CN1032840C - 高效复合增产菌及其生产方法 - Google Patents

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CN1032840C CN 93101635 CN93101635A CN1032840C CN 1032840 C CN1032840 C CN 1032840C CN 93101635 CN93101635 CN 93101635 CN 93101635 A CN93101635 A CN 93101635A CN 1032840 C CN1032840 C CN 1032840C
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Abstract

高效增产菌菌剂及生产方法，包括由蜡质芽孢杆菌、短芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌制备的单一菌剂和蜡质芽孢杆菌与短芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与球形芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与蜡质芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌制备的混合菌剂及生产方法，该增产菌有明显地增产、防病效果。

Description

人类为保护农作物所进行的斗争贯穿了近万年的农业史。随着农业现代化的发展进程，人们不断受到各领域科学技术日新月异的鼓舞，与此同时，人类面临的各种危机也愈发突出。首当其冲的就是能源危机，作为再生性能源的农业，由于现代化、集约化的深入而日趋变为高能投入***。能源紧缺，使得这种农业难以发展下去，特别是在第三世界国家，急需发展的是较低的能量输入而高产的农业***。本世纪采取的措施是品种改良、增施肥料和病虫害防治。
大量化肥、农药的使用一方面需要能量的大量投入，另一方面又带来了环境污染和生态平衡的破坏，人们痛定思痛，转而对生物技术寄予很大希望。
筛选微生物用于农作物防病、保健和增产、由于具有安全无污染、生产简便、成本低廉和效果显著等优点，日益成为农学研究中引人注目的领域。迄今为止，筛选利用的微生物来源于不同生态环境，包括细菌、放线菌、真菌及酵母菌等各类群。
利用细菌处理农作物以达到防病增产的目的已有大量研究，按照所用细菌的性质，主要有三大类型。一类是固氮菌，除了根瘤菌等共生固氮菌外，禾本科作物根际联合固氮菌和土壤自生固氮菌在国内外先后有不同程度的应用；一类是防病菌，主要是利用对病原物有拮抗作用的细菌；另一类是七十年代以后欧美各国注重研究的促生菌，即筛选自植物根际又可能产生抗菌素的根际细菌，主要对象是假单胞杆菌。后两类菌的实际应用规模远不如固氨菌。
本发明的发明人在长期研究过程中，创立了利用细菌增产防病的新的技术路线：(1)发明人研究认为植物体表体内的微生物在长期进化过程中与植物体形成了相互依存相互制约的生态关系，它们与植物组成一个共生复合体，即“自然生态系”；(2)有效地增产和防病取决于对这个生态系的综合改造和调节，而不是对个别病原物的单独作用；(3)从植物体本身筛选出的一些有益微生物，往往具有与植物体亲和性强，作用持久和在植物体表、体内综合起作用等特点，因而可望在农业生产实践中获得更为理想和稳定的效果。这方面的代表就是作物增产菌的研究和应用(专利号88106560.9)，采用这一技术路线从植物体上筛选得到的蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)，具有高效、稳定地促进作物增产、防治作物病害和提高作物产品品质等多功能，在农业生产上取得了巨大的社会、经济和生态效益。
本发明的目的是；利用本申请人的专利88106560的分离筛选菌种的方法，从植物体内体表筛选出能同植物共生，并能促进作物增产防病的芽孢杆菌，然后利用所得芽孢杆菌生产单一或混合作物增产菌菌剂，该菌剂应用在农作物上达到增产、防病的目的。
本发明的特征在于：本申请人利用专利号88106560的分离筛选方法，从植物体内体表分离筛选出了蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)MEP-01(CGMCC0188-01)、短芽孢杆菌(Ba-cillus brevis)MEP-02(CGMCC0188-02)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)MEP-03(CGMCC0188-03)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MEP-04(CGMCC0188-04)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)MEP-05(CGMCC0188-05)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)MEP-06(CGMCC0188-06)六种芽孢杆菌。另外本申请人在1988年9月28日申请88106560专利时，已筛选出了YIB蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
