CN103282372A - 用于特异性裂解细胞中的外源rna的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于仅在内源性信号RNA序列的存在下裂解外源目的RNA，从而仅在所述内源性信号RNA序列的存在下激活目的多核苷酸表达的组合物。提供了用于制备所述组合物的方法及其例如通过仅在特定靶细胞群中激活毒素表达在治疗和诊断多种病症和疾患中的用途。

Description

用于特异性裂解细胞中的外源RNA的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于仅在内源性信号RNA序列的存在下裂解外源目的RNA，从而仅在内源性信号RNA序列的存在下激活目的多核苷酸表达的组合物。如通过仅选择性激活毒素在靶细胞群中的表达所例示的，本发明还涉及这些组合物在治疗和诊断各种病症和疾患中的用途。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是其中由与靶基因的特定区域同源的有义RNA和反义RNA构成的dsRNA实现所述靶基因的转录物的同源区域裂解，从而抑制基因表达的一种现象。在哺乳动物中，dsRNA应短于31个碱基对以避免引发可通过凋亡导致细胞死亡的干扰素反应。RNAi技术基于利用微小RNA(miRNA)调控转录后基因表达的天然机制[1]。miRNA是长度约21个核苷酸的非常小的RNA分子，其似乎衍生自形成预定的RNA茎-环结构的70-90个核苷酸的前体。miRNA在不同的生物体如线虫、果蝇、人和植物中表达。
在哺乳动物中，miRNA通常由RNA聚合酶II转录且所得的初级转录物(初级-miRNA)包含被Drosha-DGCR8复合物裂解的局部茎-环结构。该裂解的产物是一种或多种(在簇集的情形下)前体miRNA(前-miRNA)。前-miRNA通常长70-90个核苷酸，具有牢固的茎-环结构，且其通常在3′端包含2个核苷酸的突出端[2]。前-miRNA通过输出蛋白-5输出到细胞质中。在细胞质中，为RNA酶III家族的核糖核酸内切酶的Dicer酶将前-miRNA中的茎识别为dsRNA并从前-miRNA的3′和5′端裂解和释放21bp的dsRNA(miRNA双链体)。Dicer-TRBP复合物将双链体的两条链彼此分离且具有热动力学上较弱的5′端的链被掺入到RNA诱导性沉默复合物(RISC)中[3]。该链是成熟的miRNA。未被掺入到RISC中的相对链称为miRNA*链并且其被降解[1]。成熟miRNA将RISC引导到mRNA内的靶位点。如果靶位点与成熟miRNA几乎完全互补的话，则该mRNA将在位于靶位点的3′端上游约10个核苷酸处的位置被裂解[3]。在裂解后，RISC-成熟miRNA链复合物被回收用于另一轮的活性[4]。如果靶位点与成熟miRNA具有较低的互补性，则mRNA将不在靶位点被裂解但是该mRNA的翻译将被抑制。虽然迄今在人类中已鉴定到约530种miRNA，但是估计脊椎动物的基因组编码多达1,000种不同的miRNA，预测这些miRNA调节这些基因中的至少30％的表达[5]。参见图1。
被哺乳动物细胞中的RISC-成熟miRNA链复合物裂解的mRNA的两个部分可通过Northern分析容易地检测[6]。在哺乳动物细胞中，在5′端具有长度约19个核苷酸的互补区域的长度约23个核苷酸的两种RNA转录物彼此杂交并能够指导靶特异性RNA干扰[7]。例如，US7,078,196和US7,055,704公开了调节靶特异性核酸修饰例如RNA干扰和/或DNA甲基化所需要的双链(ds)RNA分子的序列和结构特征。在一个3′端还包含20个核苷酸长的ssRNA的52个核苷酸长的dsRNA仅在平端时是Dicer的底物[8]。在哺乳动物中，Risc被偶联到Dicer[9]。虽然RNA聚合酶IIIU6启动子是用于转录小RNA(sRNA)的非常强的启动子，但是RNA聚合酶II的CMV启动子是用于转录蛋白质编码基因的强的启动子。
在哺乳动物细胞中，向mRNA的5′端添加帽子(7-甲基鸟苷帽子)使mRNA翻译增加到35-50倍。另外，向mRNA的3′端添加多聚(A)尾巴使mRNA翻译增加到114-155倍[10]。在哺乳动物细胞中，多聚(A)尾巴使功能性mRNA半衰期增加到2.6倍而帽子使功能性mRNA半衰期增加到1.7倍[10]。人HIST1H2AC(H2ac)基因编码组蛋白H2A家族的一个成员。来自该基因的转录物缺乏聚(A)尾巴，而是替代地包含回文终止元件(5′-GGCUCUUUUCAGAGCC-3′)，回文终止元件在mRNA加工和稳定性方面起重要作用的3′-UTR处形成保守的茎-环结构[11]。
核糖体灭活蛋白(RIP)是植物或微生物来源的蛋白质毒素。RIP通过使核糖体失活抑制蛋白质合成。最近的研究表明RIP还能够通过凋亡诱导细胞死亡。II型RIP包含通过二硫键连接在一起的毒素A链和凝集素样亚基(B链)。B链在催化上无活性，而是用来调节A-B蛋白质复合物进入细胞溶胶。蓖麻毒素、相思豆毒素和白喉毒素是非常强效的II型RIP。已经报道到达细胞溶胶的单个分子的蓖麻毒素或相思豆毒素可杀死该细胞[12，13]。另外，引入到细胞中的单个分子的白喉毒素片段A可杀死该细胞[14]。
根据WHO(世界卫生组织)，在2006年，全世界有约3950万人患HIV。许多病毒包括HIV显示出不进行蛋白质合成的休眠期或潜伏期。在这些阶段期间，病毒感染对于免疫***基本上是不可见的。目前的抗病毒治疗方案在消除潜伏病毒的细胞存库方面大部分是无效的[15]。由于其基因组中的癌基因，病毒可以是致癌的。由于在将基因截短或将基因置于强的病毒顺式作用调控元件的控制之下的位点处的整合，逆转录病毒也可能是致癌的。
根据美国癌症协会，在2007年期间，760万人死于癌症。癌症治疗的本质和基本方法不断地变化。癌症治疗的某些方法例如放射治疗、手术和抑制血管生成对于许多小的转移灶是无用的。癌症治疗的其他方法例如抑制细胞***以及破坏正在***的细胞没有特异性且因此可导致甚至可杀死患者的有害副作用。例如介导肿瘤组织分化、抑制癌基因、包含针对癌细胞所特有的膜受体蛋白的配体的病毒、操纵免疫***和免疫毒素治疗的癌症治疗的另外的方法，具有窄的治疗指数且通常不是足够有效的。使用肿瘤抑制基因和使用在癌细胞中被独特地激活的启动子下的毒素的治疗癌症的其他方法具有狭窄的治疗指数、大的导致有害副作用的可能性并且通常是不足够有效的。
导致癌症的许多病毒能够引起潜伏感染。KSHV(卡波西肉瘤相关的单纯疱疹病毒)导致卡波西肉瘤癌症；SV40(猿猴空泡病毒40)具有导致肿瘤的可能性，但是最经常地以潜伏感染存在；且EBV(爱波斯坦巴尔病毒)导致伯基特淋巴瘤、鼻咽癌和EBV-相关的胃癌。
平均地，每种肿瘤包含约90种蛋白质编码基因中的突变[16]。每种肿瘤都来源于单个的生成细胞[38]。最可能的是，这些突变基因中的至少一种被转录成mRNA。因此，极为可能的是，特定肿瘤的每个细胞或被特定病毒感染的每个细胞包括RNA分子，所述RNA分子包含突变或感染的细胞所特有的特定RNA序列(信号序列)并且所述RNA分子在同一生物体的其他正常细胞中不存在。信号序列可来自病毒来源或来自特定肿瘤所特有的突变基因。
已开发了鉴定特定肿瘤所特有的任何特定序列的多种方法。这些方法包括例如，DNA微阵列、Tilling(靶向诱导的基因组中的局部损伤)和癌症基因组的大规模测序。此外，由于2005年12月13日发起并已将造成癌症的所有基因突变编成目录的癌症基因组Atlas(由NIH进行)，这一信号序列的鉴定被预测为甚至更为简单。
已提出用于仅选择性杀死包含特定信号序列的那些细胞的组合物。由Intronn Company开发的一种方法是构建失活的毒素，该失活的毒素通过该失活的毒素和信号序列之间的反式剪接被活化[17、18和19]。然而，这种方法具有多个固有的问题：第一个问题是包含信号序列的RNA分子必须以非常高的拷贝数存在于细胞中，因为反式剪接事件是非常少见的。第二个问题是在大多数情况下，该方法不适合于癌症来源的信号序列，因为在癌症中，突变在短的区域内蔓延。第三个问题是反式剪接事件还可随机发生且因此可导致有害的副作用。第四个问题是包含信号分子的RNA分子必须在一个极为特定的位点包含内含子。赢得2004年世界技术奖生物技术奖项(2004World Technology Award in Biotechnology)的另一种方法提出使用小的dsDNA、ssDNA、发夹DNA和限制性酶，然而该方法仅可在非常独特条件下的细胞提取物中而不是在活细胞的生理条件下发挥作用[20]。例如，如在WO07/00068中公开的其他方法涉及包含miRNA序列靶的基因载体及其阻止或减少包含相应miRNA的细胞中的转基因表达的用途。例如，WO2010/055413中还公开了适于在外周器官的细胞中暂时表达转基因的基因载体，该基因载体包含可操作连接到转基因的调控序列，其中该调节序列防止或减少所述转基因在造血谱系细胞中的表达。
因此存在开发能够仅选择性地杀死包含信号序列的细胞的新型组合物的需要，其中这些组合物与现有技术中使用的组合物相比应是强效、可靠且特异的。由于这些组合物的开发会是一项非常复杂的多步骤的过程，所以还需要开发用于仅在信号序列的存在下激活细胞中的目的基因的组合物和用于仅在信号序列的存在下裂解外源目的RNA的组合物。
发明概述
本发明提供了用于响应于细胞中内源性信号RNA序列的存在而选择性裂解外源目的RNA的组合物和方法。外源目的RNA由所述组合物编码。内源性信号RNA是包含为18-25个核苷酸长的序列的预定信号序列的RNA分子。在内源性信号序列的存在下特异性裂解外源RNA之后，可激活目的多核苷酸的转录。被激活的多核苷酸可编码毒素，从而提供选择性杀死靶细胞群的工具。
本发明的组合物包含或编码：
(a)外源目的RNA，其为包含与预定信号序列具有足够的互补性的特定序列的RNA序列。
(b)功能性RNA，其能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′或3′端裂解；和
(c)载体RNA(carrier RNA)，其为能够结合在预定信号序列的末端包含预定信号序列的裂解的信号RNA部分的RNA分子，这种方式使得所形成的RNA双链体长14-31个核苷酸且其包含0-5个核苷酸的3′或5′突出端，其中RNA双链体是Dicer的底物。
因此，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性RNA实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′或3′端的裂解，并且然后载体RNA与在预定信号序列的末端包含预定信号序列的被裂解的信号RNA部分结合，并指导Dicer和Risc加工预定信号序列，并且然后，Risc-信号序列复合物指导外源目的RNA在特定靶/裂解位点的裂解。
Dicer或Risc加工可涉及另外的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，载体RNA还可由第二外源RNA分子产生。所述预定信号序列可选自，但不限于：病毒RNA序列和赘生性细胞特有的序列。功能性RNA可选自，但不限于：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、核酶或类似的RNA。在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物还可包含或编码能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的与被第一功能性RNA裂解的末端相反的末端被裂解的另一种功能性RNA。在特定实施方案中，所述组合物编码的载体RNA可由基于聚合酶I的启动子或基于聚合酶III的启动子驱动。
在本发明的一个实施方案中，外源目的RNA还可包含：
(a)编码外源目的蛋白的序列；和
(b)能够抑制该外源目的蛋白表达的抑制序列；
其中特定靶/裂解位点位于抑制序列和编码外源目的蛋白的序列之间，其中，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，外源目的RNA可被转录并在特定裂解位点/靶位点被裂解，致使抑制序列与编码外源目的蛋白的序列分离并且外源目的蛋白能够被表达。
外源目的蛋白可选自，但不限于：蛋白质毒素蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素，包含蛋白质毒素的融合蛋白及类似的蛋白，或其组合。这些中的任何一种的单个分子足以杀死表达这些分子中的任何一种的细胞。抑制序列可位于特定靶/裂解位点的下游或上游。位于特定靶/裂解位点上游的抑制序列可以是例如但不限于多个起始密码子(initiation codon)，其中每个起始密码子位于Kozak共有序列或任何其他翻译起始基序内，其中每个起始密码子和编码目的蛋白的序列不在同一读码框内。因此在裂解之前，这些起始密码子将导致对目的蛋白的表达的抑制。
在其他实施方案中，预定信号序列可位于内源性信号RNA的5′或3′端，并且所述组合物不一定编码功能性RNA。
根据某些实施方案，所述组合物的组分可由相同或不同的多核苷酸分子编码。在某些实施方案中，所述组合物的一种或多种组分可在同一RNA分子上。
在另外的特定实施方案中，本发明提供了用于仅在细胞中存在内源性信号RNA时表达外源目的蛋白的组合物，外源目的蛋白由所述组合物编码，内源性信号RNA是包含预定信号序列的RNA分子，所述预定信号序列是长度为至少18个核苷酸的预定序列且所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端；和
(b)编码主要由下列组成的外源目的RNA分子的多核苷酸序列：
(1)第一序列，其具有与边缘序列杂交的足够的互补性，边缘序列位于预定裂解位点上游0-5个核苷酸处并向上游延伸到信号RNA中，其中所述第一序列包含一个或多个起始密码子，其中每个起始密码子主要由5′-AUG-3′组成；和
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的预定序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；且
其中，所述外源目的RNA分子包含编码外源目的蛋白的序列，该序列在所述外源目的RNA分子的5′端下游的至少21个核苷酸处；其中在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，功能性RNA直接或间接地实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端的裂解且从而外源目的RNA分子与裂解的内源性信号RNA处的边缘序列杂交且可将预定信号序列定向到Dicer加工，Dicer加工可裂解外源目的RNA分子，其中每一个起始密码子与编码外源目的蛋白的序列分离且外源目的蛋白能够被表达。
在另一个实施方案中，边缘序列可以是25-30个核苷酸的长度且可位于预定裂解位点上游的2个核苷酸处并向上游延伸到内源性信号RNA中，其中所述第二序列是0个核苷酸的长度。在本发明的又一个实施方案中，每个起始密码子可位于外源目的RNA分子的5′端下游的0-21个核苷酸处，其中每个起始密码子和编码外源目的蛋白的序列不在同一读码框内。在本发明另外的实施方案中，至少一个起始密码子可位于Kozak共有序列或任何其他反应起始基序/元件内。功能性RNA可选自，但不限于：微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和/或核酶。外源目的蛋白可以是例如但不限于白喉毒素A链、RIP蛋白和任何其他蛋白质毒素。
根据某些实施方案，本发明的组合物可用于各种方法和应用中，例如，诸如，但不限于：调控基因表达、靶向细胞死亡、治疗疾病或病症包括，例如增生性疾患(例如癌症)、传染病及类似疾病、诊断疾病或疾患、转基因生物体的形成、***式基因治疗及类似的治疗。
根据某些实施方案，提供了包含用于指导外源目的RNA在特定靶位点的特异性裂解的一种或多种多核苷酸的组合物，所述裂解仅发生在细胞中存在内源性信号RNA时，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的任何预定序列，其中将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中指导所述外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点处的裂解，所述特定序列具有与预定信号序列杂交的足够的互补性。
在某些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸可包含编码所述外源目的RNA的第一多核苷酸序列；编码能够介导内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的第二多核苷酸序列；以及编码载体RNA的第三多核苷酸序列。
在某些实施方案中，载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；以及所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度是0-7000个核苷酸；且所述预定裂解位点是预定信号序列的5′端。在某些实施方案中，边缘序列为23-28个核苷酸长且位于从所述预定裂解位点开始至下游约23-28个核苷酸处，其中所述第二序列的长度为2个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
在某些实施方案中，载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；以及所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度是0-7000个核苷酸；且所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端。在某些实施方案中，边缘序列为25-30个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游2个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中，其中所述第二序列的长度为0个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
在某些实施方案中，载体RNA可从包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列(carrier sequence)的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；以及所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度是0-7000个核苷酸；其中所述多核苷酸序列在细胞内在为所述载体序列的3′端的载体裂解位点处被裂解；其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现；且其中所述预定裂解位点是所述预定信号序列的5′端。
在另外的实施方案中，载体RNA可从包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；以及所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度是0-7000个核苷酸；其中所述多核苷酸序列在细胞内在为所述载体序列的5′端的载体裂解位点处被裂解；在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现；且所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端。
根据某些实施方案，所述内源性信号RNA是细胞的mRNA、病毒RNA或二者。在另外的实施方案中，预定信号序列是赘生性细胞、病毒感染的细胞或二者所特有的。
根据某些实施方案，足够的互补性为至少30％的互补性。在另外的实施方案中，足够的互补性为至少90％。
根据某些实施方案，所述一种或多种多核苷酸可包含一种或多种DNA分子，一种或多种RNA分子或其组合。
在某些实施方案中，功能性RNA可选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶。
根据另外的实施方案，外源目的RNA还可包含编码外源目的蛋白的序列；和能够抑制外源目的蛋白表达的抑制序列；其中特定靶位点位于抑制序列和编码外源目的蛋白的序列之间，其中在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，外源目的RNA被转录并在特定靶位点被裂解，其中抑制序列与编码外源目的蛋白的序列分离且外源目的蛋白能够被表达。
在某些实施方案中，所述外源目的蛋白是毒素。在某些实施方案中，外源目的蛋白选自由下列组成的组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素的A链以及其修饰形式。在另外的实施方案中，外源目的蛋白选自由下列组成的组：α毒素、皂草素、玉蜀黍RIP(maize RIP)、大麦RIP、小麦RIP、玉米RIP(corn RIP)、黑麦RIP、亚麻RIP、志贺毒素、志贺样RIP、木鳖子甙、胸苷激酶、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌(Escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶及其修饰形式。
根据另外的实施方案，外源目的RNA序列中的抑制序列位于特定靶位点上游。在某些实施方案中，抑制序列包含一个或多个起始密码子，其中每一个起始密码子和编码外源目的蛋白的序列不在同一读码框内，且其中所述抑制序列直接或间接地降低所述外源目的蛋白的翻译效率。在某些实施方案中，所述一个或多个起始密码子主要由5′-AUG-3′组成。
在另外的实施方案中，外源RNA分子还可包含位于所述起始密码子和所述编码目的蛋白的序列的起译密码子(start codon)之间的终止密码子，其中所述终止密码子和所述起始密码子在同一读码框内。所述种子密码子可选自由下列组成的组：5′-UAA-3′，5′-UAG-3′和5′-UGA-3′。
根据另外的实施方案，抑制序列还可包含起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子处于同一读码框内，且其中所述核苷酸序列编码用于亚细胞定位的分选信号。亚细胞位置可选自由下列组成的组：线粒体、核、内体、溶酶体、过氧化物酶体和内质网(ER)。
根据另外的实施方案，抑制序列还可包含起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子处于同一读码框内，且其中所述核苷酸序列编码蛋白降解信号。
根据另外的实施方案，抑制序列还可包含起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和起始密码子处于同一读码框内；其中所述核苷酸序列和所述编码外源目的蛋白的序列处于同一读码框内；且其中所述核苷酸序列编码氨基酸序列；其中当所述氨基酸序列被融合到外源目的蛋白时，所述外源目的蛋白的生物学功能被抑制。
根据另外的实施方案，目的RNA还可包含起始密码子下游的终止密码子，其中终止密码子和起始密码子处于同一读码框内且其中外源目的RNA还包含终止密码子下游的内含子，其中外源目的RNA是无义介导的衰变(nonsense-mediated decay，NMD)的靶。
在另外的实施方案中，抑制序列可位于编码外源目的蛋白的序列的下游，且抑制序列包含用于亚细胞定位的RNA定位信号或内源性miRNA结合位点。
在某些实施方案中，抑制序列可位于编码外源目的蛋白的序列的上游，其中所述抑制序列能够形成具有低于-30kcal/mol的折叠自由能的二级结构，其中所述二级结构足以阻碍核糖体扫描到达所述外源目的蛋白的起译密码子。
在某些实施方案中，外源目的RNA还包含特定裂解位点下游和编码外源目的蛋白的序列上游的内部核糖体进入位点(IRES)序列，其中IRES序列在被裂解的外源目的RNA内比在完整的外源目的RNA内功能更强。
在某些实施方案中，外源目的RNA可包含紧邻编码外源目的蛋白的序列上游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率的内部核糖体进入位点(IRES)序列。
在某些实施方案中，目的RNA可还包含紧邻所述编码外源目的蛋白的序列下游定位的含有细胞质多聚腺苷酸化元件的核苷酸序列，其中所述细胞质多聚腺苷酸化元件增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
根据某些实施方案，所述组合物还可包含编码另外的RNA分子的另外的多核苷酸序列，所述另外的RNA分子在3′端包含能够结合位于所述特定靶位点上游和编码外源目的蛋白的序列下游的序列的核苷酸序列，其中所述另外的RNA分子直接或间接地增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
根据某些实施方案，所述组合物还可包含编码裂解组件的另外的多核苷酸序列，所述裂解组件能够实现所述外源目的RNA在位于抑制序列上游的位置处的裂解，其中所述裂解组件选自由下列组成的组：a)位于所述外源目的RNA内的核酸序列，其中所述核酸序列选自由下列组成的组：a)核酸内切酶识别位点，内源性miRNA结合位点。顺式作用型核酶和miRNA序列，其中所述核酸序列直接或间接地降低外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率；和b)抑制性RNA，其中所述抑制性RNA选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶；其中所述抑制性RNA直接或间接地降低所述外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
