CN103288978B - 岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用 - Google Patents
岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用，通过乙醇分级和氯化钙沉淀的方法从褐藻中水提和弱碱提溶液中分离纯化，糖残基主要是由a-1,3-/a-1,4-连接的L-岩藻糖组成，重均分子量为10-500kD，硫酸根含量为17.1-38.2%，其中单糖组成中岩藻糖含量为53.7-80.6%。本发明的岩藻聚糖硫酸酯不仅可在体外抑制α-糖苷酶的活性；还能显著降低2型糖尿病动物餐后糖化血红蛋白水平；本发明的岩藻聚糖硫酸酯具有资源丰富、制备工艺简单、得率高、容易产业化，以及产品具有水溶性好、稳定性高和安全低毒等优点，在2型糖尿病的防治方面具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋药物领域，尤其涉及一种岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗糖尿病α-糖苷酶抑制剂中的应用。
背景技术
随着人们生活习惯和膳食结构的变化，糖尿病的发病率急剧上升。2011年WHO发布的数据显示，每年全世界大概有460万人死于糖尿病相关的疾病，用于糖尿病的医疗费用高达4650亿美元。庞大的糖尿病群体给全球带来巨大的挑战。目前，中国有9000余万名糖尿病患者和超过1亿的糖尿病前期患者，总人口的25%存在糖尿病代谢异常现象，糖尿病患病率高达9.7%，中国已超越印度成为世界糖尿病人数最多的国家。
糖尿病是一种病因和发病机制尚未完全阐明的代谢性疾病，患者机体内糖、脂肪和蛋白质代谢发生紊乱，会造成机体多个组织产生系列并发症。几乎75-80%的糖尿病病人死于心血管疾病，而且糖尿病病人比非糖尿病病人得冠心病的几率要高2-4倍，糖尿病导致的死亡使患病人群的预期寿命减少了12-14年，并且生活质量大为降低。目前，WHO将糖尿病分为3类，包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠期糖尿病，其中II型糖尿病的发病率大约占糖尿病病人总数的90%左右。
目前为止，临床上用于治疗2型糖尿病的主要药物包括双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、胰高血糖素样肽类似物1、二肽基肽酶IV抑制剂、α-糖苷酶抑制剂等。但这些药物常会出现不同的副作用，个别药物发生继发性失效，甚至可能导致低血糖症和肝肾疾病等。因此急需研发高效低毒的抗2型糖尿病药物。目前临床上应用的α-糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖，伏格列波糖，米格列醇，其中阿卡波糖已经被推荐为治疗2型糖尿病的一线用药，成为治药物中的主力，可见α-糖苷酶抑制剂的筛选是发现糖尿病治疗药物的重要方法。
近年来，岩藻多糖抗糖尿病的活性备受关注。经过近10年国内外研究论文和专利查新检索表明，在提取分离和制备岩藻聚糖方面的资料较多。专利CN201010157935.2公开了一种岩藻半乳聚糖硫酸酯的提取分离纯化方法，专利CN201010218084.8公开了一种岩藻糖含量为25-35%的褐藻多糖硫酸酯的制备方法，专利200410023694.7公开了一种高硫酸根含量岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，但是这些方法或者使用加酸来提取岩藻聚糖，或者步骤复杂，提取率低，对多糖结构破坏较大且污染环境。而专利CN200510047582.X和CN01811618.3提供了岩藻聚糖硫酸酯的酶解制备方法，但其反应条件苛刻，生产成本很高。
国内外学者已经报道了一些关于海藻多糖及其寡糖抗2型糖尿病的研究。虽然海带中岩藻聚糖硫酸酯（Huang,et al.2010）和低分子量的石莼胶（Yu,et al.2003）被发现能降低动物模型中血清的总胆固醇（TCH）、低密度脂蛋白（LDL-CH）和甘油三酯（TG）的含量，且升高高密度脂蛋白（HDL-CH）含量，但是目前还没有关于岩藻聚糖硫酸酯抑制α-糖苷酶活性的报道。
发明内容
针对现有技术中制备岩藻聚糖硫酸酯存在的上述缺点，本发明提供了一种岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用，所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法包括无污染、破坏性小、生产成本低廉的水提和弱碱提、乙醇分级、氯化钙沉淀等步骤。同时，本发明提供了岩藻聚糖硫酸酯在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
岩藻聚糖硫酸酯，它的结构式如下：
其中所述R=OH或SO3 -，所述R1=H、SO3 -或寡聚木糖，所述R2=H、SO3 -或寡聚半乳糖，n=25-500，
所述岩藻聚糖硫酸酯包括α-1,3-或α-1,4-连接的L-岩藻糖、1→4连接的β-木糖、1→3或1→4连接的β-半乳糖,其中单糖组成中岩藻糖含量为53.7-80.6%、木糖为6.2-14.3%、余量为半乳糖，重均分子量为10kD-500kD，硫酸根含量为17.1-38.2%。