本发明是利用上述芽孢杆菌生产单一芽孢杆菌菌剂产品或者生产混合芽孢杆菌菌剂产品，这些菌剂产品施用在农作物上具有显著地促进作物增产和防病的作用。
生产的单一芽孢杆菌菌剂产品共六种，它们是：
1、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)MEP-01菌剂
2、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)MEP-02菌剂
3、坚强芽孢杆菌(B.firmus)MEP-03菌剂
4、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)MEP-04菌剂
5、球形芽孢杆菌(B.sphaeficus)MEP-05菌剂
6、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)MEP-06菌剂
生产出的混合芽孢杆菌菌剂产品共八种，它们是：
1、蜡质芽孢杆菌YIB和蜡质芽孢杆菌MEP-01混合菌剂
2、蜡质芽孢杆菌YIB和短芽孢杆菌MEP-02混合菌剂
3、蜡质芽孢杆菌YIB和坚强芽孢杆菌MEP-03混合菌剂
4、蜡质芽孢杆菌YIB和枯草芽孢杆菌MEP-04的混合菌剂
5、蜡质芽孢杆菌YIB和球形芽孢杆菌MEP-05的混合菌剂
6、蜡质芽孢杆菌YIB和地衣芽孢杆菌MEP-06的混合菌剂
7、蜡质芽孢杆菌MEP-01和短芽孢杆菌MEP-02的混合菌剂
8、坚强芽孢杆菌MEP-03和枯草芽孢杆菌MEP-04的混合菌剂
生产上述混合菌剂按下列含菌比将两种菌种配成混合菌液：其配比分别为：
蜡质芽孢杆菌YIB与蜡质芽孢杆菌MEP-01为1∶0.5-2
蜡质芽孢杆菌YIB与短芽孢杆菌MEP-02为1∶0.5-1.5
蜡质芽孢杆菌YIB与坚强芽孢杆菌MEP-03为1∶0.5-1.5
蜡质芽孢杆菌YIB与枯草芽孢杆菌MEP-04为1∶0.5-2
蜡质芽孢杆菌YIB与球形芽孢杆菌MEP-05为1∶0.5-2
蜡质芽孢杆菌YIB与地衣芽孢杆菌MEP-06为1∶0.5-1.5蜡质芽孢杆菌MEP-01与短芽孢杆菌MEP-02为1∶0.5-1.5
坚强芽孢杆菌MEP-03与枯草芽孢杆菌MEP-04为1∶0.5-2
将上述混合菌液分别接种到种子罐和发醇罐的培养料中发酵，均可得到作物增产菌混合菌剂产品。
菌株基本生物学特性
MEP-01，蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)。菌体杆状，长3～5微米，宽1.0～1.2微米，革兰氏反应阳性，芽孢形成前其原生质内不着色颗粒即β-羟基丁酸盐。芽孢中生或近中生，椭圆或柱状，芽孢囊不膨大，能厌氧生长，V.P反应阳性，V.P液pH4.3-5.5：生长温度10-45℃，7％NaCl中生长；pH5.7生长，从葡萄糖、麦芽糖产酸，不从木糖、乳糖、甘露醇产酸，能水解淀粉，利用柠檬酸盐；还原NO3 -→NO2 -。
MEP-02，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。菌体杆状，长1.5～4微米，宽0.6～0.9微米。革兰氏反应阳性或可变，芽孢椭圆或柱状，端生或近端生，芽孢囊膨大，不从碳水化合物产气，不能水解淀粉，接触酶阳性；在葡萄糖营养肉汤培养液中生长后pH大于8.0，V.P反应阳性，V.P液pH8.0-8.6；生长温度10-60℃，7％NaCl不生长，pH5.7生长，苯丙氨酸脱氨阴性，硝酸盐还原阳性。
MEP-03，坚强芽孢杆菌(B.firmus)。菌体杆状，长3-4微米，宽0.8～1.0微米，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆形，中生或近中生，孢囊不膨大，原生质内不含不着色颗粒，接触酶阳性，不能厌氧生长，V-P反应阴性，7％NaCl中生长，pH5.7不生长，能水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐。
MEP-04，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。菌体杆状，长2-3微米，宽0.7-0.8微米，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆或柱状，中生或近中生，孢囊不膨大，原生质中不含有β-羟基丁酸盐颗粒： 7％Nal中生长，石芯牛奶不产酸，pH5.7生长，V.P阳性，水解淀粉，还原NO3 -→NO2 -，不能厌氧生长，接触酶阳性。