在另外的实施方案中，所述特定序列是多个特定序列，且所述特定靶位点是多个特定靶位点。
在某些实施方案中，外源目的RNA和功能性RNA能够位于相同或不同的多核苷酸分子上。在某些实施方案中，外源目的RNA、功能性RNA和功能性核酸能够位于一种或多种多核苷酸分子上。
根据另外的实施方案，所述组合物的一种或多种多核苷酸序列可被整合到细胞的基因组中。
在某些实施方案中，所述细胞可选自由下列组成的组：人细胞、动物细胞、培养的细胞和植物细胞。在某些实施方案中，所述细胞可存在于生物体中。
根据某些实施方案，还提供了包含用于指导外源目的蛋白在细胞中特异性表达的一种或多种多核苷酸的组合物，其中所述外源目的蛋白仅在细胞中存在内源性信号RNA时表达，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的任何预定序列，其中将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点处的裂解，所述特定序列具有与预定信号序列杂交的足够的互补性，其中仅在所述外源目的RNA在所述细胞中裂解后，由所述裂解的外源目的RNA编码的外源目的蛋白能够在细胞内表达。在某些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸包括编码所述外源目的RNA的第一多核苷酸序列；编码能够介导内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的第二多核苷酸序列；以及编码载体RNA的第三多核苷酸序列。
根据某些实施方案，提供了用于杀死特定细胞群的方法，所述特定细胞群包含内源性信号RNA，所述方法包括：将包含用于指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点处裂解的一种或多种多核苷酸的组合物引入到细胞中，所述特定序列具有与内源性信号RNA杂交的足够的互补性，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的任何预定序列；且其中所述外源目的RNA在所述细胞内的裂解促进能够杀死所述细胞群的外源目的蛋白的表达。所述一种或多种多核苷酸包含：编码所述外源目的RNA的第一多核苷酸序列；编码能够介导内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的第二多核苷酸序列；以及编码载体RNA的第三多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述内源性信号RNA是细胞的mRNA、病毒RNA或二者。所述细胞群可选自由下列组成的组：人细胞、动物细胞、培养的细胞和植物细胞。在某些实施方案中，所述细胞群是赘生性细胞群。在某些实施方案中，所述细胞群存在于生物体中。
从随后的说明中本发明的目的和优点将是明显的。
附图简述
通过示例的方式而不是限制性地提供了下列附图。
图1是微小RNA(miRNA)在细胞内的生物发生和活性的模型的常规方案。
图2是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的实例的示意图。在该示例性实施方案中，所述组合物编码：27个核苷酸的载体RNA；包含与内源性信号RNA的预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA；和为能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′端裂解的shRNA的功能性RNA。
图3是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的实例的示意图。在该实例中，本发明的组合物编码：27个核苷酸的载体RNA；包含与内源性信号RNA的预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA；和为能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端裂解的shRNA的功能性RNA。
图4是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的实例的示意图。在该实例中，本发明的组合物编码：包含与内源性信号RNA的预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA，为能够实现所述内源性信号RNA在预定信号序列的5′端裂解的shRNA的功能性RNA，长27个核苷酸的载体序列以及为能够实现载体RNA在载体序列的3′端裂解的顺式作用型核酶的功能性核酸。
图5是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的实例的示意图。在该实例中，本发明的组合物编码：包含与内源性信号RNA的预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA，为能够实现所述内源性信号RNA在预定信号序列的3′端裂解的shRNA的功能性RNA，长度为27个核苷酸的载体序列以及为能够实现载体RNA在载体序列的5′端裂解的顺式作用型核酶的功能性核酸。
图6A是示出了根据某些实施方案的能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′端裂解的抑制性RNA的实例的示意图。
图6B是示出了根据某些实施方案的能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端裂解的抑制性RNA的实例的示意图。
图7A是示出了根据某些实施方案的能够实现载体RNA在载体序列的3′端裂解的抑制性RNA的实例的示意图。
图7B是示出了根据某些实施方案的能够实现载体RNA在载体序列的5′端裂解的抑制性RNA的实例的示意图。
图8A是示出了根据某些实施方案的是可为Dicer底物的RNA双链体的抑制性RNA的实例的示意图。
图8B是示出了根据某些实施方案的是可为Dicer底物的RNA双链体的抑制性RNA的实例的示意图。
图9A是示出了根据某些实施方案的锤头状核酶(SEQ ID NO.89)的实例的示意图，所述锤头状核酶能够实现内源性信号RNA或载体RNA分别在预定裂解位点或在载体裂解位点的裂解。
图9B是示出了根据某些实施方案的发夹型核酶的实例的示意图，所述发夹型核酶能够实现实现内源性信号RNA或载体RNA分别在预定裂解位点或在载体裂解位点的裂解。示例性的发夹型核酶包括SEQ ID NO.90，其前面是与靶RNA互补的序列、四核苷酸AAGA(SEQ ID NO.114)以及(在核酶的5′端的)与靶RNA互补的另外的序列。
图10是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸是非常有效的顺式作用型锤头状核酶-snorbozyme(SEQ IDNO.91)[22]，其能够实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。
图11是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸是非常有效的顺式作用型锤头状核酶-N117(SEQ ID NO.92)[23]，其能够实现载体RNA(SEQ ID NO.93)在载体序列的5′端的裂解。
图12A是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸是核酸内切酶识别位点或内源性miRNA结合位点，其中所述功能性核酸能够实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。
图12B是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸是核酸内切酶识别位点或内源性miRNA结合位点，其中所述功能性核酸能够实现载体RNA在载体序列的5′端的裂解.
图12C是示出了根据某些实施方案的为miRNA序列的功能性核酸的实例的示意图，其中所述miRNA序列能够实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。
图12D是示出了根据某些实施方案的为miRNA序列的功能性核酸的实例的示意图，其中所述miRNA序列能够实现载体RNA在载体序列的5′端的裂解。
图13A是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸能够与载体序列形成茎环结构，其中所述茎环结构能够实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。
图13B是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸能够与载体序列形成茎环结构，其中所述茎环结构能够实现载体RNA在载体序列的5′端的裂解。
图14A是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸具有茎环结构，其中环包含载体序列，且其中当茎环结构被Drosha和Dicer加工时，载体序列与茎环结构分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，该功能性RNA随后能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图14B是示出了根据某些实施方案的功能性核酸的实例的示意图，所述功能性核酸具有茎环结构，其中环包含载体序列，且其中茎环结构的表达由基于聚合酶I或III的启动子驱动，且其中茎环结构被Dicer加工时，载体序列与茎环结构分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，该功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图15A是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列下游，且其中当双链区被Dicer加工时，载体序列与RNA双链体分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA并能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图15B是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列上游，且其中当双链区被Dicer加工时，载体序列与RNA双链体分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA并能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图16A是示出了根据某些实施方案的载体RNA的实例的示意图，所述载体RNA与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体RNA的5′端，且其中当双链区被Dicer加工时，位于载体序列的3′端的序列与RNA双链体分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图16B是示出了根据某些实施方案的载体RNA的实例的示意图，所述载体RNA与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体RNA的3′端，且其中当双链区被Dicer加工时，位于载体序列的5′端的序列与RNA双链体分离，且由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图17A是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列上游，且其中当双链区被Dicer加工时，由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图17B是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列下游，且其中当双链区被Dicer加工时，由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图18A是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性核酸位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列上游，且其中当双链区被Dicer加工时，由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图18B是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性核酸位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列下游，且其中当双链区被Dicer加工时，由此形成的siRNA双链体是功能性RNA，所述功能性RNA能够实现内源性信号RNA在预定裂解位点的裂解。
图19A是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性核酸以及与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列上游，且其中当双链区被Dicer加工时，所形成的siRNA双链体是功能性核酸和功能性RNA。
图19B是示出了根据某些实施方案的载体序列的实例的示意图，所述载体序列与功能性核酸以及与功能性RNA位于同一RNA双链体内，其中双链区位于载体序列下游，且使得当双链区被Dicer加工时，所形成的siRNA双链体是功能性核酸和功能性RNA。
图20A是示出了根据某些实施方案的载体RNA的实例的示意图，所述载体RNA包含载体序列下游的3个连续的载体序列，其中功能性核酸能够实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。
图20B是示出了根据某些实施方案的载体RNA的实例的示意图，所述载体RNA包含载体序列上游的3个连续的载体序列，其中功能性核酸能够实现载体RNA在载体序列的5′端的裂解。
图21A是示出了根据某些实施方案的组合物的多核苷酸分子的实例的示意图，除了裂解预定信号序列的5′端的功能性RNA，所述多核苷酸分子还转录裂解该裂解预定信号序列的3′端的另外的功能性RNA。
图21B是示出了根据某些实施方案的组合物的多核苷酸分子的实例的示意图，除了裂解预定信号序列的3′端的功能性RNA，所述多核苷酸分子还转录裂解该裂解预定信号序列的5′端的另外的功能性RNA。
图22A是示出了根据某些实施方案的通过其裂解被激活的外源目的RNA的图解结构的实例的示意图，其中特定序列位于抑制序列下游和编码外源目的蛋白的序列的上游。
图22B是示出了根据某些实施方案的通过其裂解被激活的外源目的RNA的图解结构的实例的示意图，其中特定序列位于抑制序列上游和编码外源目的蛋白的序列的下游。
图23A是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含不与编码外源目的蛋白的序列位于同一读码框的AUG。
图23B是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含不与编码外源目的蛋白的序列位于同一读码框内的Kozak共有序列(5′-ACCAUGG-3′-SEQ ID NO.25)。
图23C是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含不与编码外源目的蛋白的序列位于同一读码框的2个Kozak共有序列。
图24A是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含位于同一读码框内的AUG和下游的终止密码子。
图24B是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含AUG和下游的：用于亚细胞定位的分选信号或蛋白降解信号。
图24C是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含AUG和编码能够抑制下游目的蛋白的生物学功能的氨基酸的下游序列。
图24D是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含AUG、与AUG位于同一读码框的下游终止密码子和下游内含子，其中外源目的RNA分子是无义介导的衰变(NMD)的靶。
图25A是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含针对翻译阻遏物(translation repressor)的结合位点。
图25B是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含用于亚细胞定位的RNA定位信号。
图25C是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含为富含AU的元件或核酸内切酶识别位点的RNA不稳定元件(RNA destabilizingelement)。
图25D是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于外源目的RNA的特定靶/裂解位点的上游且包含二级结构。
图26是示出了根据某些实施方案的通过其裂解激活外源目的RNA的实例的示意图，其中抑制序列产生阻碍翻译的二级结构且其中所述裂解产生IRES(内部核糖体进入位点)。
图27A是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在5′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是IRES(内部核糖体进入位点)。
图27B是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在5′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是茎环结构。
图27C是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在5′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是细胞质多聚腺苷酸化元件。
图27D是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在5′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是能够彼此结合并且通过该结合迫使外源目的RNA形成环状结构的核苷酸序列，特别是当外源目的RNA在特定靶/裂解位点被裂解时。
图28A是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在5′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是由本发明的组合物编码的多肽，其中该多肽能够结合外源目的RNA的多聚A尾巴和本发明的外源目的RNA内的序列并通过该结合迫使外源目的RNA形成环状结构，特别是当外源目的RNA在特定靶/裂解位点被裂解时。
图28B是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可降低完整外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是去除完整外源目的RNA中的帽子结构的顺式作用型核酶。
图29A是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定靶/裂解位点下游且包含内含子，其中外源目的RNA是无义介导的衰变(NMD)的靶。
图29B是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定靶/裂解位点的下游且包含针对翻译阻遏物的结合位点。
图29C是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定靶/裂解位点的下游且包含用于亚细胞定位的RNA定位信号。
图29D是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定靶/裂解位点的下游且包含为富含AU的元件或核酸内切酶识别位点的RNA不稳定元件。
图29E是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定靶/裂解位点的下游且包含二级结构。
图30A是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于编码外源目的蛋白的序列的下游，其中所述抑制序列产生可阻碍翻译的二级结构。
图30B是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是IRES(内部核糖体进入位点)。
图30C是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是茎环结构。
图30D是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是细胞质多聚腺苷酸化元件。
图31A是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是能够彼此结合且因此迫使外源目的RNA形成环状结构的核苷酸序列，特别是当外源目的RNA在特定靶/裂解位点被裂解时。
图31B是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是由所述组合物编码的多肽，其中该多肽能够结合帽子和外源目的RNA内的序列并因此迫使外源目的RNA形成环状结构，特别是当外源目的RNA在特定靶/裂解位点被裂解时。
图31C是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可增加在3′端被裂解的外源RNA分子的翻译效率，其中所述另外的结构是由所述组合物编码并能够结合外源目的RNA并因此为其提供多聚-A尾巴的另外的RNA分子，特别是当外源RNA分子在特定靶/裂解位点被裂解时。
图31D是示出了根据某些实施方案的另外的结构的实例的示意图，所述另外的结构可降低完整外源目的RNA的翻译效率，其中所述另外的结构是去除完整外源目的RNA中的多聚A的顺式作用型核酶。
图32A是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的结构的实例的示意图，所述外源目的RNA包含2个特定序列，其中抑制序列位于特定靶/裂解位点的上游。
图32B是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的结构的实例的示意图，所述外源目的RNA包含2个特定序列，其中抑制序列位于特定靶/裂解位点的下游。
图32C是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的实例的示意图，所述外源目的RNA包含与预定信号序列互补的2个序列之间的编码外源目的蛋白的序列和2个抑制序列，一个在外源目的RNA的5′端，而另一个在3′端。
图33是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而表达外源目的蛋白的实例的示意图。所述组合物包括编码外源目的RNA分子的多核苷酸分子，所述外源目的RNA分子在5’端包含与预定信号序列且与预定信号序列上游的序列100％互补的27个核苷酸的第一序列，所述第一序列还包含不与编码外源目的蛋白的下游序列处于同一读码框内的5’-AUG-3’序列且所述组合物还编码为能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端裂解的shRNA的功能性RNA。
图34是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而表达外源目的蛋白的实例的示意图。所述组合物包括编码外源目的RNA分子的多核苷酸分子，所述外源目的RNA分子在5′端包含能够实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端裂解的miRNA，以及与预定信号序列并与预定信号序列上游的序列互补的27个核苷酸的第一序列，所述第一序列还包含不与编码外源目的蛋白的下游序列处于同一读码框内的5’-AUG-3’序列且其中5’-AUG-3’位于Kozak共有序列内。
图35是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在而表达外源目的蛋白的实例的示意图。所述组合物编码在5′端包含siRNA的第一链的外源目的RNA分子，其中组合物还通过基于聚合酶I或III的启动子转录siRNA的第二链。外源目的RNA分子的第一序列为27个核苷酸长且与预定信号序列和预定信号序列上游的序列互补，第一序列还包含不与编码外源目的蛋白的下游序列处于同一读码框内的5’-AUG-3’序列，其中5’-AUG-3’位于Kozak共有序列内。
