CN103283595B - 一种草莓茎尖组织初代培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草莓茎尖组织初代培养方法，包括如下步骤：1）匍匐茎的采集：匍匐茎采集时间为4-7月，选取顶端处于未展叶和第一张展叶之间、生长健壮的匍匐茎；2）匍匐茎处理：将采集的匍匐茎清洗、消毒后，在3-8℃下低温处理，处理时间72小时；3）消毒与接种：消毒和接种均在超净工作台内进行。本发明的优点是：1）可以有效防止外植体褐变的产生，保证外植体成活达到90%以上；2）采用的培养基能使外植体组织直接形成芽体，防止变异的发生，保证了后代种性的纯度；3）可以有效控制外植体的直径小于0.5mm，保证了外植体是不带有病毒，其繁殖出的后代完全无毒化。

Description

一种草莓茎尖组织初代培养方法

技术领域

本发明涉及一种草莓茎尖组织初代培养方法。

背景技术

植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。该技术在快速繁殖珍稀植物或高经济价值的植物、植物体脱病毒和植物种质资源的保存等方面有广泛的应用前景。

草莓是无性繁殖植物，母体植株易产生匍匐茎，匍匐茎的节上能产生新的植株，繁殖出后代。但草莓容易受病毒侵染，感病母体的病毒会通过匍匐茎传染，使后代植株带毒，导致后代植株的产量和品质下降。利用草莓茎尖组织进行人工培养繁殖后代，可以有效防止病毒的传染，确保后代不带病毒。茎尖组织培养分初代培养、增殖培养，生根培养和驯化等4个步骤，其中初代培养是获得无病毒植株的重要步骤，也是草莓茎尖组织培养的关键技术。

草莓茎尖组织初代培养是指将草莓茎尖组织接种到特定的培养基上获得无病毒植株的过程，目前草莓茎尖初代培养中存在的问题是：

1、茎尖组织外植体（由活植物体上切取下来以进行培养的那部分茎尖组织）成活率低，接种难以成功。

2、  茎尖组织外植体诱导出的植株变异率高，不能保证品种的纯度。

3、  繁殖出的植株不能实现无病毒化。

发明内容

本发明的目的是提供一种草莓茎尖初代培养方法，该方法能使草莓茎尖顶端组织接种的外植体成活率达到90%以上，后代植株完全脱毒、无变异发生。

申请人经研究发现：

1、草莓茎尖组织接种后外植体发生褐变是导致成活率低主要原因。经申请人大量的

研究和实验，发现接种前将匍匐茎在5-8℃下处理72h和接种后暗培养72h，可以降低褐变的发生，外植体的成活率可以提高到90%以上。

2、草莓茎尖初代培养时变异的发生与芽的形成途径密切相关。外植体组织形成芽体的途径有两种，一是：接种后的外植体组织先脱分化形成愈伤组织，然后由愈伤组织分化形成芽；二是：外植体组织直接形成芽；前者会产生变异，后者无变异产生。要实现无变异产生，关键在于培养基。申请人经过大量的研究和实验，研制了一种效果很好的培养基：MS + NAA（0.1-0.3mg/L）+BA（0.2 -0.5mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（8%）pH为5.8-6.0，该培养基可以使外植体组织直接形成芽，防止变异的发生，保证了芽体种性的纯度

3、初代培养形成的芽体脱毒率的高低受接种外植体大小的影响，外植体小于0.5mm才能达到完全脱毒的效果。

基于上述研究，本发明通过低温处理，暗培养的方法来防止外植体组织褐变；通过采用将外植体接种在特定的培养基上，使其直接发育成芽的方法来防止变异的发生；通过控制外植体的大小来提高脱毒率，其具体技术方案如下：