MEP-05，球形芽孢杆菌(B.sphaeriaus)。菌体杆状，长1.5～5.0微米，宽0.6～1.0微米，革兰氏反应可变，芽孢球形，端生或近端生，孢囊膨大，不水解淀粉，不从糖类发酵产酸，接触酶阳性，苯丙氨酸脱氨阳性，V.P反应阴性。MEP-06，地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)。菌体直杆状，成链，长2.5～3.5微米，宽1～1.2微米，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆或柱状性，孢囊不膨大，原生质内没有不着色小球。水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，碳水化合物不产气，7％NaCl生长，pH5.7生长，V.P阳性，V.P液生长后pH6.3，能厌氧生长，接触酶阳性。
上述六个菌株已于1993年元月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
YIB，蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)。菌体直杆状、成链、光镜下长2.5-3.5微米，宽1微米、革兰氏反应阳性，芽孢椭圆或柱状，中生，孢囊不膨大，原生质内含有不着色颗粒，洋菜平板培养，菌落圆形，直径0.2cm，边缘整齐，稍***，无光泽，不透明，蜡质；液体培养，形成菌膜。生长温度15-45℃，最适27-32℃，适宜pH6.0-7.5，适宜碳源麦芽糖、蔗糖，适宜氮源为蛋白胨，无机氮源为NH4 +，发酵葡萄糖，麦芽糖产酸，木糖、乳糖、甘露醇不产酸。水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，7％NaCl中生长，pH5.7生长，V.P阳性，V.P液培养后pH4.56。能厌氧生长，接触酶阳性，碳水化合物产气阴性，不产生吲哚，苯丙氨酸脱氨阴性。
YIB菌株已于1988年9月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC0137。
发酵生产工艺
包括：菌种活化→菌种扩大培养→菌液配制→种子罐发醇→发醇罐发酵→粉剂后加工→成品检验→包装
(一)菌种准备
菌种在肉汁胨斜面活化后，转入扁瓶在28～30℃培养24小时，用0.1％蛋白胨水溶液制成悬液。充分振荡混匀后取样计数。将准备发醇生产的菌种单独或按比例混合制成混合菌液，用于种子罐培养。
(二)种子罐培养
种子罐配方：黄豆饼粉1-37％，鱼粉1％，玉米浆0.3％，葡萄糖0.2％，蚕蛹粉0.3％，豆油0.2-0.3％。调节pH值7.4-7.5。
空罐在125℃/0.14MPa压力下灭菌30分钟，装料后在121℃/0.11MPa下灭菌30分钟。冷却至35℃接种，每350立升种子罐接4-5个扁瓶。接种后在温度30～34℃，通气量1∶1.1(v.v.m)条件下培养5-7小时，即可移种至发醇罐内发酵培养。此时种子罐发酵液菌量达5～10亿/ml。
(三)发酵罐发酵
发酵罐在接种前和投料前分别经121℃/0.11MPa和125℃/0.14MPa灭菌30分钟。
发酵罐配方：花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，鱼粉0.5％，玉米浆1％，糊精0.8％，硫酸镁0.1％，碳酸钙0.15％，KH2PO40.02％，豆油0.15％，pH值7.4-7.6。
培养料冷却至35℃时接种，接种量为3-5％。培养温度：前期32～34℃，12小时后35-36℃。通气量：接种后6小时内1∶1，6小时后增至1∶1。发酵时间16～2.0小时，含菌量达50～80亿/ml。
(四)粉剂后加工
发酵液可直接装瓶包装成菌剂。发酵液也可加工成粉剂。加工粉剂方法是，先加入吸附填加剂，机械搅拌4-5小时，菌孢全被吸附后，板框过滤机压滤；滤饼经捣碎后，置烘干机烘干(烘干温度不超过70℃)，当含水率≤5％时，即进行粉碎，其粒度要求通过0.09mm孔径筛。粉剂产品含菌量不低于500亿/克，经检验后即可包装。
菌剂的应用方法
菌剂可用于种子浸种、拌种、叶面喷雾或沾根，使用方法同作物增产菌YIB，但本液体制剂用量仅需YIB的1/2～1/4，粉剂用量仅需YIB的1/5。
本发明的优点和积极效果
(1)菌株MEP-01、MEP-02、MEP-05的发酵产品，专用于双子叶类作物；菌株MEP-03、MEP-04、MEP-06的发酵产品，专用于单子叶类作物。它们的增产作用分别不低于菌株YIB在双子叶和单子叶作物上的效果。菌株YIB与MEP-01，YIB与MEP-02，YIB与MEP-05和MEP-01与MEP-02的发酵产品，专用于双子叶类作物；YIB与MEP-03，YIB与MEP-04，YIB与MEP-08和MEP-03与MEP-04发酵产品，专用于单叶类作物。它们对双子叶和单子叶类作物的增产效果明显优于新型增产菌和作物增产菌YIB，一般双子叶作物稳定增产25-120％，单子叶作物稳定增产20％-90％。其中YIB+MEP-02尤其适于果树，除增产和增糖外，防治苹果霉心病、轮纹病等效果达65％以上；MEP-01+MEP-02尤其适于甜菜，除高效增产外，含糖量提高2度以上。YIB+MEP-04尤其适于水稻和小麦，除显著增产外，防治纹枯病效果达70％以上。