图36A是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的实例的示意图，所述外源目的RNA在5′端包含顺式作用型核酶，所述顺式作用型核酶去除外源目的RNA中的帽子结构。该去除降低了完整的外源目的RNA分子中外源目的蛋白的翻译效率。
图36B是示出了示例性外源目的RNA的示意图，所述外源目的RNA包含能够彼此结合且通过该结合迫使外源目的RNA形成环状结构的两个核苷酸序列，所述环状结构增加外源目的蛋白的翻译效率，尤其是在裂解的目的RNA中。
图37A是示出了根据某些实施方案的响应于细胞中内源性信号RNA的存在裂解外源目的RNA的实例的示意图。所述组合物编码：27个核苷酸的载体RNA和包含与预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA。
图37B是示出了根据某些实施方案的在细胞中存在内源性信号RNA时裂解外源目的RNA的实例的示意图。所述组合物编码：包含与预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA；长27个核苷酸的载体序列和为能够实现载体RNA序列在载体序列的3′端的裂解的顺式作用型核酶的功能性核酸。
图38A是示出了根据某些实施方案的在细胞中存在内源性信号RNA时裂解外源目的RNA的实例的示意图。本发明的组合物编码：27个核苷酸的载体RNA和包含与预定信号序列互补的特定序列的外源目的RNA。
图38B是示出了根据某些实施方案的在细胞中存在内源性信号RNA时裂解外源目的RNA的实例的示意图。所述组合物编码：包括与预定信号序列100％互补的特定序列的外源目的RNA；长27个核苷酸的载体序列和为能够实现载体RNA序列在载体序列的5′端的裂解的顺式作用型核酶的功能性核酸。
图39A是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的实例的示意图，所述外源目的RNA具有位于特定靶/裂解位点的下游的抑制序列且抑制序列能够抑制用于亚细胞定位的RNA定位信号的功能。
图39B是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的实例的示意图，所述外源目的RNA具有位于特定靶/裂解位点的上游的抑制序列且抑制序列能够抑制用于亚细胞定位的RNA定位信号的功能。
图39C是示出了根据某些实施方案的外源目的RNA的实例的示意图，所述外源目的RNA具有位于特定靶/裂解位点的上游的抑制序列且包含AUG和编码能够抑制外源目的蛋白的用于亚细胞定位的分选信号的功能的氨基酸的下游序列，所述分选信号由外源目的蛋白编码。
图39D是示出了根据某些实施方案的抑制序列的实例的示意图，所述抑制序列位于特定序列的下游，其中外源目的RNA在编码外源目的蛋白的序列的起译密码子下游不包含终止密码子，且其中抑制序列编码能够抑制上游编码的肽序列的裂解的氨基酸序列，其中所述肽序列能够被哺乳动物细胞中的蛋白酶裂解。
图40是示出了根据某些实施方案的使用本发明的组合物杀死特定患者的癌细胞的实例的示意图。
图41是示出了根据某些实施方案的使用本发明的组合物杀死伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌的癌细胞的实例的示意图，这些癌细胞通过使用LMP1mRNA作为内源性信号RNA而被EBV感染。
图42是示出了根据某些实施方案的使用本发明的组合物杀死HIV-1感染细胞的实例的示意图。
图43是示出了根据某些实施方案的使用本发明的组合物杀死HSV-1感染细胞的实例的示意图。
图44是示出了根据某些实施方案的使用本发明的组合物杀死特定患者的癌细胞的实例的示意图。
发明详述
在本发明的下列详细描述中，当使用指代术语，例如：所述、该、最后、之前和前者时，其指上文提到的确切的术语(例如，当表述“该核酸序列”时，其指上文提到的核酸序列而不是指上文提到的核苷酸序列)。此外，在本发明的下列详细描述中，称为其他实施方案的每个实施方案通过其被定义为单独的单元。
下列是遍布本说明书使用并应根据各个实施方案如下理解的术语：
如本文所指的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列在本文中可互换地使用。这些术语指以单独片段的形式或作为较大的构建体的组分的直链或支链、单链、双链、三链的脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)或其修饰形式的聚合物或其杂合体(hybrid)。该术语还包括RNA/DNA杂合体。多核苷酸可包含DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是例如，但不限于：互补DNA(cDNA)、基因组DNA、合成DNA、重组DNA或其杂合体或RNA分子诸如，例如mRNA、shRNA、siRNA、miRNA及类似分子。因此，如本文所用的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列意在指DNA和RNA分子二者。这些术语还包括由天然存在的碱基、糖和核苷间共价键构成的寡核苷酸，以及具有与各自的天然存在的部分相似地发挥作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”被本文互换地用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所指的，术语“互补性”指核酸链之间的碱基配对。如本领域已知的，因为这些链间的碱基对通过两个或三个氢键非共价连接，所以核酸的每条链可与另一条链互补。相对的互补核酸链上的通过氢键连接的两个核苷酸称为碱基对。根据沃森-克里克DNA的碱基配对，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)且鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替代。核酸两条链之间的互补性可根据在这些链之间形成碱基对的核苷酸的数目(或百分比)改变。例如，“100％的互补性”表示每条链中的所有核苷酸与互补链形成碱基对。例如，“95％的互补性”表示每条链中的95％的核苷酸与互补链形成碱基对。术语足够的互补性可包括从约30％至约100％的任何互补性百分比。
如本文所用的术语“构建体”指可以是一种或多种核酸序列的人工组装或分离的核酸分子，其中这些核酸序列可包含编码序列(也就是，编码终产物的序列)、调控序列、非编码序列或其任何组合。术语构建体包括例如载体，但不应视为局限于此。
“表达载体(Expression vector)”指具有将异源性核酸片段(例如，DNA)掺入到外源细胞中并在所述外源细胞中表达所述异源性核酸片段的能力的载体。换句话说，表达载体包含能够被转录的核酸序列/片段(例如，DNA、mRNA、tRNA、rRNA)。许多原核和真核表达载体是已知的和/或市售的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所用的术语“上游”和“下游”指在核苷酸序列例如DNA序列或RNA序列中的相对位置。如众所周知的，核苷酸序列具有所谓的针对核苷酸骨架上的糖(脱氧核糖或核糖)环的碳的5′端和3′端。因此，相对于在核苷酸序列上的位置，术语下游指朝向序列的3′端的区域。术语上游指朝向链的5′端的区域。
如本文所用的术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”指通常位于编码序列的5′端(也就是，在其之前、位于其上游)并充当开关，激活编码序列表达的核苷酸序列。如果编码序列被活化，则其被表述为被转录。转录通常包括从编码序列合成RNA分子(例如，诸如mRNA)。因此，启动子用作转录调控元件且还提供用于使编码序列转录为mRNA开始的位点。启动子可完全衍生自天然来源，或由不同的衍生自自然界中发现的不同的启动子的元件构成，或甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件或以不同的表达水平指导基因的表达。通常导致基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。控制基因在特定组织中表达的启动子被称为“组织特异性启动子”。
如本文所用的，术语“目的RNA”和“外源目的RNA”可互换地使用。这些术语指被引入到靶细胞中且可在靶细胞内编码RNA分子的核苷酸序列。
如本文所用的，术语“目的蛋白”、“外源性目的蛋白”和“POI”可互换地使用。这些术语指由外源目的RNA翻译的肽序列。在某些实施方案中，所述肽序列可以是一种或多种不同的蛋白质或融合蛋白。
如本文所用的，术语“信号RNA”和“内源性信号RNA”可互换地使用。这些术语指包含预定信号序列的细胞内RNA分子/序列。内源性信号RNA可由细胞的基因组和/或由细胞内驻留的外源基因组，例如诸如由细胞内驻留的病毒编码。在某些实施方案中，所述内源性信号RNA是成熟的mRNA分子。在某些实施方案中，所述内源性信号RNA是病毒RNA。信号RNA在外源目的RNA被引入靶细胞或表达之前存在于该细胞内。
如本文所用的，术语“预定信号序列”和“信号序列”可互换地使用。
如本文所用的，术语“预定裂解位点”和“另外的裂解位点”指内源性信号RNA的序列内的裂解位点。
如本文所用的，术语“特定靶位点”、“特定裂解位点”和“特定靶/裂解位点”可互换地使用。这些术语指外源目的RNA的序列内的一个或多个裂解位点。
如本文所用的术语“表达”指在靶细胞内产生期望的终产物分子。终产物分子可以是例如RNA分子(诸如，例如，mRNA分子、siRNA分子及类似RNA分子)；肽或蛋白质；以及类似分子；或其组合。
如本文所指的，术语“开放读码框”(″ORF″)指包含起始密码子和终止密码子的编码区。
如本文所指的，术语“Kozak序列”是本领域熟知的且指mRNA分子上被核糖体作为翻译起始位点识别的序列。术语“Kozak共有序列”、“Kozak共有区”或“Kozak序列”是存在于真核mRNA上且具有共有区(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO.24)的序列，其中，R是嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，位于起译密码子(AUG)上游三个碱基处，起译密码子(AUG)之后为另一个‘G’。在某些实施方案中，Kozak序列具有序列RNNAUGG(SEQ ID NO.112)，其中N是A、G、C或U中的任何核苷酸。
如本文所用的，术语“引入”和“转染”可互换地使用且指将分子诸如例如核酸、多核苷酸分子、载体及类似分子转移到靶细胞中，且更特别地转移到靶细胞的膜围封的空间的内部。这些分子可通过本领域技术人员已知的任何方法被“引入”到靶细胞中，例如，由Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(2001)教导的方法，该文献的内容被通过引用并入本文。将分子“引入”到细胞内的方法包括例如，但不限于：热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质转染法、转染试剂、病毒介导的转移以及类似方法或其组合。细胞的转染可在任何类型的任何来源的细胞例如诸如人细胞、动物细胞、植物细胞及类似细胞上进行。这些细胞可以是例如，但不限于：分离的细胞、组织培养的细胞、细胞系、生物体内存在的细胞以及类似的细胞。
关于细胞/细胞群的术语“杀死”指包括将导致细胞/细胞群的死亡的任何类型的操作。
如本文所指的，术语“治疗疾病”或“治疗病症”指施用一种组合物，所述组合物包括有效地减轻与疾病有关的症状以降低疾病的严重度或治愈所述疾病或以预防所述疾病发生的至少一种试剂(其可以是例如，一种或多种多核苷酸分子、一种或多种载体、一种或多种物质/成分以及类似试剂)。施用可以是任何施用途径。
术语“检测”、“诊断”指检测疾病、症状、疾患、病理学状况或正常状况(pathological or normal condition)的检测；对疾病、症状、疾患、病理学病症分类；确定疾病、症状、疾患、病理学状况的严重性；监测疾病、症状、疾患、病理学状况的进展；预测其结果和/或恢复的前景的方法。
1.根据某些实施方案的本发明的组合物的结构
根据本发明的某些实施方案，提供了用于响应于细胞中内源性信号RNA序列的存在指导外源目的RNA裂解的组合物。外源目的RNA由所述组合物编码。内源性信号RNA是包含预定信号序列的RNA分子，其中预定信号序列是长度为18至25个核苷酸的序列的随机序列。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含特定序列的RNA序列，所述特定序列与预定信号序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰；
(b)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的5′端；和
(c)编码载体RNA的多核苷酸序列，所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列下游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列上游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
因此，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性RNA直接或间接地实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′端的裂解，且然后载体RNA与裂解的信号RNA处的边缘序列杂交，并指导预定信号序列的加工，且然后被加工的预定信号序列指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶/裂解位点的裂解。例如，参见图2。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含特定序列的RNA序列，所述特定序列与预定信号序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰；
(b)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端；和
(c)编码载体RNA的多核苷酸序列，所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
因此，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性RNA直接或间接地实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端的裂解，且然后载体RNA与裂解的信号RNA处的边缘序列杂交，并指导预定信号序列的加工，且然后被加工的信号序列指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶/裂解位点的裂解。例如，参见图3。
在本发明另外的实施方案中，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含特定序列的RNA序列，所述特定序列与预定信号序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰；
(b)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的5′端；和
(c)编码RNA载体序列的多核苷酸序列，所述RNA载体序列包含长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的载体序列：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列下游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列上游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；和
(d)编码能够直接或间接地实现载体RNA序列在载体裂解位点处裂解的功能性核酸的一种或多种多核苷酸序列，其中载体裂解位点是载体序列的3′端。
因此，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性RNA直接或间接地实现内源性信号RNA在预定信号序列的5′端的裂解，且功能性核酸直接或间接地实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。裂解的载体RNA序列与裂解的内源性信号RNA处的边缘序列杂交并指导预定信号序列的加工。然后，被加工的信号序列可指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶/裂解位点的裂解。例如，参见图4。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含特定序列的RNA序列，所述特定序列与预定信号序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰；
(b)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端；
(c)编码载体RNA序列的多核苷酸序列，所述RNA载体序列包含长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的载体序列：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；和
(d)编码能够直接或间接地实现载体RNA序列在载体裂解位点处裂解的功能性核酸的一种或多种多核苷酸序列，其中载体裂解位点是载体序列的5′端。
因此，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性RNA直接或间接地实现内源性信号RNA在预定信号序列的3′端的裂解，且功能性核酸直接或间接地实现载体RNA序列在载体序列的5′端的裂解。裂解的载体RNA序列可与裂解的内源性信号RNA处的边缘序列杂交并指导预定信号序列的加工。然后，被加工的预定信号序列可指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶/裂解位点的裂解。例如，参见图5。
根据某些实施方案，可根据其在特定靶细胞中的存在来选择预定信号序列，从而提供用于靶向所选择的细胞中外源目的RNA裂解的机制。特定靶细胞可以是任何类型的细胞。例如，特定靶细胞可以是例如，但不限于：良性或恶性赘生物的细胞。平均地，每种肿瘤包含90种蛋白质编码基因中的突变[16]。每种肿瘤源自单个的生成细胞[38]，因此最可能的是这些突变基因中的至少一种被转录成mRNA。特定靶细胞还可包括但不限于病毒感染的细胞。特异性可通过修饰编码外源目的RNA中的功能性RNA、载体RNA和/或特定序列的序列实现。
在涉及激活表达特定miRNA的细胞中的目的基因的共同未决申请中，预定信号序列可包含内源性miRNA。
根据某些实施方案，本发明的预定信号序列不包括内源性细胞miRNA分子或任何其他类型的能够指导或实现细胞内的RNA分子裂解的RNA分子(诸如，例如，shRNA、核酶、stRNA及类似RNA分子)。
在某些实施方案中，预定信号序列不能在不存在本发明的组合物中的一种或多种组分时诱导/实现裂解。
已开发了鉴定特定细胞所特有的预定信号序列的多种方法。这些方法包括DNA微阵列、Tilling(靶向诱导的基因组中的局部损伤)和癌细胞基因组的大规模测序。此外，由于2005年12月13日发起并已将造成癌症的所有基因突变编成目录的癌症基因组Atlas(NIH项目)，预定信号序列的鉴定被预测为甚至更为简单。
已报道在哺乳动物细胞中，多聚(A)尾巴的去除使功能性mRNA的半衰期仅减少2.6倍且帽子的去除仅使功能性mRNA的半衰期仅减少1.7倍[10]。已报道已被细胞中的RISC-RNA复合物裂解的mRNA的两个部分可通过Northern分析容易地检测[6]。
根据某些实施方案，本发明的实施方案中的载体RNA/序列可与包括预定信号序列的裂解的内源性信号RNA部分杂交。已报道在细胞中，在5′端具有长度约19个核苷酸的互补区的长度约23个核苷酸的两种RNA转录物彼此杂交并能够指导靶特异性RNA干扰[7]。
根据另外的实施方案，包含载体RNA和包括预定信号序列的裂解的内源性信号RNA部分的双链体可成为Dicer的底物且此后成为Risc的底物。已报道在一个3′端还包含20个核苷酸长的ssRNA的52个核苷酸长的dsRNA在平端时是Dicer的底物[8]。还已报道，在哺乳动物细胞中，Risc被偶联到Dicer[9]。
2.功能性RNA和功能性核酸的结构
本部分描述了本发明的组合物的功能性RNA和功能性核酸的结构的多种实施方案。例如，这被示出在图2、3、4、5中。
在本发明的另一个实施方案中，上文的前述实施方案(第1部分)中描述的功能性RNA是：
(i)抑制性RNA，其包含长度为18至25个核苷酸的序列，该序列与靶序列具有使抑制性RNA通过例如，RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的足够的互补性，其中靶序列是位于内源性信号RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处；或
核酶，其能够结合(i)的区域且实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解。
在一个实施方案中，前一实施方案中描述的(i)的区域可位于从预定裂解位点下游约11个核苷酸处至预定裂解位点上游约12个核苷酸处。在一个实施方案中，(i)的区域位于从预定裂解位点下游约10个核苷酸处至预定裂解位点上游约11个核苷酸处。例如，参见图6A、6B。
在本发明的另一个实施方案中，上文(第1部分)描述的功能性核酸是：
(i)抑制性RNA，其包含长度为18至25个核苷酸的序列，该序列与靶序列具有使抑制性RNA通过例如，RNA干扰指导载体RNA序列在载体裂解位点裂解的足够的互补性，其中靶序列是位于载体RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，且其中所述区域位于从载体裂解位点下游约25个核苷酸至载体裂解位点上游约25个核苷酸处；或
(ii)核酶，其能够结合(i)的区域且实现载体RNA在载体裂解位点的裂解。在一个实施方案中，前一实施方案中描述的(i)的区域位于从载体裂解位点下游约11个核苷酸处至载体裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，(i)的区域位于从载体裂解位点下游约10个核苷酸处至载体裂解位点上游约11个核苷酸处。例如，参见图7A、7B。
根据某些实施方案，上述(i)的抑制性RNA可以是例如，但不限于：反义RNA、双链RNA(dsRNA)和/或小干扰RNA(siRNA)。在某些实施方案中，(i)的抑制性RNA可以是例如，但不限于：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)和/或siRNA表达结构域。
根据另外的实施方案，(i)的抑制性RNA包含：
(a)第一RNA分子，其在5′或3′端包含核酸序列，其中所述核酸序列与(i)的靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰；且
(b)第二RNA分子，其包含能够结合所述核酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的长度为18-25个核苷酸且其中所述核苷酸序列位于第二RNA分子的5′或3′端。
因此，第一和第二RNA分子在第一和第二RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的活性末端形成0-5个核苷酸的3′-突出端或5′-突出端，其中所形成的双链体的活性末端是包含所述核酸序列和所述核苷酸序列的末端。
在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的第一RNA分子为约25至30个核苷酸长且第二RNA分子为约25至30个核苷酸长，其中第一和第二RNA分子在第一和第二RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的活性末端上形成2个核苷酸的3′-突出端，且其中所述双链体可为Dicer的底物。例如，参见图8A、8B。
在某些实施方案中，上述(ii)的核酶可以是例如，但不限于：锤头型核酶、发夹型核酶和/或四膜虫型核酶。
在另外的实施方案中，(ii)的核酶是锤头型核酶[21]，其在3′端包含长度为7个核苷酸的第一序列，所述第一序列与位于(i)的区域的3′端上游26个核苷酸处并向上游延伸到(i)的区域中的序列互补，此外，所述锤头型核酶在5′端包含长度为7个核苷酸的第二序列，所述第二序列与位于(i)的区域的3′端上游18个核苷酸处并向上游延伸到(i)的区域中的序列互补[21]。例如，参见图9A。
在另一个实施方案中，(ii)的核酶是发夹型核酶[21]，其在5′端包含长度为16个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列在5′端包含与位于(i)的区域的5′端下游28个核苷酸处并向下游延伸到(i)的区域中的序列互补的长度为8个核苷酸的序列，且其中所述核酸序列在3′端包含与位于(i)的区域的3′端上游26个核苷酸处并向上游延伸到(i)的区域中的序列互补的长度为4个核苷酸的序列[21]。例如，参见图9B。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，核酶的使用将不会保持/用尽并因此稀释RNA干扰通路的细胞组分。