1、一种草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于包括如下步骤：

1）匍匐茎的采集：匍匐茎采集时间为4-7月，选取顶端处于未展叶和第一张展叶之间、生长健壮的匍匐茎；

2）匍匐茎处理：将采集的匍匐茎清洗、消毒后，在3-8℃下低温处理，处理时间72小时；

3）消毒与接种：消毒和接种均在超净工作台内进行，具体如下：

3.1消毒：

3.1.1将上述处理的匍匐茎，从顶部开始剪取5-8cm。

3.1.2用75%的酒精消毒15-20秒；

3.1.3有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液，消毒5-10分钟；

3.1.4灭菌水清洗后，备用；

3.2接种：

3.2.1外植体的摘取：在解剖镜下由外向内依次剥除生长点***包裹的叶片，直到生长点暴露。

3.2.2用解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到培养基中：

培养：接种好的外植体在20℃下，暗下培养72小时，然后再放置于光下培养，培养条件25℃，2000lx，16hr ；培养10-15d形成芽体，20-30d展叶、生根，50-60d植株大小为3-5cm时，完成初代培养；所述培养基的组成是：MS +NAA（0.1-0.3mg/L）+BA（0.2 -0.5mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（8%），pH为5.8-6.0；

步骤1）中，为了保证品种的纯度，匍匐茎采集要在品种园中进行，匍匐茎的采集长度为10-15cm，以确保匍匐茎的质量。

步骤2）中的消毒是用400倍84消毒液浸泡匍匐茎10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-

15分钟，前述400倍是指用水按400：1的体积比稀释84消毒液。

步骤3）中从头部剪取匍匐茎5-8cm的原因是便于消毒接种时操作方便；

步骤3）中用灭菌水清洗3-5次。

步骤3）中所述解剖镜的放大倍数为10-40x，以便于清晰观察生长点，方便取样。

步骤3）中，为保证外植体大小﹤0.5mm，所述解剖针针粗度为Φ=0.2-0.4mm，操作时以此为对比，针尖所取生长点组织不超过针的粗度。

步骤3）中，所述初代培养时培养容器为试管Φ=2.5cm，每管培养基加入量为20-25ml。

本发明具有如下优点：

1、接种前低温处理匍匐茎，接种后进行暗培养，可以有效防止外植体褐变的产生，保证外植体成活达到90%以上。

2、采用的培养基能使外植体组织直接形成芽体，防止变异的发生，保证了后代种性的纯度。

3、采用粗度Φ=0.2-0.4mm的解剖针，取样时以此为对照，可以有效控制外植体的直径小于0.5mm，保证了外植体是不带有病毒，其繁殖出的后代完全无毒化。

具体实施方式

1、匍匐茎的采集：为了保证品种的纯度匍匐茎采集要在品种园中进行，匍匐茎采集时间为4-7月，选取顶端处于未展叶和第一张展叶之间、生长健壮的匍匐茎，采集长度10-15cm。

2、匍匐茎处理：将采集的匍匐茎用自来冲洗15-20分钟后，用400倍84消毒液浸泡10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-15分钟，放入保鲜袋中，将保鲜袋密封后放入5-8℃的冰箱中低温处理，处理时间72小时。

3、消毒与接种：消毒和接种均在超净工作台内进行

    3.1消毒：

3.1.1将上述处理的匍匐茎，从顶部开始剪取5-8cm。

3.1.2用75%的酒精消毒15-20秒；

3.1.3有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液，消毒5-15分钟

3.1.4灭菌水清洗3-5次后备用。

3.2接种：

3.2.1外植体的摘取：在10-40x解剖镜下由外向内依次剥除生长点***包裹的叶片，

直到生长点暴露。

3.2.2 用针粗度Φ为0.2-0.4mm的解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到培养基中，操作时以解剖针为对比，针尖所取生长点组织不超过针的粗度：

培养：接种好的外植体在20℃下，暗下培养72小时，然后再放置于光下培养，培养条件25℃，2000lx，16hr ；培养10-15d形成芽体，20-30d展叶、生根，50-60d植株大小为3-5cm时，完成初代培养；所述培养基的组成是：MS +NAA（0.1-0.3mg/L）+BA（0.2 -0.5mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（8%），pH为5.8-6.0；初代培养时培养容器为试管Φ=2.5cm，每管培养基加入量为20-25ml。