本发明提供了所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，它包括以下步骤：
(1)水和弱碱提取：将褐藻脱脂所得的粉末经水提取后，经弱碱溶液于恒温水浴下搅拌提取，合并获得多糖水溶液；
(2)乙醇分级：所述步骤(1)中多糖水溶液经蒸发浓缩后，利用乙醇分级，离心取沉淀溶解为质量比为1%-4%的水溶液；
(3)氯化钙沉淀：然后向步骤(2)中得到的溶液中加入1-3mol/L氯化钙溶液进行沉淀，离心取上清、透析，获得岩藻聚糖硫酸酯。
进一步的，所述褐藻为墨角藻、枯墨角藻、两列墨角藻、齿缘墨角藻、旋墨角藻或泡叶藻中的一种或几种。
进一步的，所述弱碱为质量比为2-6%的Na2CO3水溶液。
进一步的，所述恒温水浴为60-100℃水浴。
本发明还提供了所述岩藻聚糖硫酸酯在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用。
其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的抑制类型属于竞争性抑制剂，半数抑制浓度为1-50ug/ml。
进一步的，所述岩藻聚糖硫酸酯在1-50mg/kg/day的剂量下作用可显著抑制糖尿病小鼠的餐后血糖升高，降低糖化血红蛋白水平。
进一步的，所述糖尿病为2型糖尿病。
进一步的，所述岩藻聚糖硫酸酯服用至少十天。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供的岩藻聚糖硫酸酯的制备方法操作简便，不需要加酸预处理，而且有机溶剂使用量少，成本低，得率高，适合工业生产。本发明经体内外实验证实提取的岩藻聚糖硫酸酯可以有效的抑制肠道α-糖苷酶，在体外可以显著抑制人肠道α-糖苷酶活性，IC50仅为1-50ug/ml，不仅可以延缓餐后血糖的升高，显著降低餐后血糖；而且小鼠口服用剂量在1-50mg/kg/day能够显著延缓其餐后血糖的升高，能够显著降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖和糖化血红蛋白水平，其有效剂量远远低于阳性药物阿卡波糖（50mg/kg/day）。本发明产品来源于海洋天然产物，具有来源广泛、资源丰富易于产业化、成本低廉、低毒高效等诸多优点，在极低剂量下能够显著的延缓餐后血糖,降低糖化血红蛋白，这为该类药物的开发提供了新的途径，在糖尿病的防治方面具有广阔的市场应用前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1为本发明中FC的红外光谱图。
图2为本发明中FC的1H和13C核磁共振谱图。
图3表明本发明中岩藻聚糖硫酸酯（FC）仅服用10天可以降低2型糖尿病小鼠的血糖水平。
图4表明本发明中岩藻聚糖硫酸酯仅服用10天可以降低2型糖尿病小鼠的糖化血红蛋白水平。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
本发明采用乙醇分级和氯化钙沉淀的方法从褐藻(包括墨角藻和泡叶藻)水提和弱碱提溶液中分离获得所述岩藻聚糖硫酸酯，并试验其在制备抗糖尿病的α-糖苷酶抑制药物或者食品补充剂中的应用。
实施例1
一、岩藻聚糖硫酸酯的制备
1、将各种墨角藻和/或泡叶藻脱脂后的粉末经水提后,藻渣溶于质量比为2%的Na2CO3水溶液中，于80℃恒温水浴中提取多次以获得尽可能多的多糖溶液,合并提取到的多糖溶液并旋蒸浓缩。
2、所述多糖溶液旋蒸浓缩后，添加无水乙醇，使体系中乙醇的体积比浓度为30%，搅拌后，离心取上清液,向上清液中继续加入无水乙醇，使体系中乙醇的体积比浓度为80%，搅拌，离心取沉淀，用水溶解为质量比为2%（w/w）的多糖水溶液。
3、向步骤2制得的多糖水溶液中加入3mol/L CaCl2溶液，搅拌至再无沉淀生成为止，离心取上清，装入分子量截留为3500Da的透析袋中，透析至外液电导与蒸馏水电导一致为止。浓缩透析袋内溶液，冻干得岩藻聚糖硫酸酯，总得率约为原干藻重量的5-15%。
制得的所述岩藻聚糖硫酸酯糖残基组成主要是岩藻糖（Fuc），其次是木糖（Xyl）和半乳糖（Gal），糖残基主要是由α-1,3-/α-1,4-连接的L-岩藻糖，以及少量的β-1,4-连接的木糖和β-1,3-/1,4-连接的半乳糖组成,重均分子量为10-500kD，硫酸根含量为17.1-38.2%,其中单糖组成中岩藻糖含量为53.7-80.6%,木糖为6.2-14.3%，余量为半乳糖，结构式如下。
本发明中FC的红外光谱图如图1所示。其中,3451cm-1出现宽吸收峰,是O-H伸缩振动,2933cm-1出现弱吸收峰是C-H伸缩振动，1620cm-1出现宽吸收峰是-COO-非对称伸缩振动，1423cm-1出现的吸收峰是-COO-对称伸缩振动，1255cm-1处出现的吸收峰是为O=S=O对称伸缩振动，1033cm-1处出现的吸收峰是糖环中C-O-H变形振动，850cm-1出现的吸收峰是C4位C-O-S伸缩振动，820cm-1出现的吸收峰是C2位或者C3位C-O-S伸缩振动。
本发明中FC的1H-NMR和13C-NMR核磁共振谱图如图2所示。由13C-NMR谱图可以看出，FC为典型的岩藻聚糖硫酸酯，其在98.7ppm和94.6ppm附近的异头碳信号表明FC具有α-1,3-/α-1,4-连接的L-岩藻糖,82ppm是岩藻糖C2位被硫酸基取代后信号。由1H-NMR谱可以看出，其硫酸根主要位于岩藻糖残基的C2和C4位。