在另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸是位于载体RNA序列内并实现载体RNA序列在载体裂解位点处的裂解的顺式作用型核酶。在某些实施方案中，顺式作用型核酶可以是例如但不限于非常有效的顺式作用型锤头状核酶：snorbozyme[22]和/或N117[23]。例如，参见图10、11。
根据某些实施方案，且不被理论或机制束缚地，通过使用顺式作用型核酶，包含其的载体序列可自身裂解[22]，这可产生优选的结果。
在另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸是核酸内切酶识别位点或内源性miRNA结合位点，其中所述功能性核酸位于载体RNA内且能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点处的裂解。例如，参见图12A、12B。
3.具有茎环结构的功能性核酸的结构
第1部分的实施方案中描述的功能性核酸可以是例如，但不限于，茎环结构或miRNA结构，其中功能性核酸指导载体序列在载体裂解位点处的裂解。本部分描述了具有茎环结构或miRNA结构的功能性核酸的结构的实施方案。
在某些实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸是位于载体RNA序列内的miRNA序列，其中在将组合物引入到细胞中后，miRNA序列被加工，其中miRNA序列的加工能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点处的裂解，且其中miRNA序列的加工包括Drosha加工。在一个实施方案中，前一实施方案中描述的miRNA序列包含对应于天然存在的miRNA的序列，或与其基本上相同的序列。例如，参见图12C、12D。
在另一个实施方案中，第1部分中描述的功能性核酸具有紧邻载体RNA序列中的载体序列的5′端上游定位的核苷酸序列，其中第三序列的长度是0个核苷酸，且其中所述核苷酸序列能够结合载体序列，其中所述载体序列和所述核苷酸序列能够形成为Drosha的底物的茎环结构。在将所述组合物引入到细胞中后，茎环结构会被加工，且茎环结构的加工能够直接或间接地实现载体RNA在载体序列的3′端的裂解。在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的茎环结构最多约150个核苷酸长，且加工过的茎环结构不是Dicer的底物。例如，参见图13A。
在另一个实施方案中，第1部分中描述的功能性核酸具有紧邻载体RNA中的载体序列的3′端下游定位的核苷酸序列，其中第三序列的长度是0个核苷酸，且其中所述核苷酸序列能够结合载体序列。所述载体序列和所述核苷酸序列能够形成为Drosha的底物的茎环结构。在将所述组合物引入到细胞中后，茎环结构会被加工，且茎环结构的加工能够直接或间接地实现载体RNA在载体序列的5′端的裂解。在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的茎环结构具有最多约150个核苷酸长，且加工过的茎环结构不是Dicer的底物。例如，参见图13B。
根据某些实施方案，且不受理论或机制束缚地，miRNA序列或茎环结构的使用可提供增强的结果，因为载体序列可被Drosha独立地裂解。在另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸包含：
(i)第一核苷酸序列，其紧邻载体RNA中的载体序列的5′端上游定位，其中第三序列的长度是0-50个核苷酸；和
(ii)第二核苷酸序列，其紧邻载体序列的3′端下游定位，其中第二核苷酸序列能够结合第一核苷酸序列，其中第二核苷酸序列和第一核苷酸序列以及载体序列能够形成茎环结构。
其中，在将所述组合物引入到细胞中后，所述茎环结构被加工，其中茎环结构的加工能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点处的裂解，且其中茎环结构的加工能够形成一种或多种RNA双链体。茎环结构的加工可包括例如，Dicer加工且RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体。
在另外的实施方案中，前一实施方案中描述的功能性RNA是长度为18至25个核苷酸的核酸序列，该核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中靶序列是位于内源性信号RNA的区域内的18至25个核苷酸的序列。该区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸处至预定裂解位点上游约25个核苷酸处，其中所述核酸序列位于所述第一核苷酸序列内或第二核苷酸序列内。在将所述组合物引入到细胞中后，来自一个或多个RNA双链体的至少一个RNA双链体包含所述核酸序列且包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处被裂解。例如，参见图14A。
在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的第一核苷酸序列或第二核苷酸序列是所述核酸序列，其中载体RNA序列主要由下列组成：第一核苷酸序列和第二核苷酸序列以及载体序列。第一核苷酸序列的长度为18-25个核苷酸，且第二核苷酸序列的长度为18-25个核苷酸。所述茎环结构形成2个核苷酸的3′-突出端，且可以是Dicer的底物，且其中载体RNA多核苷酸序列的表达由基于聚合酶I的启动子或基于聚合酶III的启动子驱动。例如，参见图14B。
在某些实施方案中，前2个实施方案中任何一个中描述的区域可位于从预定裂解位点下游约11个核苷酸处至预定裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的区域可位于从预定裂解位点下游约10个核苷酸处至预定裂解位点上游约11个核苷酸处。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，位于同一RNA分子内的功能性RNA和载体序列的使用可需要更少的转录单元，这可产生有利的结果。功能性RNA与载体序列靠近的另外的优点是它们同时且以恒定的比例在细胞内的同一位置被合成。
4.位于同一RNA双链体内的载体序列/RNA和功能性RNA/核酸的结 构
本部分描述了第1部分中描述的本发明的组合物的结构的多个实施方案，其中载体RNA和/或载体序列与功能性RNA或与功能性核酸一起位于同一RNA双链体内。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸可包含：
(i)紧邻载体RNA中的载体序列的3′端下游定位的核苷酸序列，其中所述载体RNA主要由所述载体序列和所述核苷酸序列组成；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和至少一种RNA分子在核苷酸序列和至少一种RNA分子中的每一个互相杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点处的裂解，且其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括例如，Dicer加工且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分中的实施方案中描述的功能性核酸可包含：
(i)紧邻载体RNA中的载体序列的5′端上游定位的核苷酸序列，其中所述载体RNA主要由所述载体序列和所述核苷酸序列组成；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和来自所述一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子在核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工。对所述核苷酸序列的加工可能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点处的裂解，且对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体，其中对所述核苷酸序列的加工可包括例如，Dicer加工且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体。
在某些实施方案中，前2个实施方案中的任一个中描述的功能性RNA是长度为18至25个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰。靶序列是位于内源性信号RNA内的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于从预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处，其中所述核酸序列位于所述核苷酸序列内或来自一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子内。在将所述组合物引入到细胞中后，一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且包含所述核酸序列的RNA双链体通过例如，RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。
在一个实施方案中，前一实施方案中描述的区域位于从预定裂解位点下游约11个核苷酸处至预定裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，前2个实施方案中的任何一个中描述的所述一种或多种RNA分子主要由所述核苷酸序列组成，其中所述核苷酸序列的长度是18-25个核苷酸且所述一种RNA分子的长度为18-25个核苷酸。所述核苷酸序列和所述一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成2个核苷酸的3′-突出端，载体RNA和所述一种RNA分子的表达由基于聚合酶I或III的启动子驱动。例如，参见图15A和15B。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，当功能性RNA和载体序列位于同一RNA双链体内时，载体序列可使功能性RNA与内源性信号RNA的预定信号序列靠近，且还可使RNA干扰通路的组分(例如，Dicer和Risc)与预定信号序列靠近。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性RNA包含：
(i)位于载体RNA的5′端的核苷酸序列；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和至少一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述至少一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。所述核苷酸序列或至所述少一种RNA分子包括长度为18至25个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中所述靶序列是位于内源性信号RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子可彼此杂交且所述核苷酸序列可被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括Dicer加工，且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性RNA可包含：
(i)位于载体RNA的3′端的核苷酸序列；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和至少一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述至少一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。所述核苷酸序列或来自所述一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子包括长度为18至25个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中所述靶序列是位于内源性信号RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括Dicer加工，且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。
在另外的实施方案中，前2个实施方案中任何一个中描述的区域可位于从预定裂解位点下游约11个核苷酸处至预定裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，前3个实施方案中的任何一个中描述的所述一种或多种RNA分子是一种RNA分子，其中所述核苷酸序列或所述一种RNA分子主要由所述核酸序列组成。所述核苷酸序列的长度是18-25个核苷酸且所述一种RNA分子的长度是18-25个核苷酸，其中所述核苷酸序列和RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成2个核苷酸的3′-突出端。在某些实施方案中，载体RNA和所述一种RNA分子的表达由基于聚合酶I或III的启动子驱动。例如，参见图16A和16B。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，当功能性RNA和载体RNA位于同一RNA双链体内时，载体RNA可使功能性RNA与内源性信号RNA的预定信号序列靠近，且通过这种靠近还可使RNA干扰通路的组分(例如，Dicer和Risc)与预定信号序列靠近。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性RNA可包含：
(i)位于载体RNA的5′端的核苷酸序列；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和至少一种RNA分子在所述核苷酸序列和RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。所述核苷酸序列或至少一种RNA分子可包括长度为18至25个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰。所述靶序列是位于内源性信号RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括Dicer加工，且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性RNA可包含：
(i)位于载体RNA的3′端的核苷酸序列；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和至少一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。所述核苷酸序列或至少一种RNA分子可包含长度为18至25个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰。所述靶序列是位于内源性信号RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括例如，Dicer加工，且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。
在另一个实施方案中，前两个实施方案中的任何一个中描述的区域可位于从预定裂解位点下游约11个核苷酸处至预定裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，前3个实施方案中的任何一个中描述的所述一种或多种RNA分子是一种RNA分子，其中所述核苷酸序列或所述一种RNA分子主要由所述核酸序列组成。所述核苷酸序列的长度为18-25个核苷酸，且所述一种RNA分子的长度为18-25个核苷酸。所述核苷酸序列和所述一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成2个核苷酸的3′-突出端。所述载体RNA和所述一种RNA分子的表达由基于聚合酶I或III的启动子驱动。例如，参见图17A和17B。
在某些实施方案中，第1部分的实施方案中描述的功能性核酸可包含：
(i)位于载体RNA序列的5′端的核苷酸序列；和(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和来自所述一种或多种RNA分子的一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。其中所述核苷酸序列或来自所述一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子可包括长度为18至25个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中所述靶序列是位于载体RNA内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，且其中所述区域位于载体裂解位点下游约25个核苷酸至载体裂解位点上游约25个核苷酸处。其中在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括例如，Dicer加工，且所述RNA双链体可以是siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导载体RNA在载体裂解位点处的裂解。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分中的实施方案中描述的功能性核酸包含：
(i)位于载体RNA序列的3′端的核苷酸序列；和
(ii)能够结合所述核苷酸序列的一种或多种RNA分子；其中所述核苷酸序列和来自所述一种或多种RNA分子的一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子彼此杂交时形成的双链体的一端上形成0-5个核苷酸的3′突出端或5′突出端。
其中所述核苷酸序列或来自所述一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子包含长度为18至25个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列与靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中靶序列是位于载体RNA序列内的区域中的长度为18至25个核苷酸的序列，且其中所述区域位于从载体裂解位点下游约25个核苷酸至载体裂解位点上游约25个核苷酸处。在将所述组合物引入到细胞中后，所述核苷酸序列和所述一种或多种RNA分子彼此杂交且所述核苷酸序列被加工，其中对所述核苷酸序列的加工能够形成一种或多种RNA双链体。对所述核苷酸序列的加工可包括例如，Dicer加工，且RNA双链体可包含siRNA双链体和/或miRNA双链体，其中来自所述一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包含所述核酸序列且其中，包含所述核酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导载体RNA在载体裂解位点处的裂解。
在另一个实施方案中，前2个实施方案中任何一个中描述的区域可位于从载体裂解位点下游约11个核苷酸处至载体裂解位点上游约12个核苷酸处。在另一个实施方案中，前3个实施方案中的任何一个中描述的所述一种或多种RNA分子是一种RNA分子，其中所述核苷酸序列或所述一种RNA分子主要由所述核酸序列组成。所述核苷酸序列的长度是18-25个核苷酸且所述一种RNA分子的长度是18-25个核苷酸，且所述核苷酸序列和所述一种RNA分子在所述核苷酸序列和所述一种RNA分子中的每一个彼此杂交时形成的双链体的一端上形成2个核苷酸的3′-突出端。载体RNA和所述一种RNA分子的表达可由基于聚合酶I或III的启动子驱动。例如，参见图18A和18B。
在另一个实施方案中，功能性RNA是长度为18至25个核苷酸的特定核苷酸序列，所述特定核苷酸序列与特定靶序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰。特定靶序列是位于内源性信号RNA的特定区域内的长度为18至25个核苷酸的序列，其中所述特定区域位于预定裂解位点下游约25个核苷酸至预定裂解位点上游约25个核苷酸处。所述特定核苷酸序列位于所述核苷酸序列内或来自所述一种或多种RNA分子的至少一种RNA分子内。在将所述组合物引入到细胞中后，来自一种或多种RNA双链体的至少一种RNA双链体包括所述特定核苷酸序列且其中包含所述特定核苷酸序列的RNA双链体通过RNA干扰指导内源性信号RNA在预定裂解位点处的裂解。例如，参见图19A和19B。
5.包含至少3个连续的载体序列的载体RNA序列的结构
本部分描述了第1部分中描述的载体RNA的结构，其中所述载体RNA包含至少3个连续的载体序列。
在本发明的某些实施方案中，第1部分的实施方案中描述的载体RNA还可在紧邻所描述的载体序列下游处包含至少2个连续的载体序列。例如，参见图20A。
在另外的实施方案中，第1部分的实施方案中描述的载体RNA还可在紧邻其中所描述的载体序列的下游处包含100个连续的载体序列(其可相同或不同)，其中所述边缘序列为23-28个核苷酸长且位于从预定裂解位点下游约23-28个核苷酸处；第二序列的长度是2个核苷酸；第三序列的长度是0个核苷酸且所述多核苷酸序列和载体RNA的表达由CMV-IE驱动。
在另外的实施方案中，第1部分的实施方案中描述的载体RNA还可在紧邻所述载体序列上游处包含至少2个连续的载体序列。例如，参见图20B。
在另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的载体RNA还可在紧邻所述载体序列上游处包含可以是相同或不同的100个连续的载体序列，其中所述边缘序列为25-30个核苷酸长且位于预定裂解位点上游2个核苷酸处并向上游延伸至内源性信号RNA中；第二序列的长度是0个核苷酸；第三序列的长度是0个核苷酸且其中所述多核苷酸序列和载体RNA的表达由CMV-IE驱动。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，当功能性核酸为例如，微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、小干扰RNA(siRNA)和/或反式作用型核酶时可获得有利的结果，因为有了这些功能性核酸，许多载体序列可由一种载体RNA和一种功能性核酸产生。
6.还可转录另外的功能性RNA的多核苷酸分子的结构，所述另外的 功能性RNA可在未被裂解的相对侧裂解预定信号序列
本部分描述了第1部分的实施方案中描述的多核苷酸分子(诸如，例如，DNA分子)的结构的实施方案，其中这些多核苷酸分子还一起转录能够实现内源性信号RNA在预定信号序列未被裂解的相对侧的裂解的另外的功能性RNA。
在本发明的某些实施方案中，第1部分的某些实施方案中描述的多核苷酸分子还包含编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在另外的裂解位点处裂解的另外的功能性RNA的多核苷酸序列，其中所述另外的裂解位点可位于预定信号序列的3′端下游0-1000个核苷酸处。在一个实施方案中，所述另外的裂解位点可位于预定信号序列的3′端下游0-5个核苷酸处。例如，参见图21A。
在另外的实施方案中，第1部分的某些实施方案中描述的多核苷酸分子还可包含编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在另外的裂解位点处裂解的另外的功能性RNA的多核苷酸序列，其中所述另外的裂解位点可位于预定信号序列的5′端上游0-1000个核苷酸处。在一个实施方案中，所述另外的裂解位点可位于预定信号序列的5′端上游0-5个核苷酸处.例如，参见图21B。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，前4个实施方案可能是有利的，因为在这些实施方案中，预定信号序列可在其两个末端被裂解且因此通过载体RNA/序列，其可成为内源性酶，诸如例如Dicer和/或Risc的更好的底物。
7.外源目的RNA的结构
在本发明的某些实施方案中，第1部分的实施方案中描述的外源目的RNA还可包含：
编码外源目的蛋白的序列；和
能够抑制该外源目的蛋白表达的抑制序列；
其中预定靶/裂解位点位于抑制序列和编码外源目的蛋白的序列之间。在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，外源RNA分子被转录并在该特定靶/裂解位点被裂解，其中抑制序列与编码外源目的蛋白的序列分离，并且外源目的蛋白能够被表达。例如，参见图22A和22B。因此，外源目的RNA的裂解可导致细胞内活性外源目的蛋白的表达。
在某些实施方案中，外源目的RNA分子还可包含载体RNA序列和/或功能性RNA序列。
如本领域已知的，无帽子或多聚A尾巴的mRNA仍能够翻译蛋白质。在哺乳动物细胞中，帽子的添加使mRNA翻译增加到35-50倍，而多聚(A)尾巴的添加使mRNA翻译增加到114-155倍[10]。哺乳动物细胞中的多聚(A)尾巴使功能性mRNA半衰期仅增加到2.6倍而帽子使功能性mRNA半衰期仅增加到1.7倍[10]。
