CN103283973A

CN103283973A - 一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的生产方法

Info

Publication number: CN103283973A
Application number: CN2013100878929A
Authority: CN
Inventors: 李帅伟; 李本涛; 夏新界
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种嗜酸乳酸杆菌微生态制剂的液体发酵生产方法。它包括以下步骤：采用嗜酸乳酸杆菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为35～38℃的条件下培养20～23h，放罐并测定活菌数，用植物淀粉吸附发酵液，经干燥后粉碎和包装，制成活性稳定的嗜酸乳酸杆菌制剂。本发明的优点：用普通发酵罐即可完成嗜酸乳酸杆菌的高密度发酵，操作简单，效果稳定，能耗低；不用离心机和冷冻干燥机等设备，降低了生产成本，提高了生产效率。

Description

一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种液体培养基经嗜酸乳酸杆菌厌氧发酵制备益生菌饲料添加剂的方法。

背景技术

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于乳杆菌属（Lactobacillus），革兰氏阳性杆菌，形态呈细长杆状，杆的末端呈圆形，大小为0.6~0.9×l.5~l.6μm，以单个、成对或短链形式存在，不运动，无鞭毛，无芽孢，过氧化氢酶阴性，同型发酵乳糖，不液化明胶，最适生长温度为35~38℃，20℃以下不生长。最适pH值为5.5~6.4，耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖。G＋C含量为36.0~37.4%，不产生细胞色素。嗜酸乳杆菌是一类厌氧或兼性厌氧的微生物，无氧或较低的氧分压环境下在固态基质表面生长，5~10%的二氧化碳可促进嗜酸乳杆菌的增殖。能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，发酵产生DL型乳酸。嗜酸乳杆菌广泛存在于人及一些动物的肠道中，是有益微生物菌群，当存在一定数量时，它能有利地调节肠道内有益和有害微生物菌群间的平衡，对维持胃肠道的生理功能有重要作用。

嗜酸乳杆菌是一类可利用碳水化合物发酵而产生大量乳酸的细菌，此外可产生短链脂肪酸、抗菌肽、多糖、过氧化氢、特殊酶系等。一些农产品废弃物经过接种乳酸杆菌发酵后，其发酵产物对动物肠道健康十分有益，已有研究证明实质上起主要作用的是抗菌肽。嗜酸乳杆菌主要是调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖。嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拮抗作用，它能分泌抗生物素类物质，如：嗜酸乳菌素（acidolin）、嗜酸杆菌素（acidophilin）、乳酸菌素（1aetocidon），对肠道致病菌产生抑制作用。　　嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一，被视为第三代酸乳发酵剂菌种，当其达到一定数量时，可以起到健康促进效果。

（1）生物屏障作用

嗜酸乳杆菌与肠粘膜上皮细胞的相互作用和密切结合构成了生物学屏障；同时，通过其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的粘附。

（2）营养作用

乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、铁的利用率和维生素D的吸收；乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经***中脑苷脂的成分，与婴幼儿出生后的生长有着密切的关系；同时产生的大量维生素B群能促进机体神经细胞的发育；提高机体肠内的β－半乳糖苷酶的活性，促进乳糖的吸收，从而缓解乳糖不耐症；能分泌蛋白酶，促进蛋白质的消化吸收。

（3）抗癌作用

腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合物、胆固醇及胆汁酸的代谢物、氨基酸代谢物（酚类、吲哚、硫化氢）等有机致癌物质。这些致癌物质有关的肠内细菌酶有β-葡萄糖醛酸酶、巯基还原酶、偶氮还原酶等。嗜酸乳杆菌能改善肠道菌群，抑制致癌物质的产生；同时，嗜酸乳杆菌及其代谢产物活化了免疫功能，抑制癌细胞的形成和增殖。

（4）增强机体免疫力

嗜酸乳杆菌在肠道内定殖，相当于自然免疫，能激活机体巨噬细胞活性，诱发特异性和非特异性免疫反应，提高抗感染的能力。

（5）延缓机体衰老

机体的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素等有害腐败产物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸抑制了这些腐败物，使机体衰老的过程变得缓慢。

将嗜酸乳酸杆菌经过高密度液体发酵，获得高菌体密度的发酵培养液，经植物淀粉吸附后，干燥，粉碎，制成的嗜酸乳酸杆菌微生态制剂应用于畜牧养殖，能够调节动物肠道菌群平衡，增强机体免疫力，提高抗病能力。

以往的嗜酸乳酸杆菌的发酵方式主要存在以下问题和不足：（1）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；（2）大量采用胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为培养基主要营养成分，生产成本高；（3）液体发酵产物的后处理需要高速冷冻离心机进行离心和低温冷冻干燥，工艺复杂，成本高昂，产量低；（4）发酵产物的活菌密度不够高。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的制备方法，以克服现有的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的制备方法存在的上述不足。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制培养基；