二、岩藻聚糖硫酸酯抑制肠道α-糖苷酶的活性实验
将得到的所述岩藻聚糖硫酸酯按照本领域通用的α-糖苷酶活性测定方法，评价它对人肠道α-糖苷酶活性的抑制作用，具体实验方法和结果如下。
1、岩藻聚糖硫酸酯体外抑制肠道α-糖苷酶的作用
利用提取的人肠道α-糖苷酶，底物为4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），岩藻聚糖硫酸酯简写为FC，阳性药物为阿卡波糖(Acarbose)。实验前首先测定酶活力以确保酶活力符合测定要求。抑制百分率=（抑制剂活力/酶活力）×100%。
试验结果如表1所示，岩藻聚糖硫酸酯能够显著抑制肠道α-糖苷酶的活性，浓度在0.05mg/mL时FC抑制率分别为85%，与阳性药物效果5mg/mL的效果相当，属于竞争型抑制方式。而且FC半数抑制浓度仅为2.4μg/mL，远远低于阳性药物的浓度，说明所述岩藻聚糖硫酸酯具有优于阳性药物阿卡波糖的体外抑制α-糖苷酶的活性。
表1硫酸岩藻糖体外抑制α-糖苷酶活性结果及作用方式
2、岩藻聚糖硫酸酯在体内抗2型糖尿病作用
利用转基因动物db/db小鼠动物模型，以此验证所述岩藻聚糖硫酸酯在体内抗糖尿病效果：将5-6周龄SPF级的雄性db/db小鼠随机分为模型组，FC药物组，每组6只。每天上午禁食，下午灌胃给药的同时给予饲料，分别与进食后1小时和2小时测定血糖，连续给药10天后断食12小时，眼球取血测定空腹血糖和糖化血红蛋白。图3中模型组为db/db对照组；药物组为岩藻聚糖硫酸酯组（db/db+FC），剂量为5mg/kg/day；阳性药物阿卡波糖组（db/db+Acarbose），剂量为50mg/kg/day；模型组给予同样体积的生理盐水。图4中模型组为db/db对照组；药物组为岩藻聚糖硫酸酯组（db/db+FC），剂量为5mg/kg/day；阳性药物阿卡波糖组（db/db+Acarbose），剂量为50mg/kg/day；模型组给予同样体积的生理盐水。
具体结果见表2，结果表明，在每天每千克体重给药5mg的情况下，岩藻聚糖硫酸酯处理的小鼠餐后1小时和2小时血糖明显降低，显著低于模型组(P<0.05)；如图3和4所示，连续用药10天后，其空腹血糖亦降低，而且糖化血红蛋白的水平明显低于对照组(P<0.05)。这些结果说明所述岩藻聚糖硫酸酯仅服用10天就可以显著延缓2型糖尿病小鼠的餐后血糖，有效降低糖化血红蛋白水平，而且在临床糖尿病的控制上，糖化血红蛋白的降低比空腹血糖的降低更能说明机体的整体血糖水平，其效果与阳性药物阿卡波糖在50mg/kg/day剂量时相当。
表2岩藻聚糖硫酸酯对2型糖尿病小鼠的治疗作用
综上，本发明实验结果表明所述岩藻聚糖硫酸酯在极低剂量下，以竞争性作用方式显著抑制人肠道α-糖苷酶活性；所述岩藻聚糖硫酸酯在1-50mg/kg/day的剂量下作用显著抑制2型糖尿病小鼠的餐后血糖升高，降低糖化血红蛋白水平，其效果与阿卡波糖相当，具有较好的抗2型糖尿病作用。
本发明的产品来源于褐藻中墨角藻属和泡叶藻属，具体可为墨角藻、枯墨角藻、两列墨角藻、齿缘墨角藻、旋墨角藻或泡叶藻中的一种或几种。具有来源广泛，成本低廉，安全性高效诸多优点，并且在体内外水平上都具有较好的抗2型糖尿病作用，为该类药物或者饮食补充剂的开发提供了新的途径。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于它的结构式如下：
其中所述R＝H或SO3 -，所述R1＝H、SO3 -或寡聚木糖，所述R2＝H、SO3 -或寡聚半乳糖，n＝25-500，
所述岩藻聚糖硫酸酯包括α-1,3-或α-1,4-连接的L-岩藻糖、1→4连接的β-木糖、1→3或1→4连接的β-半乳糖,其中单糖组成中岩藻糖含量为53.7-80.6％、木糖为6.2-14.3％、余量为半乳糖，重均分子量为10kD-500kD，硫酸根含量为17.1-38.2％。
2.根据权利要求1所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)水和弱碱提取：将褐藻脱脂所得的粉末经水提取后的藻渣，经弱碱溶液于恒温水浴下搅拌提取，合并获得多糖水溶液；
(2)乙醇分级：所述步骤(1)中多糖水溶液经蒸发浓缩后，利用乙醇分级，离心取沉淀溶解为质量比为1％-4％的水溶液；
(3)氯化钙沉淀：然后向步骤(2)中得到的溶液中加入1-3mol/L氯化钙溶液进行沉淀，离心取上清、透析，获得岩藻聚糖硫酸酯。
3.根据权利要求2所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述褐藻为墨角藻、枯墨角藻、两列墨角藻、齿缘墨角藻、旋墨角藻或泡叶藻中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述弱碱为质量比为2-6％的Na2CO3水溶液。
5.根据权利要求3所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述恒温水浴为60-100℃水浴。
6.根据权利要求1所述岩藻聚糖硫酸酯在制备抗2型糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述岩藻聚糖硫酸酯在制备抗2型糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯的抑制类型属于竞争性抑制剂，半数抑制浓度为1-50ug/ml。