应用例1

草莓品种：“丰香”

将感染病毒病植株的匍匐茎，采用本发明所述方法接种培养后，接种外植体的存活率为97.5%。采用多重RT-PCR检测方法检测病毒，结果表明草莓斑驳病毒（SMOV）、草莓黄边病毒（SMYEV）, 草莓皱缩病毒,（SCV）,草莓镶脉病毒(SVBV)病毒等4种危害草莓的毒病毒检测结果均为阴性，与接种前植株比较脱毒率为100%。繁殖出种苗在扬州、镇江、连云港、宿迁等地试验种植的结果，表现出种性纯，开花、结果均匀一致，无变异植株产生，与当地常规繁殖的苗相比，产量提高50-60%。

应用例2

草莓品种：“红颊”

分别采集两个品种感染病毒病植株的匍匐茎，外植体的存活率均为100%。采用多重RT-PCR检测方法检测病毒，结果表明草莓斑驳病毒（SMOV）、草莓黄边病毒（SMYEV）, 草莓皱缩病毒,（SCV）,草莓镶脉病毒(SVBV)病毒等4种危害草莓的毒病毒检测结果均为阴性，与接种前植株比较脱毒率为100%。种苗在江苏的10多个市县及陕西、北京、上海、山东、安徽、内蒙古等地试验种植，结果表明：各地均无变异发生，开花、结果均匀一致，与当地常规繁殖的苗相比，产量增加分别为江苏35-65%、陕西50-7-%、北京50-70%、上海40-50%、山东50-60%、安徽40-70%、内蒙古50-70% 。

Claims (6)

1.一种草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于包括如下步骤：

1)匍匐茎的采集：匍匐茎采集时间为4-7月，选取顶端处于未展叶和第一张展叶之间、生长健壮的匍匐茎；

2)匍匐茎处理：将采集的匍匐茎清洗、消毒后，在3-8℃下低温处理，处理时间72小时；

3)消毒与接种：消毒和接种均在超净工作台内进行，具体如下：

3.1消毒：

3.1.1将上述处理的匍匐茎，从顶部开始剪取5-8cm；

3.1.2用75％的酒精消毒15-20秒；

3.1.3有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液，消毒5-10分钟；

3.1.4灭菌水清洗后，备用；

3.2接种：

3.2.1外植体的摘取：在解剖镜下由外向内依次剥除生长点***包裹的叶片，直到生长点暴露；

3.2.2用解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到培养基中，接种到培养基中的外植体的直径小于0.5mm；

培养：接种好的外植体在20℃下，暗下培养72小时，然后再放置于光下培养，培养条件25℃，2000lx，光周期为16小时光照8小时黑暗；培养10-15d形成芽体，20-30d展叶、生根，50-60d植株大小为3-5cm时，完成初代培养；所述培养基的组成是：MS+NAA0.1-0.3mg/L+BA0.2-0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂8％，pH为5.8-6.0；

所述解剖针针粗度Φ为0.2-0.4mm，针尖所取生长点组织不超过针的粗度。

2.如权利要求1所述草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于：步骤1)中匍匐茎的采集长度为10-15cm。

3.如权利要求1所述草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于：步骤2)中的消毒是用400倍84消毒液浸泡匍匐茎10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-15分钟，前述400倍是指用水按400：1的体积比稀释84消毒液。

4.如权利要求1所述草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于：步骤3)中用灭菌水清洗3-5次。

5.如权利要求1所述草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于：步骤3)中，所述解剖镜的放大倍数为10-40x。

6.如权利要求1所述草莓茎尖组织初代培养方法，其特征在于：步骤3)中，所述初代培养时培养容器为Φ＝2.5cm的试管，每管培养基加入量为20-25ml。