(2)相对于新型增产菌的固体发酵工艺而言，本发明所形成的粉剂产品不仅可溶于水更便于叶面喷雾等应用，而且含菌量提高了五倍以上，不仅提高了应用效果，也便于运输和保藏。
(3)相对于增产菌YIB的发酵工艺而言，本发明含菌量有大幅度提高，节约了成本，提高了效益。
下面叙述本发明的实施例：
作物增产菌的发明人在深入研究的基础上，发现从单子叶植物体表体内筛选出的有益蜡质芽孢杆菌和从双子叶植物上筛选得到的地衣芽孢杆菌混合使用，具有优于单菌株单独使用的增效作用，并研究了其固体发酵工艺(公开号90103591.2)。在进一步的研究过程中本发明的发明人发现：(1)植物体表体内不同类别的芽孢杆菌对植物的作用有不同程度的共同性和差异性：(2)从同类植物上所得有益芽孢杆菌菌株混用效果往往优于不同类型植物上所得到的菌株混用。因此，本发明的发明人改进并建立了高效复合增产菌的配制方法，并研究完善了相应的液体发酵工艺和粉剂加工技术，兹叙述如下：
一、增产菌产品实施例：
本发明分离筛选出的六种芽孢杆菌可以生产出单一芽孢杆菌菌剂和混合芽孢杆菌菌剂产品：
生产的单一芽孢杆菌菌剂产品共六种，它们是：
1、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)MEP-01菌剂
2、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)MEP-02菌剂
3、坚强芽孢杆菌(B.firmus)MEP-03菌剂
4、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)MEP-04菌剂
5、球形芽孢杆菌(B.sphaencus)MEP-05菌剂
6、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)MEP-06菌剂
生产出的混合芽孢杆菌菌剂产品共八种，它们是：
1、蜡质芽孢杆菌YIB和蜡质芽孢杆菌MEP-01的混合菌剂
2、蜡质芽孢杆菌YIB和短芽孢杆菌MEP-02的混合菌剂
3、蜡质芽孢杆菌YIB和坚强芽孢杆菌MEP-03的混合菌剂
4、蜡质芽孢杆菌YIB和枯草芽孢杆菌MEP-04的混合菌剂
5、蜡质芽孢杆菌YIB和球形芽孢杆菌MEP-05的混合菌剂
6、蜡质芽孢杆菌YIB和地衣芽孢杆菌MEP-06的混合菌剂
7、蜡质芽孢杆菌MEP-01和短芽孢杆菌MEP-02的混合菌剂
8、坚强芽孢杆菌MEP-03和枯草芽孢杆菌MEP-04的混合菌剂
二、高效复合增产菌生产方法实施例：
实施例1
(一)菌种培养
将YIB和MEP-01分别在肉汁胨斜面活化后，转入扁瓶在28～30℃，培养24小时，加入浓度为0.1％蛋白胨水溶液，制成菌悬液，充分振荡混匀，计数后将悬液按1∶1的菌数比例混匀，用于接种种子罐。
(二)种子罐培养
种子罐培养液配分：黄豆饼粉1.5％，鱼粉1％，玉米浆0.3％，葡萄糖0.2％，蚕蛹粉0.3％，豆油0.25％，调节pH值7.5，以每350立升培养液接种4个扁瓶(每菌2个扁瓶)菌种所得菌液的接种量接种混合菌液。培养温度30～34℃。通气量为1∶1(v.v.m)，培养5-7小时。此时种子罐发酵液菌量达5～10亿/ml。
(三)发酵罐发酵
发酵罐培养液配方：花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，鱼粉0.5％，玉米浆1％，糊精0.8％，硫酸镁0.1％，碳酸钙0.15％，KH2PO40.02％，豆油0.15％，pH值7.5。以3％的接种量接种种子罐发酵液。培养温度：前期32-34℃，12小时后35-36℃。通气量：接种后6小时内1∶1(v.vm)，6小时后增至1∶1.1(v.vm)。发酵时间16-20小时，含菌量达75亿/ml。发酵液直接装瓶包装成液体菌剂。
(四)粉剂后加工
发酵液也可加工成粉剂。加工粉剂方法是，先加入吸附填加剂，机械搅拌4-5小时，菌孢全被吸附后，板框过滤机压滤；滤饼经捣碎后，置烘干机烘干(烘干温度不超过70℃)，当含水率≤5％时，即进行粉碎，其粒度要求通过0.09mm孔径筛。粉剂产品含菌量不低于500亿/克，经检验后即可包装。
实施例2
基本上采用实施例1相同方法。不同之处是采用YIB和MEP-02菌种以1∶1.2-1.5的比例混合接种种子罐。
实施例3
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用YIB和MEP-03菌种以1∶1.2-1.5的比例混合后接种种子罐。
实施例4
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用YIB和MEP-04菌种以1∶1.2-1.5的比例混合后接种种子罐。
实施例5
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-01和MEP-02以1∶1.2-1.5的比例混合后接种种子罐。