某些蛋白质甚至能够在每个细胞中一个蛋白质分子的浓度下是有生物学活性的。已经报道到达细胞溶胶的单个分子的蓖麻毒素或相思豆毒素蛋白可杀死该细胞[12，13]。另外，引入到细胞中的单个分子的白喉毒素片段A蛋白可杀死该细胞[14]。本发明的外源目的蛋白可以是任何蛋白质或肽。例如，在某些实施方案中，所述外源目的蛋白可以是任何类型的毒素(诸如，例如，蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素(DTA)、肉毒毒素)；酶；报告基因；结构基因及类似的蛋白。在某些实施方案中，外源目的蛋白可以是为两种蛋白的融合产物的多肽，该多肽可在两种蛋白质之间具有裂解位点，允许所述两种蛋白质在细胞内分离。例如，外源目的蛋白可以是蓖麻毒素和DTA的融合蛋白，其中通过例如特异性蛋白酶对融合蛋白的裂解可导致细胞中单独的DTA和蓖麻毒素蛋白质的形成。在某些实施方案中，外源目的蛋白可包括由所述组合物表达的两种单独的蛋白质。例如，外源目的RNA可编码两种单独的外源目的蛋白，诸如例如，蓖麻毒素和DTA。
7.1.具有位于特定靶/裂解位点上游的抑制序列的外源目的RNA的结 构
7.1.1.位于特定靶/裂解位点上游的抑制序列的结构
第7部分的实施方案中描述的外源目的RNA中的抑制序列可位于特定靶/裂解位点的上游或下游。本部分根据某些实施方案描述了位于外源目的RNA中的特定靶/裂解位点的上游的抑制序列的结构。例如，参见图22A。
在本发明的某些实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分的实施方案中被描述的抑制序列可包含，例如，但不限于起始密码子，其中所述起始密码子和编码外源目的蛋白的序列不在同一读码框内，其中所述起始密码子导致对下游编码的目的蛋白的移码突变。例如，参见图23A。在一个实施方案中，起始密码子可位于Kozak共有序列中。另外，还可使用保持充当翻译起始物(initiator)的能力的修饰的Kozak共有序列。在某些实施方案中，可使用任何翻译起始元件。例如，参见图23B。
例如，人的Kozak共有序列是5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)且起始密码子是5′-AUG-3′。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含多个起始密码子，其中每个所述起始密码子和编码外源目的蛋白的序列都不在同一读码框内，其中所述起始密码子导致对下游编码的外源目的蛋白的移码突变。另外，每个起始密码子位于Kozak共有序列或保持充当翻译起始物的能力的修饰的Kozak共有序列内。例如，参见图23C。
在某些实施方案中，起始密码子可位于一个或多个TISU基序内或可包含一个或多个TISU基序。TISU(短5′UTR的翻译起始物)基序因其独特的指导具有非常短的5′UTR的mRNA有效且准确地开始翻译的能力而不同于Kozak共有区[39]。在本发明的其他实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分的实施方案中被描述的抑制序列包含起始密码子且所述外源目的RNA还包含位于所述起始密码子和编码外源目的蛋白的序列的起译密码子之间的终止密码子，其中所述终止密码子和所述起始密码子在同一读码框内。该结构产生降低编码目的蛋白的下游序列的翻译效率的上游开放读码框(uORF)。例如，参见图24A。在某些实施方案中，终止密码子可以是例如，5′-UAA-3′或5′-UAG-3′或5′-UGA-3′。
在某些实施方案中，强的茎和环可位于miRNA的靶序列(裂解位点)上游或下游的位置处的上游ORF的下游。这些茎和环的产生可在以下情况下有帮助：其中虽然已到达终止密码子，但是核糖体的小亚基不与mRNA分离而继续扫描mRNA。核糖体的小亚基不能打开的牢固的RNA二级结构。另外，当这些茎和环位于靶序列下游时，其可阻碍可由例如XRN1核糖核酸外切酶进行的裂解的mRNA的降解。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分的特定实施方案中被描述的抑制序列包含起始密码子和所述起始密码子下游的编码用于亚细胞定位的分选/定位/靶向信号的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子在同一读码框内且其中所述目的蛋白的亚细胞定位抑制其生物学功能。用于亚细胞定位的分选/定位信号包括但不限于用于线粒体、核、内体、溶酶体、过氧化物酶体、ER、或任何亚细胞位置或细胞器的分选定位信号。用于亚细胞定位的分选信号可选自例如，但不限于：过氧化物酶体定位信号2[(R/K)(L/V/I)X5(Q/H)(L/A)](SEQ ID NO.26)或H2N----RLRVLSGHL(SEQ ID NO.27)(人烷基磷酸二羟基丙酮合酶)[30]。例如，参见图24B。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分的实施方案中被描述的抑制序列包含起始密码子和所述起始密码子下游的编码蛋白降解信号的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子在同一读码框内。蛋白降解信号包括但不限于泛素降解信号。例如，参见图24B。
在本发明的其他实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列被设计为包含起始密码子和所述起始密码子下游的与所述起始密码子和编码外源目的蛋白的序列在同一读码框内的核苷酸序列，其中当由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列被融合到目的蛋白时，目的蛋白的生物学功能被抑制。例如，参见图24C。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含起始密码子，且所述外源目的RNA还包含所述起始密码子下游的终止密码子，其中所述终止密码子和所述起始密码子在同一读码框内。另外，所述外源目的RNA还可包含所述终止密码子下游的内含子，其中所述外源目的RNA是降解外源目的RNA的无义介导的衰变(NMD)的靶。例如，参见图24D。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含能够结合翻译阻遏蛋白(translationrepressor protein)的序列，其中所述翻译阻遏蛋白是内源性翻译阻遏蛋白或由所述组合物编码且其中所述翻译阻遏蛋白在所述外源目的RNA内直接或间接地降低目的蛋白的翻译效率[26]。能够结合翻译阻遏蛋白的序列包括，例如，但不限于结合smaug阻遏蛋白的序列(5′-UGGAGCAGAGGCUCUGGCAGCUUUUGCAGCG-3′)(SEQ ID NO.28)[27]。例如，参见图25A。
在本发明的其他实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含用于亚细胞定位的RNA定位信号(包括共翻译输入)或内源性miRNA结合位点，其中本发明的所述外源目的RNA的亚细胞定位抑制目的蛋白的翻译并降低外源目的RNA的半衰期。RNA定位信号可以是例如，但不限于用于下列的RNA定位信号：髓鞘化外周(myelinating periphery)、线粒体、髓磷脂区室(myelin compartment)、薄板前缘(leading edge of the lamella)或核周细胞质[24]。例如，用于髓鞘化外周的RNA定位信号是5′-GCCAAGGAGCCAGAGAGCAUG-3′(SEQ ID NO.29)或5′-GCCAAGGAGCC-3′(SEQ ID NO.30)[29]。例如，参见图25B。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含刺激外源目的RNA降解的RNA不稳定元件，其中所述RNA不稳定元件是富含AU的元件(ARE)或核酸内切酶识别位点。富含AU的元件可以是例如，但不限于至少约35个核苷酸长的富含AU的元件。富含AU的元件可以是例如，但不限于：5′-AUUUA-3′(SEQ ID NO.31)、5′-UUAUUUA(U/A)(U/A)-3′(SEQ ID NO.32)或5′-AUUU-3′(SEQ ID NO.33)[28]。例如，参见图25C。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含能够形成降低下游外源目的蛋白的翻译效率的二级结构的序列。在本发明的一个实施方案中，且不希望被理论或机制束缚地，前一实施方案描述的二级结构的折叠自由能可低于-30kcal/mol(例如，-50kcal/mol、-80kcal/mol)且因此，所述二级结构足以阻碍正在扫描的核糖体到达下游目的蛋白的起译密码子。例如，参见图25D。
在本发明另外的实施方案中，位于特定靶/裂解位点上游且在第7部分中被描述的抑制序列包含紧邻特定靶/裂解位点上游的能够结合紧邻特定靶/裂解位点下游的用于形成二级结构的核苷酸序列的序列，其中所述二级结构直接或间接地降低下游外源目的蛋白的翻译效率。
在某些实施方案中，前一实施方案中描述的二级结构的折叠自由能可低于-30kcal/mol(例如，-50kcal/mol、-80kcal/mol)且因此，该二级结构足以阻碍正在扫描的核糖体到达目的蛋白的起译密码子。在另一个实施方案中，所述特定靶/裂解位点位于前一实施方案中描述的二级结构中的单链区域或环区域内，其中所述单链区域或环区域包括，但不限于至少约15个核苷酸长的区域。在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的外源目的RNA包含特定靶/裂解位点下游和编码目的蛋白的序列上游的内部核糖体进入位点(IRES)序列，其中IRES序列在裂解的外源目的RNA内比在完整的外源目的RNA内功能更强。在其他实施方案中，IRES序列的至少一部分位于紧邻特定靶/裂解位点下游定位的核苷酸序列内。例如，参见图26。
在某些实施方案中，所述IRES序列包括例如但不限于：微小核糖核酸病毒的IRES、***(foot-and-mouth disease)病毒的IRES、脑心肌炎病毒的IRES、甲型肝炎病毒的IRES、丙型肝炎病毒的IRES、人类鼻病毒的IRES、脊髓灰质炎病毒的IRES、猪水疱病病毒的IRES、马铃薯Y病毒组的芜菁花叶病毒(turnip mosaic potyvirus)的IRES、人成纤维细胞生长因子2mRNA的IRES、鼠疫病毒的IRES、利什曼原虫RNA病毒的IRES、莫洛尼鼠白血病病毒的IRES、人鼻病毒14的IRES、***病毒(aphthovirus)的IRES、人免疫球蛋白重链结合蛋白mRNA的IRES、果蝇控制触角的基因的mRNA的IRES(Drosophila Antennapedia mRNAIRES)、人成纤维细胞生长因子2mRNA的IRES、庚型肝炎病毒的IRES、烟草花叶病毒的IRES、血管内皮生长因子mRNA的IRES、B组柯萨奇病毒的IRES、c-myc原癌基因mRNA的IRES、人MYT2mRNA的IRES、人双埃可病毒1型病毒的IRES、人双埃可病毒2型病毒的IRES、真核起始因子4GI mRNA的IRES、小珀椿象(Plautia stali)肠病毒IRES、鼠泰勒氏脑脊髓炎病毒IRES、牛肠道病毒IRES、连接蛋白43mRNA的IRES、同源结构域蛋白Gtx mRNA的IRES、AML1转录因子mRNA的IRES、NF-κB抑制因子mRNA的IRES、X连锁凋亡抑制因子mRNA的IRES、蟋蟀麻痹病毒RNA的IRES、p58(PITSLRE)蛋白激酶mRNA的IRES、鸟氨酸脱羧酶mRNA的IRES、连接蛋白32mRNA的IRES、牛病毒性腹泻病毒IRES、***I受体mRNA的IRES、人类1型免疫缺陷病毒gag基因的IRES、经典型猪瘟病毒IRES、卡波西肉瘤相关疱疹病毒的IRES、选自随机寡核苷酸文库的短IRES、Jembrana病的病毒IRES、凋亡蛋白酶活化因子1mRNA的IRES、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病毒的IRES、阳离子型氨基酸转运蛋白mRNA的IRES、人***II前导因子2mRNA的IRES(human insulin-like growth factor IIleader2mRNA IRES)、鞭毛虫病毒的IRES、Smad5mRNA的IRES、猪捷申病毒-1talfan的IRES、果蝇无毛mRNA的IRES、hSNM1mRNA的IRES、Cbfa1/Runx2mRNA的IRES、爱泼斯坦巴尔病毒的IRES、芙蓉枯黄环斑病毒的IRES、大鼠垂体后叶加压素V1b受体mRNA的IRES和/或人hsp70mRNA的IRES。
7.1.2.可增加在5′端处的特定靶/裂解位点被裂解的外源目的RNA的 翻译效率的另外的结构
本部分描述了第7部分的实施方案中描述的本发明的组合物的另外的结构的另外的实施方案，其中所述另外的结构可增加裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述裂解的外源目的RNA在5′端处的特定靶/裂解位点被裂解。
在某些实施方案中，第7部分的实施方案中描述的外源目的RNA可包含例如，含有紧邻编码外源目的蛋白的序列上游的独特的内部核糖体进入位点(IRES)序列的序列，其中所述独特的IRES序列增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率。例如，参见图27A。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA可包含紧邻编码目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列包含独特的茎环结构且其中所述独特的茎环结构直接或间接地增加目的蛋白的翻译效率和裂解的外源目的RNA的半衰期。所述独特的茎环结构可以是例如，但不限于人组蛋白基因的3′-UTR的保守茎环结构或其功能性衍生物。人组蛋白基因的3′-UTR的保守茎环结构是5′-GGCUCUUUUCAGAGCC-3′(SEQ ID NO.34)。例如，参见图27B。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分的特定实施方案中描述的外源目的RNA可包含紧邻编码外源目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列包含直接或间接地增加目的蛋白的翻译效率和裂解的外源目的RNA的半衰期的细胞质多聚腺苷酸化元件。细胞质多聚腺苷酸化元件可以是例如但不限于5′-UUUUAU-3′(SEQ ID NO.35)、5′-UUUUUAU-3′(SEQ ID NO.36)、5′-UUUUAAU-3′(SEQ ID NO.37)、5′-UUUUUUAUU-3′(SEQ ID NO.38)、5′-UUUUAUU-3′(SEQ ID NO.39)或5′-UUUUUAUAAAG-3′(SEQ ID NO.40)[25]。在某些实施方案中，本发明的组合物还可包括，例如，编码人细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白(hCPEB)的多核苷酸序列，和/或其同源物以在任何细胞中表达hCPEB。例如，参见图27C。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA包含位于特定靶/裂解位点下游和编码外源目的蛋白的序列上游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列能够结合位于编码目的蛋白的序列下游的序列。不希望被理论或机制束缚地，在该实施方案中，裂解的外源目的RNA可产生增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率的环形结构。例如，参见图27D。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA包含位于特定靶/裂解位点下游和编码目的蛋白的序列上游的独特的核苷酸序列。所述独特的核苷酸序列可能够结合能够直接或间接地结合裂解的外源目的RNA中的多聚(A)尾巴的独特的多肽，且所述独特的多肽可由本发明的组合物编码。不希望被理论或机制束缚地，在该实施方案中，所述独特的多肽和裂解的外源目的RNA可产生增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率的环形结构。例如，参见图28A。
7.1.3.可降低完整外源目的RNA的翻译效率的另外的结构
本部分描述了第7部分中描述的本发明的组合物的另外的结构的另外的实施方案，其中所述这些另外的结构可在本发明的外源目的RNA的被降解之前(也就是，完整的外源目的RNA)降低其翻译效率。
在某些实施方案中，第7部分中描述的组合物还包含能够直接或间接地实现本发明的外源目的RNA在位于抑制序列上游的位置处裂解的特定裂解组分，其中所述抑制序列位于特定靶/裂解位点上游。在某些实施方案中，特定裂解位点可包含：
(a)位于外源目的RNA内的特定核酸序列，其中所述特定核酸序列可以是例如，但不限于：核酸内切酶识别位点、内源性miRNA结合位点、顺式作用型核酶和/或miRNA序列；或
(b)由本发明的组合物编码的特定抑制性RNA，其中所述特定抑制性RNA可以是例如，但不限于：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶。
不希望被理论或机制束缚地，在该实施方案中，所述特定裂解组分可去除本发明的完整外源目的RNA的帽子结构以降低完整外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率。例如，参见图28B。
在某些实施方案中，可引入vpg识别序列，其中裂解之后，5′裂解端包含vpg识别序列。VPG蛋白质可结合vpg识别序列，从而取代帽子。vpg蛋白可由本发明的组合物或由抑制序列的第一ORF编码。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，使用顺式作用型核酶可以是有利的，因为包含其的外源目的RNA可自身裂解[22]。顺式作用型核酶可以是例如但不限于顺式作用型锤头状核酶：snorbozyme[22]和/或N117[23]。
7.2.具有位于特定靶/裂解位点下游的抑制序列的外源目的RNA的结 构
7.2.1.位于特定靶/裂解位点下游的抑制序列的结构
第7部分的实施方案中描述的外源目的RNA中的抑制序列可位于特定靶/裂解位点的上游或下游。在某些实施方案中，抑制序列可位于外源目的RNA中特定靶/裂解位点的下游。例如，参见图22B。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的位于特定靶/裂解位点下游的抑制序列可以是，例如，但不限于内含子。其中外源目的RNA是降解解外源目的RNA的无义介导的衰变(NMD)的靶[31]。例如，参见图29A。
在本发明的其他实施方案中，位于特定靶/裂解位点下游且在第7部分中被描述的抑制序列包括能够结合翻译阻遏蛋白的序列，其中所述翻译阻遏蛋白是内源性翻译阻遏蛋白或由所述组合物编码且其中所述翻译阻遏蛋白直接或间接地降低外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率[26]。能够结合翻译阻遏蛋白的序列可以是，例如smaug阻遏蛋白的结合序列(5′-UGGAGCAGAGGCUCUGGCAGCUUUUGCAGCG-3′)(SEQ ID NO.28)[27]。例如，参见图29B。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点下游且在第7部分中被描述的抑制序列包含用于亚细胞定位的RNA定位信号(包括共翻译输入)或内源性miRNA结合位点，其中本发明的外源目的RNA的亚细胞定位抑制外源目的蛋白的翻译并降低外源目的RNA的半衰期。RNA定位信号可以是例如，但不限于用于下列的RNA定位信号：髓鞘化外周、线粒体、髓磷脂区室、薄板前缘和/或核周细胞质[24]。RNA定位信号可以是，例如，用于髓鞘化外周的RNA定位信号5′-GCCAAGGAGCCAGAGAGCAUG-3′(SEQ ID NO.29)或5′-GCCAAGGAGCC-3′(SEQ ID NO.30)[29]。例如，参见图29C。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点下游且在第7部分中被描述的抑制序列可以是，例如刺激外源目的RNA降解的RNA不稳定元件，其中所述RNA不稳定元件是富含AU的元件(ARE)或核酸内切酶识别位点。所述富含AU的元件可以是例如，至少约35个核苷酸长的富含AU的元件。所述富含AU的元件可以是例如，5′-AUUUA-3′(SEQ ID NO.31)、5′-UUAUUUA(U/A)(U/A)-3′(SEQ ID NO.32)或5′-AUUU-3′(SEQ ID NO.33)[28]。例如，参见图29D。
在本发明的另一个实施方案中，不希望被理论或机制束缚地，位于特定靶/裂解位点下游且在第7部分中被描述的抑制序列包含能够形成降低上游目的蛋白的翻译效率的二级结构的序列。例如，参见图29E。
在本发明的另一个实施方案中，位于特定靶/裂解位点下游且在第7部分中被描述的抑制序列包含紧邻特定靶/裂解位点下游的能够结合紧邻特定靶/裂解位点上游的核苷酸序列以形成二级结构的序列，其中所述二级结构直接或间接地降低上游目的蛋白的翻译效率。在某些实施方案中，前一实施方案中描述的二级结构的折叠自由能可低于-30kcal/mol(例如，-50kcal/mol、-80kcal/mol)且因此，所述二级结构可足以阻碍正在扫描的核糖体到达目的蛋白的终止密码子。在另一个实施方案中，所述特定靶/裂解位点位于前一实施方案中描述的二级结构中的单链区域或环区域内，其中所述单链区域或环区域包括，例如但不限于至少约15个核苷酸长的区域。例如，参见图30A。
7.2.2.可增加在3′端处的特定靶/裂解位点被裂解的外源目的RNA的 翻译效率的另外的结构
本部分描述了第7部分的多个实施方案中描述的本发明的组合物的另外的结构的另外的实施方案，其中这些另外的结构可增加裂解的外源目的RNA的翻译效率，其中所述裂解的外源目的RNA在3′端处的特定靶/裂解位点被裂解。
根据某些实施方案，第7部分中描述的本发明的外源目的RNA可包含，含有紧邻编码目的蛋白的序列上游的独特的内部核糖体进入位点(IRES)序列的序列，其中所述独特的IRES序列可增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率。例如，参见图30B。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA可包含紧邻编码外源目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列包含独特的茎环结构且其中所述独特的茎环结构直接或间接地增加目的蛋白的翻译效率和裂解的外源目的RNA的半衰期。所述独特的茎环结构可包括例如，但不限于人组蛋白基因的3′-UTR的保守茎环结构或其功能性衍生物的结构。例如，人组蛋白基因的3′-UTR的保守茎环结构是5′-GGCUCUUUUCAGAGCC-3′(SEQ ID NO.34)。例如，参见图30C。
在另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA可包含紧邻编码外源目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列包含可直接或间接地增加目的蛋白的翻译效率和裂解的外源目的RNA的半衰期的细胞质多聚腺苷酸化元件。所述细胞质多聚腺苷酸化元件可选自例如但不限于下列的元件：5′-UUUUAU-3′(SEQ ID NO.35)、5′-UUUUUAU-3′(SEQ ID NO.36)、5′-UUUUAAU-3′(SEQ ID NO.37)、5′-UUUUUUAUU-3′(SEQ ID NO.38)、5′-UUUUAUU-3′(SEQ ID NO.39)或5′-UUUUUAUAAAG-3′(SEQ ID NO.40)[25]。本发明的组合物还可包含，例如，编码人细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白(hCPEB)的多核苷酸序列，或其同源物以在任何细胞中表达hCPEB。例如，参见图30D。
在本发明另外的实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA可包含位于特定靶/裂解位点上游和编码目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，其中所述独特的核苷酸序列能够结合位于编码目的蛋白的序列上游的序列。在该实施方案中且不希望被理论或机制束缚地，裂解的外源目的RNA可产生可增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率的环形结构。例如，参见图31A。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分中描述的外源目的RNA可包含位于特定靶/裂解位点上游和编码目的蛋白的序列下游的独特的核苷酸序列，所述独特的核苷酸序列可能够直接或间接地结合能够结合裂解的外源目的RNA中的帽子结构的独特的多肽，其中所述独特的多肽由本发明的组合物编码。在该实施方案中，且不希望被理论或机制束缚地，所述独特的多肽和裂解的外源目的RNA可产生可增加裂解的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率的环形结构。例如，参见图31B。
