳β-乳球蛋白的含量C_x。公式中C_x为被测样品中牛乳β-乳球蛋白的含量，单位为g/100g；n_a为被测样液中牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度的值；M为牛乳β-乳球蛋白的分子量，为18320；N为样品稀释倍数。

本方法应用胰蛋白酶只作用于精氨酸（R）和赖氨酸（K）的专一性，把乳清蛋白酶切成分子量从几十至上千道尔顿的肽段分子，从中选择只有牛乳β-乳球蛋白所独有的特征肽段分子（特异肽）作为定性目标，经合成和提纯的高纯度特异肽为定量标准品，参与同位素稀释串联液质谱法中变性、酶解、分离和检测全过程定量。

本方法采用的装置为：高效液相串联四级杆质谱联用仪，高效液相四级杆时间飞行串联质谱仪，并配备相应的控制软件，恒温水浴摇床或恒温箱，蛋白质序列合成仪，微量移液器。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明试剂盒，配制齐全，通过试剂配制指南可操作简便地完成试剂配制，且易在一般实验室推广应用；

2、先进可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质量和检测结果的准确性；可满足大批量样品检测的需求。

3、本发明所开发建立的方法使用了经研究设计合成的同位素标记内标物，能够更为准确的对牛乳、配方粉及天然原料中的牛乳β-乳球蛋白进行定量，保证了结果的可靠性。

4、本发明可用于同时检测各种试样中非变性和热变性的牛乳β-乳球蛋白。

5、本发明所使用的试剂用量较少，检测成本较低，利于在普通实验室应用。试剂盒的检测成本为每个试样耗费31元人民币。

（四）附图说明

图1为本发明试剂盒所涉及的核心试剂整体外观照片；

图2为牛乳β-乳球蛋白特异肽在牛乳β-乳球蛋白一级结构中的位置及氨基酸序列图；

图3为本发明中所选牛乳β-乳球蛋白特异肽色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图4为本发明中所设计同位素特异肽的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图5为本发明中所设计同位素内标的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图6为本发明中所设计同位素特异肽与牛乳β-乳球蛋白特异肽的线性比较图；

图7为本发明中所设计同位素特异肽与牛乳β-乳球蛋白特异肽在不同基质中的基质效应比较图；

图8为本发明中所设计同位素内标与牛乳β-乳球蛋白的酶解效率比较图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1．本发明同位素特异肽的设计与确定：

根据实验确定的牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列，充分考虑其相关理化性质以及在质谱检测过程中的干扰与离子化效率问题，并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和亮氨酸（L^*）设计合成了牛乳β-乳球蛋白同位素特异肽，其氨基酸序列为TPEV^*DDEAAL^*EK。

保留时间、线性和基质效应等参数在一定程度上可反映被测物质的色谱分离行为和质谱离子化效率，为了验证本发明所设计的同位素特异肽与牛乳β-乳球蛋白特异肽，在色谱分离和质谱离子化过程中的行为是否相近，实验设计比较了本发明中的同位素特异肽和牛乳β-乳球蛋白特异肽，在相同色质谱条件下的保留时间、线性及其在不同基质中的基质效应。分别配制相同浓度的本发明中的同位素特异肽和牛乳β-乳球蛋白特异肽，以及这两者的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得两者的保留时间与线性回归方程（附图6）。结果表明本发明中同位素特异肽和牛乳β-乳球蛋白特异肽具有相同的保留时间，均为2.89min，由此可见本发明中同位素特异肽和牛乳β-乳球蛋白特异肽具有相同的色谱行为。两者的线性回归方程分别为y=15.94x-39.58和y=15.71x+24.03，由图6可见本发明中同位素特异肽和牛乳β-乳球蛋白的线性非常相近，说明两者在相同浓度时的信号响应相近，从而也表明两者在质谱中的离子化、碰撞碎裂等过程中具有相近的质谱行为表现。为了进一步验证两者的质谱行为差异，比较了两者在鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质中的基质效应（附图7），实验结果表明在不同基质中本发明的同位素特异肽在最大程度上保持了与牛乳β-乳球蛋白特异肽一致的质谱行为。

2．本发明同位素内标的设计与确定：

在配方食品等复杂基质样品中，蛋白的酶解过程存在众多的影响因素，可能影响蛋白的酶解效率，为消除这些不确定因素对定量结果带来的影响，在已设计选择并验证确定的同位素特异肽的基础上，充分考虑保留酶解位点的完整性并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和亮氨酸（L^*）设计合成了同位素内标，其氨基酸序列为CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，该同位素内标经碱性胰蛋白酶酶解后可产生同位素特异肽TPEV^*DDEAAL^*EK。