实施例6
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-03和MEP-04菌种以1∶1的比例混合后接种种子罐。
实施例7
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用YIB和MEP-05以1∶1的比例混合后接种种子罐。
实施例8
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用YIB和MEP-06以1∶1的比例混合后接种种子罐。
实施例9
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-01菌种接种种子罐。
实施例10
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-02菌种接种种子罐。
实施例11
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-03菌种接种种子罐。
实施例12
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-04菌种接种种子罐。
实施例13
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-05菌种接种种子罐。
实施例14
基本上采用与实施例1相同方法。不同之处是采用MEP-06菌种接种种子罐。

Claims (11)

1、由单一芽孢杆菌发酵的作物增产菌，其特征在于：该作物增产菌是由蜡质芽孢杆菌(Bacil-lus cereus)MEP-01(CGMCC0188-01)，或者短芽孢杆菌(Bacillus brevis)MEP-02(CGMCC0188-02)，或者坚强芽孢杆菌(Bacil-lus firmus)MEP-03(CGMCC0188-03)，或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MEP-04(CGMCC0188-04)，或者球形芽孢杆菌(Bacil-lus sphaericus)MEP-05(CGMCC0188-05)，或者地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MEP-06(CGMCC0188-06)单一发酵所得的菌剂。
2、由混合芽孢杆菌发酵的作物增产菌，其特征在于：该作物增产菌是由蜡质芽孢杆菌YIB(CGMCC0137)和MEP-01，或者YIB和MEP-02，或者YIB和MEP-03，或者YIB和MEP-04，或者YIB和MEP-05，或者YIB和MEP-06，MEP-01和MEP-02，或者MEP-03和MEP-04，混合发酵所得的菌剂。
3、一种作物增产菌菌剂的生产方法，包括菌种活化、菌种扩大培养、菌液配制、种子罐发酵、发酵罐发酵；粉剂后加工、成品检验、包装，其特征在于：生产混合增产菌菌剂时按下列比例配成混合菌液： YIB与MEP-01比例为1∶0.5-2，YIB与MEP-02比例为1∶0.5-1.5，YIB与MEP-03比例为1∶0.5-1.5，YIB与MEP-04比例为1∶0.5-2，YIB与MEP-05比例为1∶0.5-2，YIB与MEP-06比例为1∶0.5-1.5，MEP-01与MEP-02比例为1∶0.5-1.5，MEP-03与MEP-04比例为1∶0.5-2，将混合菌液分别接种到种子罐和发酵罐的培养料中发酵均可得到作物增产菌混合菌剂产品。
4、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-01比例为1∶1。
5、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-02比例为1∶1.2-1.5。
6、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-03比例为1∶1.2-1.5。
7、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-04比例为1∶1.2-1.5。
8、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：MEP-01与MEP-02比例为1∶1.2-1.5。
9、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：MEP-03与MEP-04比例为1∶1。
10、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-05比例为1∶1。
11、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：YIB与MEP-06比例为1∶1。
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