在另一个实施方案中，第7部分中描述的本发明的组合物可包含另外的多核苷酸序列，其可编码在3′端包含能够结合位于特定靶/裂解位点上游和编码目的蛋白的序列下游的序列的核苷酸序列的另外的RNA分子，其中所述另外的多核苷酸序列的表达由基于聚合酶II的启动子驱动。在该实施方案中，且不希望被理论或机制束缚地，所述另外的RNA分子能够结合裂解的外源目的RNA并为其提供可增加裂解的外源目的RNA中外源目的蛋白的翻译效率的多聚A。例如，参见图31C。
7.2.3.可降低完整的外源目的RNA的翻译效率的另外的结构
本部分描述了第7部分的实施方案中描述的本发明的组合物的另外的结构的另外的实施方案，其中所述这些另外的结构降低本发明的外源目的RNA在被裂解之前的翻译效率。
在本发明的某些实施方案中，第7部分中描述的组合物可包含能够直接或间接地实现本发明的实施方案的外源目的RNA在位于抑制序列下游的位置处裂解的特定裂解组分，其中所述抑制序列位于特定靶/裂解位点下游。所述特定的裂解组分是：
(a)位于外源目的RNA内的特定核酸序列，其中所述特定核酸序列可以是例如：核酸内切酶识别位点、内源性miRNA结合位点、顺式作用型核酶miRNA序列及类似核酸序列；或
(b)由本发明的组合物编码的特定抑制性RNA，其中所述特定抑制性RNA可以是例如微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或核酶。
在该实施方案中，且不希望被理论或机制束缚地，所述特定裂解组分可去除本发明的完整外源目的RNA的多聚A且因此可降低完整的外源目的RNA中目的蛋白的翻译效率。例如，参见图31D。
在某些实施方案中，且不希望被理论或机制束缚地，使用顺式作用型核酶可以是有利的，因为包含其的外源目的RNA可自身裂解[22]。顺式作用型核酶可以是例如，顺式作用型锤头状核酶：snorbozyme[22]和/或N117[23]。
8.本发明的示例性实施方案详述
根据如下详述的某些实施方案，外源目的蛋白可响应于细胞内内源性信号RNA的存在而表达，而无Risc(RNA-诱导的沉默复合物)机制的参与。
根据某些特定的实施方案，提供了用于响应细胞中内源性信号RNA的存在而表达外源目的蛋白的组合物，外源目的蛋白由所述组合物编码，内源性信号RNA是包含预定信号序列的RNA分子，所述预定信号序列是长度为至少18个核苷酸的预定序列且所述组合物可包含一种或多种多核苷酸分子，诸如，例如DNA分子，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在预定裂解位点裂解的功能性RNA的一种或多种多核苷酸序列，其中所述预定裂解位点是预定信号序列的3′端；和
(b)编码外源目的RNA分子的多核苷酸序列，其为主要由下列组成的RNA分子：
(1)第一序列，其与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列位于预定裂解位点上游0-5个核苷酸处并向上游延伸到内源性信号RNA中，其中所述第一序列包含一个或多个起始密码子，其中每个起始密码子主要由5′-AUG-3′组成；和
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；且
其中所述外源目的RNA分子在所述外源目的RNA分子的5′端下游至少约21个核苷酸处包含编码外源目的蛋白的序列；且其中，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，功能性RNA直接或间接地RNA实现外源目的RNA在预定信号序列的3′端的裂解。因此，外源RNA分子与裂解的内源性信号RNA处的边缘序列杂交并将预定信号序列定向到Dicer加工，Dicer加工可裂解外源目的RNA分子，其中每个起始密码子与编码外源目的蛋白的序列分离且外源RNA分子能够被表达。例如，参见图33。
在本发明的某些实施方案中，边缘序列为25-30个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游2个核苷酸处并向上游延伸到内源性信号RNA中，且其中所述第二序列的长度为0个核苷酸，例如在例如图33中所示。
在本发明的另一个实施方案中，至少一个起始密码子位于Kozak共有序列，例如，Kozak共有序列5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)内，例如图34中所示。
在本发明的另外的实施方案中，每个起始密码子位于外源目的RNA分子的5′端下游的0-21个核苷酸处，其中每个起始密码子和编码外源目的蛋白的序列不在同一读码框内。在本发明另外的实施方案中，上述起始密码子中的至少一个位于Kozak共有序列内，诸如，例如，Kozak共有序列5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)。
在某些实施方案中，功能性RNA可以是例如，但不限于：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶或其组合。
在某些示例性实施方案中，所述功能性RNA可以是，例如微小RNA(miRNA)，其中该miRNA和外源目的RNA分子能够位于相同或不同的RNA分子上。在某些实施方案中，该miRNA可位于外源目的RNA分子处的第二序列上游，例如图34中所示。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，前一实施方案可以是有利的因为在该实施方案中，可去除外源目的RNA分子中的帽子结构且因为在该实施方案中，所述组合物仅编码一种RNA分子。
在另一个示例性实施方案中，功能性RNA可以是例如，小干扰RNA(siRNA)，其中siRNA的一条RNA链位于外源目的RNA分子的5′端且siRNA的另一条链由所述组合物通过例如基于聚合酶I或聚合酶III的启动子转录且其中在将所述组合物引入到细胞中后，siRNA的两条链杂交并与外源目的RNA分子分离，例如通过Dicer。例如，这被示出在图35中。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，前一实施方案可能是有利的因为在该实施方案中，功能性RNA和外源目的RNA分子位于同一RNA双链体内，因此外源目的RNA分子可使功能性RNA与内源性信号RNA的预定信号序列靠近，且通过这种靠近可使RNA干扰通路的组分(诸如，例如，Dicer)与预定信号序列靠近。另一优点包括通过Dicer去除外源目的RNA分子的帽子结构。
在本发明的另一个实施方案中，外源目的RNA分子还可包含位于编码目的蛋白的序列上游和每个起始密码子下游的核苷酸序列，其中该核苷酸序列与预定信号序列或与位于外源目的RNA分子的5′端的序列具有足够的互补性，并且能够指导靶特异性RNA干扰。例如，Dicer加工后的Risc加工可用于活化更多的外源目的RNA分子。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物还包含编码能够直接或间接地实现第二序列上游的外源目的RNA分子的裂解的功能性核酸的一种或多种多核苷酸序列，其中所述功能性核酸是：
(a)位于外源目的RNA分子内的特定核酸序列，其中所述特定核酸序列是：核酸内切酶识别位点、内源性miRNA结合位点、顺式作用型核酶和/或miRNA序列；或
(b)由DNA分子编码的抑制性RNA，其中所述抑制性RNA是微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或核酶。
在该实施方案中，功能性核酸可去除完整外源目的RNA的帽子结构以降低来自未裂解的(完整的)外源目的RNA的外源目的蛋白的翻译效率。例如，参见图36A。
在另一个实施方案中，上述第三序列包括编码目的蛋白的序列上游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够结合位于编码目的蛋白的序列下游的序列。在该实施方案中，裂解的外源目的RNA产生可增加裂解的外源目的RNA分子中目的蛋白的翻译效率的环形结构。例如，参见图36B。
在本发明的另一个实施方案中，上文描述的多核苷酸分子还共同包含编码能够直接或间接地实现内源性信号RNA在另外的裂解位点处裂解的另外的功能性RNA的多核苷酸序列，其中所述另外的裂解位点位于预定信号序列的5′端上游0-1000个核苷酸处。例如，参见图21B。在另一个实施方案中，前一实施方案中描述的另外的裂解位点位于预定信号序列的5′端上游0-5个核苷酸处.例如，参见图21B。
9.本发明的另外的实施方案的描述
本部分描述了本发明另外的实施方案，其涉及外源目的RNA响应于细胞中内源性信号RNA的存在的裂解，而不裂解内源性信号RNA。这些实施方案对于例如，病毒来源的内源性信号RNA可能是有用的。
根据某些实施方案，提供了用于响应细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的组合物，所述外源目的RNA由所述组合物编码，所述内源性信号RNA是在5’端处包含预定信号序列的RNA分子，所述预定信号序列的长度为18至25个核苷酸的任何预定序列，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，(诸如，例如DNA和/或RNA分子)，所述一种或多种多核苷酸分子包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含与预定信号序列具有足够的互补性以指导例如，靶特异性RNA干扰的特定序列的RNA分子；
(b)编码载体RNA的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列和载体RNA序列的表达由选自由下列组成的组的启动子驱动：基于聚合酶I的启动子和基于聚合酶III的启动子，其中所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述内源性信号RNA的5′端下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列下游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列上游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；且
其中在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，载体RNA与边缘序列杂交并指导预定信号序列的加工，且然后被加工的预定信号序列可指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶(裂解)位点的裂解。例如，参见图37A。
在另外的实施方案中，提供了用于响应细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的组合物，所述外源目的RNA由所述组合物编码，所述内源性信号RNA是在5’端包含预定信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的预定序列，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子，(诸如，例如DNA分子和/或RNA分子)，所述多核苷酸分子共同包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中所述外源目的RNA是包含与预定信号序列具有足够的互补性以通过例如，靶特异性RNA干扰指导裂解的特定序列的RNA序列；
(b)编码包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的RNA序列的多核苷酸序列，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述内源性信号RNA的5′端下游的0-5个核苷酸处并向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列下游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列上游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；和
(c)编码能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点裂解的功能性核酸的一种或多种核苷酸序列，其中所述载体裂解位点是载体序列的3′端；
其中，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性核酸直接或间接地实现载体RNA序列在载体序列的3′端的裂解，且然后被裂解的载体序列与边缘序列杂交，并指导对预定信号序列的加工，且然后被加工的信号序列指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定裂解/靶位点的裂解。例如，参见图37B。
在本发明的某些实施方案中，上述边缘序列的长度为23-29个核苷酸且可位于内源性信号RNA的5′端下游约23-29个核苷酸处，其中第二序列的长度可为2个核苷酸且其中第三序列的长度可为0个核苷酸。例如，参见图37A、37B。
在另外的实施方案中，提供了用于响应细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的组合物，外源目的RNA由所述组合物编码，内源性信号RNA是在3′端包含预定信号序列的RNA分子，所述预定信号序列是长度为18至25个核苷酸的随机序列，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子(诸如，例如DNA或RNA分子)，所述一种或多种多核苷酸分子共同包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含与预定信号序列具有足够的互补性以通过例如，靶特异性RNA干扰指导裂解的特定序列的RNA序列；
(b)编码载体RNA的多核苷酸序列，其中载体RNA的表达由选自由下列组成的组的启动子驱动：基于聚合酶I的启动子和基于聚合酶III的启动子，所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述内源性信号RNA的3′端上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；且
其中在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中后，载体RNA与边缘序列杂交并指导预定信号序列的加工，且然后被加工的预定信号序列指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定裂解/靶位点的裂解。例如，参见图38A。
根据另外的实施方案，提供了用于响应细胞中内源性信号RNA的存在而裂解外源目的RNA的组合物，外源目的RNA由所述组合物编码，所述内源性信号RNA是在3′端包含预定信号序列的RNA分子，所述预定信号序列是长度为18至25个核苷酸的随机/预定序列，所述组合物包含一种或多种多核苷酸分子(诸如，例如DNA和/或RNA分子)，所述多核苷酸分子共同包含：
(a)编码外源目的RNA的多核苷酸序列，其中外源目的RNA是包含与预定信号序列具有足够的互补性以通过例如，靶特异性RNA干扰指导裂解的特定序列的RNA序列；
(b)编码包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的RNA序列的多核苷酸序列，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述内源性信号RNA的3′端上游的0-5个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)第一序列上游的第二序列，其中第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)第一序列下游的第三序列，其中第三序列的长度为0-7000个核苷酸；和
(c)编码能够直接或间接地实现载体RNA在载体裂解位点裂解的功能性核酸的一种或多种多核苷酸序列，其中载体裂解位点是载体序列的5′端；
其中，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，功能性核酸直接或间接地实现载体RNA序列在载体序列的5′端的裂解，且然后裂解的载体序列与边缘序列杂交，并指导对预定信号序列的加工，且然后被加工的信号序列指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定裂解/靶位点的裂解。例如，参见图38B。
根据某些示例性实施方案中，上述边缘序列为25-30个核苷酸长且可位于内源性信号RNA的3′端上游约2个核苷酸处并向上游延伸到所述内源性信号RNA中，其中第二序列的长度可为0个核苷酸且其中第三序列的长度为0个核苷酸。例如，参见图38A、38B。
根据某些实施方案，上述功能性核酸为：
(a)位于载体RNA序列内的特定核酸序列，且其中所述特定核酸序列可以是例如：核酸内切酶识别位点、内源性miRNA结合位点、顺式作用型核酶、miRNA序列及类似的序列或其组合；或
(b)由多核苷酸分子编码的抑制性RNA，其中所述抑制性RNA为，例如，微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶及其类似的RNA或组合。例如，参见图37B、38B。
根据某些实施方案，上述外源目的RNA位于第三序列处。
根据另外的实施方案，上述外源目的RNA还可包含：
(a)编码外源目的蛋白的序列；和
(b)能够抑制该外源目的蛋白表达的抑制序列；
其中所述特定靶/裂解位点位于抑制序列和编码目的蛋白的序列之间，其中，在将所述组合物引入到包含内源性信号RNA的细胞中之后，外源目的RNA被转录并在特定靶/裂解位点处被裂解，致使抑制序列与编码目的蛋白的序列分离并且目的蛋白能够被表达。
在另一个实施方案中，上述抑制序列可位于特定靶/裂解位点上游，其中所述抑制序列包含多个起始密码子，其中每个起始密码子与编码外源目的蛋白的序列不在同一读码框内，其中每个起始密码子主要由5′-AUG-3′组成，其中至少一个起始密码子位于Kozak序列内。
10.本发明另外的实施方案
本部分定义和描述了任何一个前述部分的任何一个前述实施方案中描述的本发明的组合物的另外的实施方案。
内源性信号RNA可以是例如，但不限于：包含预定信号序列的病毒RNA、细胞RNA，诸如例如，mRNA及类似的RNA。预定信号序列可以是例如，赘生性细胞特有的信号序列、病毒来源的信号序列，及类似序列，或其组合。在某些实施方案中，预定信号序列不包含任何其他类型的能够指导或实现RNA分子在细胞内裂解的内源性RNA分子(诸如，例如，miRNA、shRNA、核酶、stRNA及类似RNA分子)。
根据某些实施方案，本发明的实施方案中可使用的细胞可以是任何来源的任何类型的细胞，诸如例如，但不限于：哺乳动物细胞、鸟类细胞、植物细胞、人细胞、动物细胞及类似的细胞。所述细胞可以是培养的细胞(原代细胞或细胞系)，或生物体或植物中存在的任何细胞。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，例如，诸如在第1部分中描述的，当载体RNA/序列与内源性信号RNA杂交时形成的双链体可以是Dicer的底物。
在某些实施方案中，第1部分的实施方案中描述的边缘序列为23-28个核苷酸长且位于预定裂解位点下游约23-28个核苷酸处，其中所述第二序列的长度为2个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
在另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的边缘序列为25-30个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游2个核苷酸处并向上游延伸到内源性信号RNA中，其中所述第二序列的长度为0个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
在另外的实施方案中，以上第1或9部分中描述的载体RNA或载体序列可被设计为使得当预定信号序列例如被Dicer裂解时形成的双链体在热力学上在预定信号序列的5′端比在预定信号序列的3′端弱。其中加载到Risc上的链是包含预定信号序列的链。
术语“足够的互补性”可包括但不限于：能够结合或至少部分地互补。在某些实施方案中，术语足够的互补性在约30-100％的范围内。例如，在某些实施方案中，术语足够的互补性为至少约30％的互补性。例如，在某些实施方案中，术语足够的互补性为至少约50％的互补性。例如，在某些实施方案中，术语足够的互补性为至少约70％的互补性。例如，在某些实施方案中，术语足够的互补性为至少约90％的互补性。例如，在某些实施方案中，术语足够的互补性为约100％的互补性。
在本发明的一个实施方案中，第1部分中描述的载体RNA多核苷酸序列的表达可由基于聚合酶I的启动子或基于聚合酶III的启动子驱动，所述启动子可以是但不限于：RNA聚合酶III5S启动子、U6启动子、腺病毒VA1启动子、Vault启动子、H1启动子、端粒酶RNA或tRNA基因启动子或其功能性衍生物。
第7、8或9部分中描述的外源目的蛋白可以是任何类型的蛋白质或肽。在某些实施方案中，外源目的蛋白可以是例如，但不限于：α毒素、皂草素、玉蜀黍RIP、大麦RIP、小麦RIP、玉米RIP、黑麦RIP、亚麻RIP、志贺毒素、志贺样RIP、木鳖子甙、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌外毒素A及其修饰形式。在某些实施方案中，外源目的蛋白可以是例如但不限于：蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、白喉毒素片段A或其修饰形式。外源目的蛋白可以是，例如但不限于：酶(诸如例如，萤光素酶)、荧光蛋白、结构蛋白及类似的蛋白。
在本发明的某些实施方案中，外源目的蛋白可以是还可影响相邻细胞的毒素。该毒素可以是例如，但不限于：下列的完整形式：蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素或其修饰形式。在本发明的另一个实施方案中，外源目的蛋白可以是还可杀死相邻细胞的酶。例如，酶可以是，例如但不限于：HSV1胸苷激酶，其中本发明的组合物还可包含前药-更昔洛韦；或大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶，其中本发明的组合物还包含前药-5-氟胞嘧啶(5-FC)。
在本发明的另一个实施方案中，第7、8或9部分中的任何一部分描述的外源目的RNA或中间RNA由病毒载体编码且所述外源目的蛋白是病毒载体复制所必需的基因的产物，其中所述病毒载体响应于细胞内内源性信号RNA的存在而复制并在复制过程中杀死所述细胞。该病毒载体还可以是例如，但不限于当特定分子(例如，TetR-VP16/多西环素)存在于细胞内时能够终止病毒载体复制的基因。因此，当推测病毒载体获得了足以在不包括内源性信号RNA的细胞中复制的突变时，可施用所述特定分子以终止所有病毒载体在体内的复制并然后在体细胞内的大部分病毒载体降解后，可再次施用新的病毒载体。该病毒载体还可包含，当存在特定前药(例如，胸苷激酶/更昔洛韦)时能够杀死细胞的基因，其中当推测病毒载体获得了足以在不包含内源性信号RNA的细胞中复制的突变时，可施用该特定前药以杀死体内的所有病毒载体并然后可再次施用新的病毒载体。
在另一个实施方案中，由本发明的组合物编码的RNA分子由能够以可在复制过程中杀死细胞的方式复制的病毒载体编码。其中，预定信号序列不存在于例如癌细胞中，而存在于特定患者身体的大部分健康细胞或非转性移致肿瘤细胞中，且其中第7、8或9部分中的任何一部分描述的外源目的蛋白是毒素，所述毒素可以是例如，但不限于：蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、白喉毒素片段A或其修饰形式。其中当病毒载体进入健康细胞或非转移性致肿瘤细胞其可杀死该细胞，且当病毒载体进入癌细胞癌细胞时，其在病毒载体复制过程中杀死该癌细胞，因此较大浓度的病毒载体存在于身体的癌症区域。该病毒载体还可包含例如，当特定分子(例如，TetR-VP16/多西环素)存在于细胞内时能够终止病毒载体复制的基因。其中当推测病毒载体获得了足以在包含内源性信号RNA的细胞中复制的突变时，可施用所述特定分子以终止所有病毒载体在体内的复制并然后在体细胞内的大部分病毒载体降解后，可再次施用新的病毒载体。该病毒载体还可包含，例如，当存在特定前药(例如，胸苷激酶/更昔洛韦)时能够杀死细胞的基因，其中当推测病毒载体获得了足以在包含内源性信号RNA的细胞中复制的突变时，可施用该特定前药以杀死体内的所有病毒载体并然后可再次施用新的病毒载体。
在本发明的另一个实施方案中，第1或第9部分中描述的外源目的RNA内的特定序列是多个特定序列且所述特定靶/裂解位点是多个特定靶/裂解位点。其中，对于第7部分中描述的外源目的RNA，其中所述“裂解位点上游”还包括“所有裂解位点上游”且所述“裂解位点下游”还包括“所有特定裂解位点下游”。例如，参见图32A、32B。
在另一个实施方案中，位于第1或第9部分中描述的外源目的RNA内的特定序列是一个或多个特定序列，且特定靶/裂解位点是一个或多个特定靶/裂解位点，且所述外源目的RNA还包含：特定靶/裂解位点下游的编码外源目的蛋白的序列、一个或多个独特序列，其中每个独特序列与预定信号序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNA干扰，其中每个独特序列位于编码外源目的蛋白的序列下游，和2个抑制序列，一个位于所述外源目的RNA的5′端而另一个位于所述外源目的RNA的3′端，其中每个抑制序列能够抑制外源目的蛋白的表达。其中当内源性信号RNA存在于细胞中时，所述两个抑制序列与编码外源目的蛋白的序列分离并且所述外源目的蛋白能够被表达。例如，参见图32C。