（2）溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；

（3）对发酵罐中的培养基加温灭菌；

（4）接种嗜酸乳酸杆菌种子菌：在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入种子菌；

（5）控温发酵；控制pH值和温度，在保温的状态下发酵；

（6）放罐并测定发酵液菌数；

（7）用玉米粉、小麦粉或者大豆粉及其组合物吸附发酵液；

（8）将吸附后的混合物干燥和粉碎，即获得粉状制剂。

本发明的技术优势：

（1）直接利用普通发酵罐即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）生产周期短，72h即可完成一个批次的生产，易于产业化，从而将嗜酸乳酸杆菌广泛应用于畜牧养殖业；

（3）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；用于隔绝空气的液体石蜡可以多次反复使用，大大降低了生产成本；

（4）本发明采用大豆粉、玉米粉或者小麦粉或者其组合物作为发酵培养基的主要成分，与其他发明采用的胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为主要成分相比，成本大大降低，并且发酵产物活菌浓度可达1~2.0×10¹⁰ CFU/mL；

（5）本发明采用植物淀粉吸附发酵液，后处理工艺不需要用高速冷冻离心机，本发明将植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎，包装后即制成产品，后处理工艺大大简化，生产成本更低；

（6）国内外有关粉末发酵剂的研制，大多采用真空冷冻干燥法，此方法的优点是菌体细胞存活率高，但是工艺复杂，制作成本高，而吸附后干燥法的生产成本低，操作工艺简单，较易用于大规模的工业化生产和推广应用。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1嗜酸乳酸杆菌活菌制剂制备的工艺流程，包括以下步骤：

（1）菌种的活化与增值：

本发明采用嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）作为发酵菌种，菌种编号：GIM1.268，购于广东省微生物菌种保藏中心，但不限于该保藏编号的嗜酸乳酸杆菌；从平板上挑取嗜酸乳酸杆菌单菌落，接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养20小时左右，菌液以0.3%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养20小时左右备用；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

（2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：大豆粉（即发酵豆粕）50g，玉米粉15g，葡萄糖10g，酵母浸出粉2g，蛋白胨4g，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行121℃，时间为10分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.0g/1000mL基料，无机盐组成：CaCl₂ 0.02%，MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为2cm；

（3）控温发酵：接入嗜酸乳酸杆菌液体种子的接种量为0.3%，搅拌均匀，控制 pH 5.5~6.4，发酵温度控制在37℃，发酵23个小时，放罐，将嗜酸乳酸杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度为1.8×10¹⁰CFU/mL；

（4）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉、豆饼粉和小麦粉混合均匀，作为发酵液的吸附剂；

（5）将植物淀粉吸附的嗜酸乳酸杆菌发酵液进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

实施例2 与上述实施例1不同的是：

（1）培养基配方：培养基包括的原料及重量份数为：大豆粉（即发酵豆粕）45g，玉米粉15g，葡萄糖12g，酵母浸出粉1g，蛋白胨3g，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行115℃，时间为20分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.5g/1000mL基料，无机盐的组成：CaCl₂ 0.02%，MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1cm；

（2）控温发酵：接入嗜酸乳酸杆菌液体种子的接种量为1%，搅拌均匀，控制 pH 5.5~6.4，发酵温度控制在35℃，发酵22个小时，放罐，将嗜酸乳酸杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度为1.5×10¹⁰CFU/mL；

（3）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀，作为发酵液的吸附剂；

（4）将植物淀粉吸附的嗜酸乳酸杆菌发酵液进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims

1.一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）菌种的活化与增值：

本发明采用嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）作为发酵菌种，菌种编号：GIM1.268，购于广东省微生物菌种保藏中心；从平板上挑取嗜酸乳酸杆菌单菌落，接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养20小时左右，菌液以0.3%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养20小时左右备用；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

（2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：大豆粉（即发酵豆粕）40~50，玉米粉10~15，葡萄糖10~12，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm；

（3）控温发酵：接入嗜酸乳酸杆菌液体种子的接种量为0.3~0.5%，搅拌均匀，控制 pH 5.5~6.4，发酵温度控制在35~38℃，发酵20~23个小时，放罐，将嗜酸乳酸杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度可达1.0~2.0×10¹⁰CFU/mL；

（4）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为发酵液的吸附剂；

2.根据权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的生产，其特征在于所述的培养基：大豆粉（即发酵豆粕）40~50，玉米粉10~15，葡萄糖10~12，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种。

3.根据权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂，其特征在于：培养温度为35~38℃。

4.根据权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂，其特征在于：种子菌接种量为0.3~0.5%的接种量。

5.根据权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂，其特征在于：所用的菌种为乳杆菌属的嗜酸乳酸杆菌。

6.根据权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌活菌制剂，其特征在于：作为饲料添加剂应用于畜禽养殖。