为了验证本发明中的同位素内标与牛乳β-乳球蛋白是否具有相近的酶解效率，设计进行了如下实验：

取空白溶剂、鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质按要求配制成蛋白质总含量不大于0.2mg/mL的溶液；将牛乳β-乳球蛋白和本发明的同位素内标配制成均含20μmol/L的混合标准溶液，准确吸取各基质溶液500μL，加入20μL混合标准溶液和480μL50mmol/L NH₄CO₃溶液，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L的IAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/L的CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至2mL，然后过0.22μm微孔滤膜得到理论浓度为200nmol/L的各物质对应的特异肽；另外取牛乳β-乳球蛋白特异肽和本发明的同位素特异肽用初始流动相配制成浓度为200nmol/L的标准溶液，在相同的色谱质谱条件下进行检测分析，将各试样酶解后测得的对应特异肽浓度与理论浓度进行比较，计算得到不同基质中对应物质的酶解效率（附图8）。由图8可知，在不同样品基质中，本发明的同位素内标与牛乳β-乳球蛋白具有相近的酶解效率，因此保证了检测结果的准确性。

实施例2：试剂盒配制及使用说明

一、试剂配制：

1、牛乳β-乳球蛋白特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质1管（该管内装有已预先准确称量的牛乳β-乳球蛋白特异肽）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的牛乳β-乳球蛋白特异肽标准储备液；

2、同位素特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质2管（该管内装有已预先准确称量的同位素特异肽）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的同位素特异肽标准储备液；

3、同位素内标标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质3管（该管内装有已预先准确称量的同位素内标）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的同位素内标标准储备液；

4、牛胰蛋白酶溶液的配制：准确移取10mL1.0%乙酸水溶液，加入牛胰蛋白酶（试剂1）管中（该管内装有已预先准确称量的牛胰蛋白酶，来源于牛胰腺，活力>10000BAEE units），经超声溶解（30s），所得溶液即为1mg/mL的牛胰蛋白酶溶液；

5、碳酸氢铵溶液（NH₄HCO₃）的配制：准确称取3.95g NH₄HCO₃（试剂2）于1000mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mmol/L的碳酸氢铵溶液；

6、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取0.925g IAA（试剂3）于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的碘代乙酰胺溶液；

7、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取0.7712g DTT（试剂4）于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液；

8、氯化钙（CaCl₂）溶液的配制：准确称取0.111g CaCl₂（试剂5）于10mL容量瓶中，加入超纯水约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为100mmol/L的氯化钙溶液。

二、样品前处理及分析：

称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为0.2mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入20μL20μmol/L同位素内标和480μL50mmol/L NH₄HCO₃溶液混匀，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/L CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至2mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。

液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径

）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。

质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为TPEVDDEAALEK其双电荷质荷比为623.7m/z，它的两个特征碎片离子分别为918.6m/z和819.4m/z，对应的碰撞能量分别为20eV和22eV；同位素特异肽的氨基酸序列为TPEV^*DDEAAL^*EK（其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其双电荷质荷比为630.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为931.6m/z和826.5m/z，对应的碰撞能量分别为20eV和22eV。

内标法计算过程如下：用牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式C_x=n_a×M×N×10^-10,即可得到被测样品中牛乳β-乳球蛋白的含量C_x。公式中C_x为被测样品中牛乳β-乳球蛋白的含量，单位为g/100g；n_a为被测样液中牛乳β-乳球蛋白特异肽的浓度值，单位为nmol/L；M为牛乳β-乳球蛋白的分子量的值，为18320；N为试样稀释倍数。

实施例3：

样品类型：市售婴幼儿配方奶粉。

称样品0.5g于250mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入20μL20μmol/L同位素内标和480μL50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL100mmol/L CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳β-乳球蛋白的含量为1.61g/100g。

实施例4：

样品类型：浓缩乳清粉。

称样品1.0g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，然后取样液2.5ml用水稀释至10ml，再准确吸取稀释液500μL，加入20μL20μmol/L同位素内标和480μL50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL100mmol/L CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳β-乳球蛋白的含量为28.29g/100g。

实施例5：

样品类型：生鲜牛乳。

称样品0.5g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入20μL20μmol/L同位素内标和480μL50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗室静置30分钟，加入10μL100mmol/L CaCl₂溶液和50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳β-乳球蛋白的含量为1.94g/100g，在文献报道的牛乳中β-乳球蛋白的理论含量范围内。

本发明试剂盒的牛乳β-乳球蛋白定量检测方法的特点：定量限：0.004g/100g，重现性：RSD<6.2%（n=11），精密度：回收率：93.6～99.8%（n=6），试样预处理简单、快速、成本低、适用范围广，可对各类试样中常量和微量的非变性和热变性的牛乳β-乳球蛋白进行同时准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

Claims (3)

1.一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物，所述牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEVDDEALEK；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEV^*DDEAL^*EK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物的氨基酸序列为：CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V^＊和L^＊为碳氮全同位素标记的氨基酸。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括：NH₄HCO₃溶液，DTT溶液，IAA溶液，CaCl₂溶液，胰蛋白酶溶液，甲酸。

3.如权利要求1所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛乳β-乳球蛋白含量中的应用。

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