在本发明的另一个实施方案中，第1、8或9部分的任一部分中描述的组合物的多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)还可包含编码Dicer或其同源物的多核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，第1或9部分描述的组合物的多核苷酸分子共同包含编码一个或多个RISC组分或其同源物的多核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，第1、8或9部分的任一部分中描述的组合物的多核苷酸分子还可包含编码能够使内源性信号RNA的二级结构在预定信号序列处解螺旋的一种或多种RNA分子的多核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，第1、8或9部分的任一部分中描述的组合物的多核苷酸分子还可包含编码能够直接或间接地抑制内源性核酸外切酶表达的特定功能性RNA的多核苷酸序列。所述特定功能性RNA可以是例如，但不限于：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或核酶。
上述任一实施方案中描述的抑制序列可以是以下序列或者该序列的一部分：其中当其与编码外源目的蛋白的序列分离时，外源目的蛋白能够被表达，且当其未与编码外源目的蛋白的序列分离时，当其处于外源目的RNA中的特定环境中时，其能够抑制外源目的蛋白的表达。其中，抑制序列还可以只是位于其特定环境中的任一种上述抑制序列的一部分。例如，在分别为--UG-3′或--G-3′的背景下，抑制序列可以是单独的A或5′-AU-3′部分，而不是不符合读码框的(out of reading frame)5’-AUG-3’的抑制序列(也就是，外源RNA分子在5′端包含不符合读码框的5’-AUG-3’，但是将分离的序列只是5′-AU-3′部分)。
在另一个实施方案中，第1部分中描述的载体RNA还可以是14-18个核苷酸长。
在另一个实施方案中，第1、8或9部分中的任一部分中描述的第一序列和边缘序列也可以是29-200个核苷酸长，只要当其杂交时形成的双链体不激活细胞内的PKR。
在另外的实施方案中，任一个前述部分中的任一个前述实施方案中描述的***/引入了本发明的组合物的细胞还可以是包含细胞蛋白(诸如，例如，Dicer，Risc)的细胞提取物或体外混合物。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分描述的外源目的RNA还可包含特定靶/裂解位点和编码外源目的蛋白的序列之间的用于亚细胞定位的RNA定位信号(包括共翻译输入)，其中所述抑制序列能够抑制用于亚细胞定位的RNA定位信号的功能，其中外源目的RNA的亚细胞定位是目的蛋白的正确表达所必需的。例如，参见图39A、39B。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分描述的抑制序列包含特定靶/裂解位点上游的起始密码子，其中所述起始密码子主要由5′-AUG-3′组成，其中抑制序列还包含编码紧邻起始密码子下游的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和编码外源目的蛋白的序列在同一读码框内，其中所述氨基酸序列能够抑制用于外源目的蛋白的亚细胞定位的分选信号的功能且其中外源目的蛋白的亚细胞定位是其正确表达所必需的。例如，参见图39C。
在本发明的另一个实施方案中，第7部分描述的外源目的RNA不包含编码外源目的蛋白的序列的起译密码子下游的终止密码子，其中抑制序列位于外源目的RNA内编码外源目的蛋白的序列下游，其中所述抑制序列和编码外源目的蛋白的序列在同一读码框内，其中所述抑制序列编码选自由下列组成的组的氨基酸序列：
(a)能够抑制外源目的蛋白的功能/活性的氨基酸序列；
(b)为用于亚细胞定位的分选信号的氨基酸序列；
(c)为蛋白降解信号的氨基酸序列；
(d)能够抑制用于目的蛋白的亚细胞定位的分选信号的功能的氨基酸序列；以及
(e)能够抑制由位于特定靶/裂解位点和编码外源目的蛋白的序列的起译密码子之间的核苷酸序列编码的肽序列的裂解的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列和编码外源目的蛋白的序列在同一读码框内且其中所述肽序列能够被哺乳动物细胞内的蛋白酶裂解。之前还已报道在人细胞中，在翻译不含终止密码子的截短的mRNA期间，核糖体停止在终止密码子处且相关tRNA分子保持与多肽链和核糖体结合，然而，在翻译过程的中间，肽基-tRNA物质被内质网信号肽酶加工是可能的[37]。例如，参见图39D。
11.本发明的组合物的制备
在本发明的一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的外源目的RNA和功能RNA能够位于相同或不同的RNA分子上。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的外源目的RNA和/或功能RNA能够位于第三序列内。
在本发明的另一个实施方案中，第1部分的实施方案中描述的外源目的RNA、功能RNA、载体RNA和功能性核酸能够位于一种或多种RNA分子上。
在本发明的某些实施方案中，任一个部分的任一个前述实施方案中描述的一种或多种多核苷酸分子包含一种或多种DNA分子。在某些实施方案中，所述一种或多种DNA分子存在于一种或多种DNA载体(诸如，例如，表达载体)和/或病毒载体中。
可通过本领域已知的任何方法将本发明的组合物的多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)重组构建到多种宿主载体***中，所述宿主载体***还可提供多核苷酸分子的大规模复制，且包含指导由本发明的组合物编码的RNA分子转录所需要的元件。使用这些载体转染患者的靶细胞可导致由本发明的组合物编码的RNA分子的足量转录。例如，可将载体引入体内以使得其被细胞吸收并指导这些RNA分子的转录。该载体可保持游离或被整合到染色体中，只要其可转录产生由本发明的组合物编码的期望的RNA分子。这些载体可通过本领域熟知的重组DNA技术方法构建或可通过本领域已知的用于合成DNA分子的任何方法制备。
由本发明的组合物编码的编码RNA分子的重组多核苷酸构建体(诸如，例如，重组DNA构建体)可以是例如，质粒、载体、病毒构建体或本领域已知的用于在合适的靶细胞中复制和表达的其他载体(其可以是，例如，哺乳动物细胞)。这些RNA分子的表达可通过本领域已知的在靶细胞(诸如，例如，哺乳动物细胞，其包括人细胞)中起作用的任何启动子。这些启动子可以是诱导型或组成型的。这些启动子包括，例如但不限于：SV40早期启动子区域、劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复区中包含的启动子、疱疹胸苷激酶的启动子、金属硫蛋白基因的调控序列、病毒CMV启动子、人绒毛膜促性腺素-β启动子及类似的启动子。在某些实施方案中，启动子可以是RNA聚合酶I启动子(即，RNA Pol.I识别的启动子)，诸如，例如核糖体DNA(rDNA)基因的启动子。在这些实施方案中，外源目的RNA分子的终止信号可以是RNA Pol.I终止信号或RNA聚合酶II终止信号(诸如，例如，多聚A信号)。任何类型的质粒、黏端质粒、YAC或病毒载体可用来制备可被直接引入靶组织/细胞部位的重组多核苷酸构建体。可选择地，可以使用选择性地感染期望的靶细胞的病毒载体。
对于抵抗病毒感染的转基因生物体的形成，期望编码由本发明的组合物编码的RNA分子的载体将具有选择标志。可使用几种选择***，包括但不限于对单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶蛋白质分别在tk-、hgprt-或aprt-缺陷型细胞中的表达的选择。另外，抗代谢物抗性可用作提供对氨甲喋呤的抗性的二氢叶酸转移酶(dhfr)、提供对霉酚酸的抗性的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)、提供对氨基糖苷G-418的抗性的新霉素(neo)和提供对潮霉素的抗性的潮霉素B磷酸转移酶(hygro)的选择的基础。
用于本发明的实践中的载体包括任何真核表达载体。在本发明的某些实施方案中，由本发明的组合物编码的RNA分子由病毒表达载体编码。病毒表达载体可以是例如，但不限于属于下列病毒科的载体：疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、***瘤病毒科(Papillomaviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本扬病毒科(Bunyaviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、或丙型肝炎病毒属(Hepaciviridae)。病毒表达载体还可包括但不限于其细胞趋向性已通过取代被暴露于纤维表面的纤维蛋白的腺病毒末端结状结构域(HI环)而被改变的腺病毒载体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物可包含由该组合物编码的RNA分子，其单链或双链衍生物或修饰形式。由本发明的组合物编码的这些RNA分子可以是例如，但不限于脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、磷酸二酯键、修饰的键或除了五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基。
由本发明的组合物编码的RNA分子可通过本领域已知的用于合成RNA分子的任何方法制备。例如，这些RNA分子可使用市售的试剂和合成仪通过本领域熟知的方法化学合成。可选择地，这些RNA分子可通过体外和体内转录编码这些RNA分子的DNA序列产生。这些DNA序列可被整合到包括合适的RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的各种各样的载体中。这些RNA分子可通过使用质粒例如SPS65经体外转录高产量地产生。另外，RNA扩增方法例如Q-β扩增可用来产生外源RNA分子。
多核苷酸分子，例如，DNA分子和/或RNA分子，和/或由本发明的组合物编码的RNA分子可在例如碱基部分、糖部分或磷酸骨架处被修饰，以改善分子的稳定性、杂交、向细胞内的运输等。另外，可进行修饰以减少对核酸酶降解的易感性。本发明的多核苷酸分子和/或由所述的组合物编码的RNA分子可包括任何其他侧基诸如，例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)或有助于穿过细胞膜或血脑屏障运输的剂、杂交触发的裂解剂或嵌入剂。可引入多种其他熟知的修饰作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于，向分子的5′和/或3′端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列。在期望增加的稳定性的某些实施方案中，可优选具有修饰的核苷酸间键例如2′-O-甲基化的核酸。包含修饰的核苷酸间键的核酸可使用本领域熟知的试剂和方法合成。
所述组合物中的多核苷酸分子和/或由本发明的组合物编码的RNA分子可通过如本领域熟知的任何合适的手段(诸如，例如反相色谱或凝胶电泳)纯化。
产生共同编码由本发明的组合物编码的RNA分子的病毒载体的细胞也可用于被移植到患者体内以持续治疗。这些细胞还可携带如果特定分子(例如，HSV1胸苷激酶/更昔洛韦)被引入到患者的循环***则可杀死它们的特定基因。
在一个实施方案中，由本发明的组合物编码的每一个RNA分子可以是RNA分子或复制性RNA分子。其中复制性RNA分子是包含与这些RNA分子中的任何一种互补的序列的RNA分子，其中所述复制性RNA分子能够在细胞内被复制以形成这些RNA分子中的任何一种。
在另一个实施方案中，由本发明的组合物编码的每个RNA分子可通过各种类型制备，包括但不限于：合成的RNA、具有修饰的碱基的合成的RNA、通过体外转录产生的RNA、编码RNA分子的DNA分子、编码RNA分子的载体或病毒载体或编码RNA分子的具有修饰的碱基的DNA。例如，功能性RNA可以是合成的siRNA而外源目的RNA可由病毒载体编码且同时载体RNA可由质粒编码。
12.本发明的组合物的用途和使用
本发明的组合物可用于多种应用中，包括，但不限于：调控基因表达、靶向细胞死亡、治疗和/或预防多种疾病和健康相关的病症(诸如，例如增生性疾患(例如癌症)、传染病及类似疾病)、多种健康相关的病症的诊断、转基因生物体的形成、***式基因治疗及类似的应用。在一个示例性实施方案中，本发明的组合物可用来激活包含病毒RNA的细胞中的毒性基因以杀死这些细胞。在另一个示例性实施方案中，本发明的组合物可用来激活包括内源性mRNA的细胞中的毒性基因以靶向并特异性地杀死这些细胞，所述内源性mRNA包含癌细胞特有的预定信号序列。
根据某些实施方案，提供了用于杀死特定细胞/细胞群的方法，其中所述细胞群包含含有对这些细胞独特且特异的预定信号序列的内源性信号RNA；所述方法包括向细胞引入含有本发明的组合物，其中所述组合物包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸用于指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点的特异性裂解，所述特定序列具有与预定信号序列杂交的足够的互补性，其中外源目的RNA的裂解导致能够杀死这些细胞的外源目的蛋白的表达。
根据某些实施方案，所述外源目的蛋白可选自，但不限于：可破坏细胞功能并因此导致细胞死亡的任何类型的蛋白质。所述蛋白质可选自诸如，但不限于以下类型的蛋白质：毒素、细胞生长抑制剂、细胞生长调节剂、细胞信号通路抑制剂、细胞信号通路调节剂、细胞通透性调节剂、细胞过程调节剂(modulators of cellular processes)及类似的蛋白质。
根据某些实施方案，且不希望被理论或机制束缚地，本发明的组合物和方法可在细胞中提供特异性且靶向的“全部或无(all or none)”反应。换句话说，本发明的组合物和方法使得外源目的RNA仅在包括特定内源性信号RNA的那些靶细胞中被裂解(并且因此，表达并活化外源目的蛋白)，而不包括所述内源性信号RNA的细胞将不能被本发明的组合物所作用。因此本发明的组合物和方法可提供增加的安全性和控制，因为在不包括含有预定信号序列的内源性信号RNA的细胞中没有观察到外源目的蛋白的遗漏表达(leakiness in expression)。
在另外的实施方案中，本发明的组合物可用来病毒RNA的存在下激活报告基因以用于诊断病毒感染性疾病。在另一个实施方案中，本发明的组合物可用来稳定地转染细胞以形成抵抗病毒感染的转基因生物体。在另一个实施方案中，本发明的组合物可用来稳定地转染细胞以形成能够在病毒RNA的存在下活化报告基因用于诊断病毒感染性疾病的转基因生物体。在又一个实施方案中，本发明的组合物可用来实时地监控细胞中RNA序列的变化。
多种递送***和方法是本领域熟知的，其可用来将本发明的组合物转移/引入/转染到靶细胞中。多种递送***和方法包括例如，使用多种转染剂、包封在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达所述组合物的重组细胞、受体介导的内吞、将本发明的组合物构建为病毒载体或其他载体的一部分、能够被复制而在复制过程中不杀死细胞并且包含本发明的组合物的病毒载体、不能复制且包含本发明的组合物的病毒载体、注射产生包含本发明的组合物的病毒载体的细胞、注射DNA、电穿孔、磷酸钙介导的转染以及类似方法，或已知的或未来待开发的任何其他合适的递送***。
在某些实施方案中，本发明还提供了包含有效量的本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。术语“药学上可接受的”是指被联邦或州政府的监管机构批准或美国药典或其他公认的药典被列为用于动物且更特别地人中。短语“药学上可接受的运载体(Pharmaceutically acceptablecarrier)”中的术语“运载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物可被局部施用到需要治疗的靶区域。这可通过例如且不限于：手术期间的局部输注、局部敷用(例如，与手术后的伤口敷料结合、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物实现，所述植入物是有孔的、无孔的或凝胶材料，包括膜例如硅橡胶膜(sialastic membranes)或纤维。局部施用还可通过控释药物递送***，例如纳米颗粒、基质例如控释聚合物或水凝胶实现。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以以在靶细胞中有效地产生期望作用的量施用。本发明的组合物的有效剂量可通过本领域技术人员熟知的解答诸如生物半衰期、生物利用率和毒性的参数的程序确定。本发明的组合物的有效量取决于被治疗的疾病或疾患的性质且可通过标准临床技术确定。另外，体外测定可任选地用来帮助确定最佳剂量范围。施用方法还可包括但不限于对患者的血流持久或连续地注射本发明的组合物。
根据某些实施方案，本发明还提供了包含填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一种或多种容器的药包或药盒，与所述容器可选地连接的可以是由监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示，该告示反映了得到机构针对人或动物施用的制造、使用或销售的许可。
实施例
下列实施例被示例性而非限制性地提供并且是本发明的最佳实施方案的实施例。
实施例1：本发明的组合物杀死特定患者的癌细胞的用途
根据美国癌症协会，2007年期间，世界上760万人死于癌症。
在本实施例中本发明的组合物被设计成特异性地杀死特定患者的癌细胞。为特定患者设计本发明的组合物的第一步是鉴定预定信号序列，该预定信号序列是该特定患者的癌细胞中存在的内源性RNA分子的长18-25个核苷酸的序列，其中在该特定患者身体的健康细胞或非转移性致肿瘤细胞的任何内源性RNA分子中不存在该预定信号序列。因此，该预定信号序列是在癌细胞中突变的基因的RNA序列。平均每种肿瘤包含90种编码蛋白质的基因中的突变[16]并且每种肿瘤始于单个的生成细胞[38]，因此需要鉴定在癌细胞中它们中的唯一被转录成RNA分子的那个基因。
多种方法可用于鉴定该预定信号序列；这些方法包括，但不限于：DNA微阵列、Tilling(靶向诱导的基因组中的局部病变)和癌症基因组的大规模测序。此外，预定信号序列的鉴定可利用癌症基因组Atlas项目，该项目已经将由于其基因突变而造成癌症的基因编成目录。
在本实施例中，特定患者的癌细胞所特有的预定信号序列是：5’-UAUUAUUAUCUUGGCCGCCCG-3’(SEQ ID NO.41)并且位于内源性mRNA(SEQ ID NO.42)内。因此，在本实施例中，本发明的组合物被设计为杀死包含含有序列5’-UAUUAUUAUCUUGGCCGCCCG-3’(SEQ IDNO.41)的mRNA的细胞。本实施例中的功能性RNA(SEQ ID NO.43)是被设计为实现预定信号序列的5’端裂解的shRNA。被Dicer加工后形成的与内源性mRNA杂交的裂解的shRNA部分的序列以SEQ ID NO.44列出。功能性RNA在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录。shRNA的5’端处的G和3’端处的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。例如，参见图40。已经报道在细胞中，裂解的mRNA的两个部分中的每个部分的功能半衰期仅比完整的mRNA减少2.6-1.7倍[10]。还已经报道，已被细胞中的RISC-RNA复合物裂解的mRNA的两个部分可通过Northern分析容易地检测[6]。
本实施例中的载体RNA被设计成在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录并被设计成包括序列3’-UUAUAAUAAUAGAACCGGCGGGCGGUG-5’(SEQ ID NO.45)，载体RNA的5’端处的G和3’端处的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。在细胞中，载体RNA与包括预定信号序列的裂解的mRNA部分(SEQ ID NO.46)杂交，且在被Dicer加工后，所形成的双链体在预定信号序列的5’端热力学上较弱，因此，预定信号序列是负载到Risc中的链[3]。例如，参见图40。Dicer加工之后形成的裂解的载体RNA部分的序列以SEQ ID NO.47列出。
已报道，在细胞中，在5’端具有长度约19个核苷酸的互补区的长度约23个核苷酸的两种RNA转录物彼此杂交并能够指导靶特异性RNA干扰[7]。还已报道，在一个3’端还包含长20个核苷酸的ssRNA的长52个核苷酸的dsRNA在平端处是Dicer的底物[8]。此外，还已经报道，在哺乳动物中，Risc与Dicer偶联[9]。
本实施例的外源目的RNA的特定序列被设计为包含与预定信号序列100％互补的序列：5’-CGGGCGGCCAAGAUAAUAAUA-3’(SEQ IDNO.48)。例如，参见图40。外源目的RNA还被设计为包含特定序列下游的编码白喉毒素片段A(DT-A)的序列。外源目的RNA被设计为在强的病毒CMV启动子的控制下转录。例如，参见图40。
已报道被引入到细胞内的单个分子的白喉毒素片段A可杀死该细胞[14]且在哺乳动物细胞中，去除帽子使mRNA的翻译仅降低35-50倍并使功能性mRNA的半衰期仅降低1.7倍[10]。
外源目的RNA还被设计为包含特定序列上游的抑制序列，所述抑制序列包含3个起始密码子，其中的2个位于人Kozak共有序列：5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)内且其中的每一个与DT-A的起译密码子不在同一读码框内。例如，参见图40。
外源目的RNA还被设计为在5’端包含非常有效的顺式作用型锤头状核酶-N117[23]以在本发明的外源目的RNA被裂解之前降低该外源目的RNA的翻译效率。顺式作用型锤头状核酶-N117还包含2个起始密码子，但是其中的每一个与DT-A的起译密码子都不在同一读码框内。例如，参见图40。本实施例的外源RNA的全部序列以SEQ ID NO.49列出。
在本实施例中，功能性RNA、载体RNA和外源目的RNA被病毒载体所转录。例如，参见图40。
其中，在细胞中，病毒载体转录：功能性RNA、载体RNA和外源目的RNA。外源目的RNA中的顺式作用型核酶N117去除5’端的帽子以降低对外源目的RNA的任何翻译且不符合读码框的起始密码子阻止DT-A的翻译。功能性RNA(shRNA)实现预定信号序列的5’端的裂解。载体RNA与包含预定信号序列的裂解的mRNA部分杂交且预定信号序列被Dicer加工并负载到Risc上。Risc-信号序列复合物在特定序列处裂解外源目的RNA，并且不符合读码框的起始密码子分离，使得DT-A表达至少一次，所述至少一次足以导致细胞死亡。例如，参见图40。本实施例的裂解的外源RNA的序列以SEQ ID NO.50列出。
实施例2：本发明的组合物杀死EBV-相关的胃癌癌细胞、鼻咽癌癌细胞、伯基特淋巴瘤癌细胞和霍奇金淋巴瘤癌细胞的用途
爱波斯坦巴尔病毒(EBV)是普遍的人γ疱疹病毒，γ疱疹病毒在初次感染后在B淋巴细胞中建立终生性潜伏感染。EBV感染全世界的大多数人群并涉及多种人恶性肿瘤，包括伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌(NPC)的发病机理[32]。EBV感染的主要特征是表达包括EBNA1、LMP1、LMP2和EBER的晚期基因[32]。LMP1(潜伏膜蛋白1)是被发现为由于其致癌潜力而能够转化细胞系并改变细胞表型的第一个EBV潜伏基因[32]。在人上皮细胞中，LMP1改变参与肿瘤进展和侵入的许多功能特性[32]。
在本实施例中，本发明的组合物被设计为通过使用LMP1mRNA作为内源性信号RNA并通过使用序列：5′-CUCUGUCCACUUGGAGCCCUU-3′(SEQ ID NO.51-LMP1mRNA的核苷酸269-289)作为预定信号序列杀死伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌的被EBV潜伏感染的癌细胞。例如，参见图41。LMP1mRNA的核苷酸255-304还被示出在附图中并被以SEQ ID NO.52列出。选择该预定信号序列是因为其位于不具有RNA二级结构的区域且因为其位于已被表明为siRNA的好的靶的区域[33]。另外，选择该预定信号序列还因为其裂解产生长289个核苷酸的相对短的RNA分子。
在本实施例中，载体序列和功能性RNA位于在细胞内杂交的同一RNA双链体内，其中所述双链区位于载体序列的5’端且其中，当双链区被Dicer加工时，载体序列与RNA双链体分离且所形成的siRNA双链体是功能性RNA并能够实现LMP-1的mRNA在预定信号序列的3’端的裂解。RNA双链体的2条链是：3′-UUCUCUGGAAGAGACAGGUGAACCUCGGGAACCUCGGGAAACAUAUGAGG-5′(SEQ ID NO.53)和5′-GGAGCCCUUUGUAUACUCCUU-3′(SEQ ID NO.54)。由于RNA双链体的这2条链在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录，因此其5’端是G而其3’端是UU。例如，参见图41。能够与LMP-1的mRNA杂交并实现其在预定信号序列的3’端的裂解的裂解链的序列(在Dicer加工后)以SEQ ID NO.55列出。