8.根据权利要求6所述岩藻聚糖硫酸酯在制备抗2型糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯在1-50mg/kg/day的剂量下作用可显著抑制糖尿病小鼠的餐后血糖升高，降低糖化血红蛋白水平。
9.根据权利要求6所述岩藻聚糖硫酸酯在制备抗2型糖尿病的α-糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯服用至少十天。
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 264200 No. 20 Yong Jiang Street, Zhang Town, Huancui District, Shandong, Weihai Patentee after: Weihai Rensheng Group Co.,Ltd. Address before: 264200 No. 20 Yong Jiang Street, Zhang Town, Huancui District, Shandong, Weihai Patentee before: WEIHAI ZHIEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160912 Address after: 264200 No. 20 Yong Jiang Street, Zhang Town, Huancui District, Shandong, Weihai Patentee after: WEIHAI RENSHENG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 264200 No. 20 Yong Jiang Street, Zhang Town, Huancui District, Shandong, Weihai Patentee before: Weihai Rensheng Group Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: Fucoidan and its preparation method and application in the preparation of anti diabetes a- Application of glucosidase inhibitors Effective date of registration: 20220526 Granted publication date: 20151028 Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. revitalization branch Pledgor: WEIHAI RENSHENG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980006536 |
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Date of cancellation: 20230602 Granted publication date: 20151028 Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. revitalization branch Pledgor: WEIHAI RENSHENG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980006536 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Fucan Organosulfate and its preparation method and its application in the preparation of anti diabetes a- Application of Glycosidase Inhibitors Effective date of registration: 20230606 Granted publication date: 20151028 Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. revitalization branch Pledgor: WEIHAI RENSHENG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980042918 |
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Granted publication date: 20151028 Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. revitalization branch Pledgor: WEIHAI RENSHENG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980042918 |