当LMP-1的mRNA在预定信号序列的3’端裂解时，载体序列(SEQ IDNO.56)将预定信号序列定向到Dicer加工且所形成的双链体在预定信号序列的5’端处热力学上较弱，因此预定信号序列将是被加载到Risc的链[3]。例如，参见图41。第二条链的序列，即，被Dicer加工后裂解的载体序列以SEQ ID NO.57列出。
本实施例的外源目的RNA的特定序列被设计为包含与预定信号序列100％互补的序列：3’-GAGACAGGUGAACCUCGGGAA-5’(SEQ IDNO.58)。该外源目的RNA还被设计为包含所述特定序列下游的编码白喉毒素(DT)的序列。该外源目的RNA被设计为在强的病毒CMV启动子的控制下转录。该外源目的RNA还被设计为包含所述特定序列上游的抑制序列。该抑制序列包含位于人Kozak共有序列5′-ACCAUGG-3′(SEQ IDNO.25)内的2个起始密码子且其中的每一个都不与DT的起译密码子位于同一读码框内。该外源目的RNA被设计为在5’端包含非常有效的顺式作用型锤头状核酶-snorbozyme[22]以在本发明的外源目的RNA被裂解之前降低其翻译效率。顺式作用型锤头状核酶-snorbozyme也包含2个起始密码子，然而其中的每一个都不与DT的起译密码子位于同一读码框内。该外源目的RNA还被设计为包含所述特定序列下游和编码DT的序列上游的23个核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够结合位于编码DT的序列下游的23个核苷酸的序列，其中该外源目的RNA形成环形结构，特别是当外源目的RNA被裂解时，该环形结构增加DT的翻译效率。例如，参见图41。本实施例的外源RNA的完整序列以SEQ ID NO.59列出。
在本实施例中，RNA双链体的两条链和外源目的RNA由病毒载体(参见图41)转录。其中，在细胞中，病毒载体转录：RNA双链体的两条链和外源目的RNA。外源目的RNA中的顺式作用型核酶snorbozyme去除5’端的帽子结构以降低对外源目的RNA的任何翻译且不符合读码框的起始密码子阻止DT的翻译。RNA双链体的两条链彼此杂交并与预定信号序列在LMP-1mRNA处杂交，RNA双链体的双链区被Dicer裂解并形成为siRNA的功能性RNA和载体序列。siRNA在3’端处裂解预定信号序列而载体序列将被裂解的预定信号序列定向到Dicer加工。被加工的预定信号序列被加载到Risc中，并且接下来，Risc-信号序列复合物在特定序列处裂解外源目的RNA且不符合读码框的起始密码子分离，使得DT能够表达。本实施例的裂解的外源RNA的序列以SEQ ID NO.60列出。包含编码DT的序列的RNA部分形成环形结构，该环形结构增加DT翻译以杀死癌细胞和相邻的细胞。例如，参见图41。
在本实施例中，功能性RNA和载体序列位于同一RNA双链体内，因此，载体序列可使功能性RNA与预定信号序列靠近并且通过这种靠近还可使RNA干扰通路的组分(例如，Dicer和Risc)与预定信号序列靠近。
实施例3：本发明的组合物杀死HIV-1感染细胞的用途
根据世界卫生组织，在2006年，全世界有约3950万人患HIV。根据***关于HIV和AIDS的项目的当前估计，推定在非洲9千万人感染HIV。HIV(人免疫缺陷病毒)可导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。两类HIV感染人：HIV-1和HIV-2。HIV-1更为烈性，相对容易传播且是全球大多数HIV感染的病因。HIV-2较HIV-1不太容易传播且主要局限于西非。
包括HIV的许多病毒显示出进行极少的蛋白质合成或不进行蛋白质合成的休眠期或潜伏期。在这些阶段期间，病毒感染对于免疫***基本上是不可见的。目前的抗病毒治疗方案在消除潜伏病毒的细胞贮量方面大部分是无效的[15]。
在本实施例中，本发明的组合物被设计为通过使用HIV-1mRNA作为内源性信号RNA并通过使用序列：5′-UACCAAUGCUGCUUGUGCCUG-3′(SEQ ID NO.61-HIV-1mRNA的核苷酸8492-8512)作为预定信号序列杀死HIV-1感染细胞。例如，参见图42。HIV-1mRNA的核苷酸8477-8527还被示出在附图中并被以SEQ IDNO.62列出。选择该预定信号序列是因为其位于不具有RNA二级结构的区域且因为其位于已被表明为siRNA的好的靶的区域[34]。
本实施例的外源目的RNA在强的病毒CMV启动子的控制下转录并被设计为包含2个特定序列，其中它们中的每一个是：与预定信号序列100％互补的3’-AUGGUUACGACGAACACGGAC-5’(SEQID NO.63)。该外源目的RNA还被设计为在2个特定序列之间包含编码白喉毒素片段A(DT-A)的序列。在哺乳动物细胞中，被引入到细胞中的单个分子的白喉毒素片段A可杀死该细胞[14]。该外源目的RNA还被设计为包含2个抑制序列，一个在5’端，而另一个在3’端。位于外源目的RNA的5’端的抑制序列被设计为包括3个起始密码子，其中它们中的一个位于人Kozak共有序列：5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)内，其中它们中的每一个都不与DT-A的起译密码子位于同一读码框内，且其中所有3个起始密码子位于同一读码框内。位于外源目的RNA的5’端的抑制序列还包含3个起始密码子下游和2个特定序列上游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与所述3个起始密码子位于同一读码框内且其中所述核苷酸序列编码用于亚细胞定位的分选信号，所述分选信号是人烷基磷酸二羟基丙酮合酶的过氧化物酶体靶向信号2(H2N---RLRVLSGHL-SEQ ID NO.27)[30]。在哺乳动物细胞中，具有用于亚细胞定位的分选信号的蛋白质当与其mRNA一起翻译时可定位到该亚细胞位置。例如，参见图42。
位于外源目的RNA的3’端的抑制序列被设计为包括2个特定序列下游的内含子，其中该外源目的RNA是无义介导的衰变(NMD)的靶，所述无义介导的衰变(NMD)降解包含编码序列下游的内含子的RNA分子[31]。内含子包含2个人工微小RNA，所述2个人工微小RNA被设计为实现预定信号序列在5’端和3’端的裂解(分别是SEQ ID NO.64和65)[35]。位于外源目的RNA的3’端的抑制序列在3’端还包含刺激外源目的RNA降解的富含AU的元件(ARE)。所述富含AU的元件长47个核苷酸，且其包含序列：5′-AUUUA-3′(SEQ ID NO.31)和5′-UUAUUUA(U/A)(U/A)-3′(SEQ ID NO.32)[28]。例如，参见图42。本实施例的外源RNA的完整序列由SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.113和其间的包含上述两个人工微小RNA的内含子构成。本实施例中的载体RNA被设计为在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录并被设计为包括序列：3’-UUAUGGUUACGACGAACACGG-5’(SEQ ID NO.67)，位于载体RNA的5’端的G和位于其3’端的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。在细胞中，本发明的载体RNA可与裂解的预定信号序列杂交且所形成的双链体在预定信号序列的5’端处热力学上较弱，因此，预定信号序列是被加载到Risc中的链[3]。例如，参见图42。
在本实施例中，载体RNA和外源目的RNA由病毒载体转录。其中，在细胞中，病毒载体转录：载体RNA和外源目的RNA。不符合读码框的起始密码子阻止DT-A的翻译，且过氧化物酶体靶向信号2将错误的蛋白质和外源目的RNA输送至过氧化物酶体。内含子靶向外源目的RNA以被无义介导的衰变(NMD)降解且富含AU的元件也刺激外源目的RNA的降解。在细胞中存在HIV-1mRNA时，所述两个微小RNA在5’端和3’端处裂解预定信号序列且载体RNA与裂解的预定信号序列杂交，且该信号序列可被加载到Risc中。然后，Risc-信号序列复合物可在两个特定序列处裂解外源目的RNA，且所有抑制序列分离，使得DT-A表达至少一次，所述至少一次足以导致细胞死亡。例如，参见图42。本实施例的裂解的外源RNA以SEQ ID NO.68列出。
在本实施例中，预定信号序列从其两端裂解，且由此通过载体RNA，其成为Dicer或Risc更好的底物。
病毒载体还可编码能够增强HIV-1感染细胞中HIV-1mRNA转录的转录因子(例如，NF-κB)。该病毒载体还可编码能够阻止新的HIV-1颗粒产生的基因(例如，阻止HIV-1mRNA剪接的Rev)。
实施例4：本发明的组合物杀死hsv-1感染的细胞的用途
包括HSV-1(单纯疱疹病毒-1)的许多病毒显示出进行极少的蛋白质合成或不进行蛋白质合成的休眠期或潜伏期。在这些阶段期间，病毒感染对于免疫***基本上是不可见的。目前的抗病毒治疗方案在消除潜伏病毒的细胞贮量方面大部分是无效的[15]。单纯疱疹病毒-1(HSV-1)的潜伏相关的转录物(LAT)是神经元潜伏感染期间表达的唯一病毒基因。LAT抑制凋亡并通过促使被感染的神经元存活维持潜伏。没有归属至LAT基因的蛋白质产物。
在本实施例中，本发明的组合物被设计为通过使用潜伏相关的转录物(LAT)作为内源性信号RNA并通过使用序列：5′-AAGCGCCGGCCGGCCGCUGGU-3′(SEQ ID NO.69-HSV-1的潜伏相关的转录物的核苷酸108-128)作为预定信号序列杀死HSV-1感染细胞。例如，参见图43。HSV-1LAT mRNA的核苷酸101-140还被示出在附图中并被以SEQ ID NO.70列出。选择该预定信号序列是因为其裂解产生长128个核苷酸的相对短的RNA分子。例如，参见图43。
在本实施例中，载体序列和功能性RNA位于由RNA聚合酶III U6启动子转录的同一茎环结构(SEQ ID NO.71)内。其中，当该茎环结构被Dicer加工时，载体序列(SEQ ID NO.72)与茎环结构分离，且所形成的siRNA双链体是功能性RNA，其能够实现LAT在预定信号序列的3’端处的裂解。所形成的siRNA双链体的两条链的序列以SEQ ID NO.73和74列出。包含预定信号序列的裂解的LAT部分的序列以SEQ ID NO.75列出。茎环结构的5’端处的G和其3’端处的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。
在细胞中，载体序列与包含预定信号序列的裂解的LAT部分杂交，并且在被Dicer加工后，所形成的双体在预定信号序列的5’端处热力学上较弱，因此，预定信号序列将是将被加载到Risc中的链[3]。例如，参见图43。
本实施例的外源目的RNA在强的病毒CMV启动子的控制下转录并被设计为包含2个特定序列，其中它们中的每一个是：与预定信号序列100％互补的5’-ACCAGCGGCCGGCCGGCGCUU-3’(SEQ ID NO.76)。该外源目的RNA还被设计为在2个特定序列之间包含编码白喉毒素(DT)的序列。该外源目的RNA还被设计为包含2个抑制序列，一个在该外源目的RNA的5’端，而另一个在该外源目的RNA的3’端。位于外源目的RNA的5’端的抑制序列被设计为包括3个起始密码子，其中它们中的2个位于人Kozak共有序列：5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)内，其中它们中的每一个都不与DT的起译密码子位于同一读码框内。位于外源目的RNA的3’端的抑制序列被设计为包含2个特定序列下游的翻译阻遏物smaug识别元件(SRE)：5′-UGGAGCAGAGGCUCUGGCAGCUUUUGCAGCG-3′(SEQ ID NO.28)。例如，参见图43。Smaug1被编码在人14号染色体中且能够抑制包含SRE的信使的翻译[26，27]。鼠源Smaug1表达在脑中并在突触神经小体的由突触刺激紧密调控翻译的一个亚细胞区域中丰富[26]。位于外源目的RNA的3’端的抑制序列在3’端还包含用于髓鞘化外周的RNA定位信号(A2RE-核的核糖核蛋白A2响应元件)：5′-GCCAAGGAGCCAGAGAGCAUG-3′(SEQ ID NO.29)[29]。例如，参见图43。A2RE是位于MBP(髓鞘碱性蛋白)mRNA的3′-不翻译区的顺式作用序列并且对于MBP mRNA输送至少突胶质细胞的髓鞘化外周是足够且必需的[29]。hnRNP(核不均一核糖核蛋白)A2结合A2RE并调节MBP的运输[29]。
本实施例的外源目的RNA还包括紧邻编码DT的序列下游的细胞质多聚腺苷酸化元件(CPE)。CPE包含紧邻编码DT蛋白的序列下游的序列5’-UUUUUUAUU-3’(SEQ ID NO.38)和编码DT的序列下游91个核苷酸处的序列5’-UUUUAUU-3’(SEQ ID NO.39)[25]。例如，参见图43。在哺乳动物中，CPEB(细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白)存在于海马(脑负责长时记忆的区域)的树突层[36]。在哺乳动物海马神经元的突触-树突区室，CPEB呈现为通过多聚腺苷酸化引发的翻译刺激包含CPE的α-CaMKIImRNA的翻译[36]。本实施例的外源目的RNA的完整序列以SEQ IDNO.77列出。
在本实施例中，外源目的RNA和茎环结构由病毒载体转录。其中在外源目的RNA和茎环结构的转录之后，不符合读码框的起始密码子阻止DT的翻译，Smaug1(翻译阻遏物)结合smaug识别元件(SRE)并抑制DT翻译且hnRNP A2结合A2RE并调节RNA分子向髓鞘化外周的运输。相应地，茎环结构被Dicer加工，使得载体序列与茎环结构分离且所形成的siRNA双链体是功能性RNA，且接下来，功能性RNA实现LAT在预定信号序列的3’端的裂解。接下来，载体序列与包含预定信号序列的LAT部分杂交，并且预定信号序列被Dicer加工并被加载到Risc中。接下来，Risc-信号复合物在2个特定序列处裂解外源目的RNA且所有抑制序列分离，使得CPEB(细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白)结合CPE并刺激多聚-A尾巴在裂解的外源目的RNA中延伸，使得DT能够表达并杀死该细胞及相邻细胞。例如，参见图43。本实施例的裂解的外源RNA的序列以SEQ ID NO.78列出。
在本实施例中，功能性RNA和载体序列位于同一RNA分子中，该RNA分子需要较少的转录单元。功能性RNA和载体序列靠近的主要优点在于它们在细胞中的同一位置并且在同一时间且还以恒定的比例产生。
实施例5：本发明的组合物杀死特定患者的癌细胞的用途
在本实施例中，本发明的组合物被设计为杀死特定患者的癌细胞。
如实施例1中所述，设计针对特定患者的本发明的组合物的第一步是鉴定预定信号序列，预定信号序列是存在于该特定患者的癌细胞中的RNA分子的长18-25个核苷酸的序列，其中，该预定信号序列在该特定患者身体的健康细胞或非转移性致肿瘤细胞的任何RNA分子中不存在。因此，预定信号序列是在癌细胞中被突变的基因的RNA序列。平均地，每种肿瘤包含90种蛋白质编码基因中的突变[16]且每种肿瘤源自单个生成细胞[38]，因此存在鉴定在癌细胞中它们中的唯一被转录成RNA分子的那个基因的需要。各种方法可用于鉴定该预定信号序列；这些方法包括但不限于：DNA微阵列、Tilling(靶向诱导的基因组中的局部损伤)和癌基因组的大规模测序。此外，信号序列的鉴定可利用癌症基因组Atlas项目，该项目已将造成癌症的所有基因突变按其基因编成目录。
在本实施例中，特定患者的癌细胞所特有的预定信号序列是：5’-AAUUAAGUUUAUGAACGGGUC-3’(SEQ ID NO.79)且位于内源性mRNA中。因此，在本实施例中，本发明的组合物被设计为杀死包含内源性mRNA(如内源性信号RNA)的细胞，该内源性mRNA包含序列5’-AAUUAAGUUUAUGAACGGGUC-3’(SEQ ID NO.79)。包含所述预定信号序列的示例性的内源性mRNA示出在图44中并以SEQ ID NO.80列出。
本实施例中的功能性RNA是Rz-B，一种锤头型核酶(SEQ ID NO.81)[21]，该锤头型核酶被设计为实现预定信号序列的3’端的裂解。包含裂解后的预定信号序列的示例性的内源性mRNA的序列以SEQ ID NO.82列出。锤头型核酶Rz-B在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录。锤头型核酶Rz-B的5’端处的G和3’端处的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。例如，参见图44。已报道在细胞中，裂解的mRNA的两个部分中的每一个的功能半衰期与完整的mRNA比减少仅2.6-1.7倍[10]。还已报道已被细胞中的RISC-RNA复合物裂解的mRNA的两个部分可通过Northern分析容易地检测[6]。
本实施例的载体序列是：5′-CCCGUUCAUAAACUUAAUUAACCGGUC-3′(SEQ ID NO.83)并且103个连续的载体序列位于在强的病毒CMV启动子的控制下转录的RNA序列中。其中Rz-A，一种锤头型核酶(SEQ ID NO.84)[21]被设计为实现位于该RNA序列的5’端的载体序列的3’端的裂解。锤头型核酶Rz-A在RNA聚合酶III的非常强的U6启动子的控制下转录。锤头型核酶Rz-A的5’端处的G和3’端处的UU是RNA聚合酶III的U6启动子转录所必需的。例如，参见图44。
在细胞中，锤头型核酶Rz-A使多至101个完整的载体序列与1个RNA序列分离。分离的载体序列与包含预定信号序列的裂解的mRNA部分杂交，且在Dicer加工后，所形成的双链体在预定信号序列的5’端处热力学上较弱，因此预定信号序列将是将被加载到Risc中的链[3]。例如，参见图44。所形成的双链体的第二条链的序列，即Dicer加工后被裂解的载体序列以SEQ ID NO.85列出。
本实施例的外源目的RNA的特定序列被设计为包含与预定信号序列100％互补的序列：3’-UUAAUUCAAAUACUUGCCCAG-5’(SEQ IDNO.86)。外源目的RNA还被设计为包含特定序列下游的编码白喉毒素(DT)的序列。外源目的RNA被设计为在强的病毒CMV启动子的控制下转录。外源目的RNA还被设计为包含特定序列上游的抑制序列。抑制序列包含3个起始密码子，它们中的2个位于人Kozak共有序列：5′-ACCAUGG-3′(SEQ ID NO.25)内且其中的每一个不与DT的起始密码子处于同一读码框内。本发明的外源目的RNA还包含编码DT的序列下游的来自人HIST1H2AC(H2ac)基因的3′UTR的回文终止元件(PTE)(5′-GGCUCUUUUCAGAGCC-3′-SEQ ID NO.34)。例如，参见图44。PTE在mRNA加工和稳定性方面起重要作用[11]。来自HIST1H2AC基因的转录物缺乏多聚(A)尾巴而由于PTE仍是稳定的。本实施例的外源目的RNA的完整序列以SEQ ID NO.87列出。
在本实施例中，外源目的RNA、锤头型核糖核酶Rz-B/Rz-A以及包含103个载体序列的RNA序列由病毒载体转录。其中，在细胞中，病毒载体转录：外源目的RNA、锤头型核糖核酶Rz-B/Rz-A以及包含103个载体序列的RNA序列。不符合读码框的起始密码子阻止DT的翻译。锤头型核糖核酶Rz-B裂解预定信号序列的3’端。锤头型核糖核酶Rz-A使多至101个完整的载体序列与1个RNA序列分离。分离的载体序列与包含预定信号序列的裂解的mRNA部分杂交，且预定信号序列被Dicer加工并被加载到Risc中[3]。例如，参见图44。所形成的双链体的第二条链的序列，即Dicer加工后被裂解的载体序列以SEQ ID NO.85列出。Risc-信号序列复合物在特定序列处裂解外源目的RNA且不符合读码框的起始密码子分离，且回文终止元件稳定裂解的外源目的RNA并防止其降解，使得DT能够表达并杀死该细胞及相邻细胞群。例如，参见图44。本实施例的裂解的外源RNA的序列以SEQ ID NO.88列出。
实施例6-由外源目的RNA编码的外源目的蛋白的特异性细胞表达
用于本文描述的实验的常规操作方法如下：
在转染前一天，将每孔约120,000个T293细胞接种在24孔板中，在转染当天用下列共转染每个孔：
1.海肾(renila)/萤光素酶质粒-170ng表达海肾萤光素酶基因&萤火虫萤光素酶基因的质粒(质粒E11，Psv40-内含子-MCS-RLuc---Phsvtk-Fluc，SEQ ID NO：22或质粒E65，Psv40-内含子-Tsp-TD1-TLacZ-RLuc-PTS-60ATG---Phsvtk-Fluc，SEQ ID NO.23)。
2.被测试的质粒＝30ng被测试的质粒(如下文详述的)。
3.siRNA+或siRNA-＝10皮摩尔可诱导由被测试的质粒编码的mRNA裂解的siRNA双链分子(siRNA+)或不诱导由被测试的质粒编码的mRNA裂解的siRNA双链分子(siRNA-)。(下文详述)。
使用lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen)根据厂家说明进行转染。转染后48小时，使用双重萤光素酶报告测定试剂盒(Promega)和光度计(glomax20/20promega)测量海肾萤光素酶基因的表达，并确定相对光单位(RLU)。
被测试的质粒可以是任何类型的下列质粒：
阴性对照＝不编码白喉毒素(DTA)的质粒；
阳性对照＝组成性地编码白喉毒素(DTA)的质粒；
受试质粒＝本发明的组合物的质粒，即在抑制序列和编码白喉毒素(DTA)的下游序列之间包含针对siRNA+的靶位点的质粒。对于受试质粒，当共转染的siRNA+裂解受试质粒的抑制序列时，白喉毒素能够被表达并杀死表达白喉毒素的细胞从而-减少海肾萤光素酶的表达和总的RLU测量值。
用2种不同的siRNA+并用2种不同的siRNA-分别测试被测试的质粒，并各自一式三份。
结果如下计算：
活化倍数＝在2种siRNA-中的每一种和受试质粒的存在下测量的RLU(相对光单位)平均值(6孔)除以使用siRNA+中的一种和受试质粒的RLU平均值(3孔)。
遗漏倍数＝使用所有siRNA-/+和阴性对照质粒的RLU平均值除以使用2种siRNA-中的每一种和受试质粒的RLU平均值。
siRNA+/-RLU＝在一种共转染的siRNA+的存在下或两种共转染的siRNA-的存在下独立地测定的RLU平均值。
使用分子生物学领域中使用的常见且已知的方法构建这些质粒。用于本文以下描述的构建质粒的骨架载体是：psiCHECKTM-2载体(promega，目录号C8021)或pcmv6-A-GFP(OriGene，目录号PS100026)。如下文关于这些受试质粒进一步详述的，每个质粒的附加名称表示该质粒序列内包含的序列。
siRNA序列：
1.RL双链体(Dharmacon，目录号P-002070-01-20)(SEQ ID NO.65(有义链)和SEQ ID 66(反义链))。
2.GFP双链体II(Dharmacon，目录号P-002048-02-20)，(SEQ ID NO.67(有义链)和SEQ ID NO.68(反义链))。
3.siRNA-对照(Sigma，目录号VC30002 000010)，(SEQ ID NO.69(有义链)和SEQ ID NO.70(反义链))。
4.抗βGal siRNA-1((靶位点：Tlacz(SEQ ID NO.71))，Dharmacon，目录号P-002070-01-20)(SEQ ID NO.72(有义链)和SEQ ID NO.73(反义链))。
5.萤光素酶GL3双链体((靶位点：Tfluc(SEQ ID NO.74))，Dharmacon，目录号D-001400-01-20)，(SEQ ID NO.75(有义链)和SEQ IDNO.76(反义链))。
6.GFP双链体I((靶位点：TD1，(SEQ ID NO.77))，Dharmacon，目录号P-002048-01-20)，(SEQ ID NO.78(有义链)和SEQ ID NO.79(反义链))。
7.TCTL((靶位点：TCTL(SEQ ID NO.80))，Dharmacon，SEQ IDNO.81(有义链)和SEQ ID NO.82(反义链))。
在每个实验中，具有受试质粒中的靶位点的siRNA被用作siRNA+，而没有被测试的质粒中对应的靶位点的其他siRNA被用作siRNA-。
阴性对照质粒：
1.E34(SEQ ID NO.10)-Pcmv-4ORF∧-TD1-Tfluc---Psv40-TGFP。
2.E71(SEQ ID.NO.17)-Psv40-内含子-4ORF∧---Phsvtk-Fluc。
3.E38-3CARz-4S&L。在pacI和XhoI限制性位点之间将***物E38(SEQ ID.NO.19)连接到PMK穿梭载体(GeneArt)中。
阳性对照质粒：
1.E28(SEQ ID.NO.11)-Pcmv-Tfluc-TD1-cDTAWT---Psv40-TGFP.
2.E20(SEQ ID.NO.12)-Pcmv-nsDTA---Psv40-TGFP
3.E70(SEQ ID.NO.13)-Psv40-内含子-cDTAWT---Phsvtk-Fluc
4.E3(SEQ ID.NO.14)-Pcmv-KDTA---Psv40-TGFP
5.E89(SEQ ID.NO.15)-Pcmv---DT∧A---Psv40-TGFP
6.E110(SEQ ID.NO.16)-Pcmv-D5∧TA---Psv40-TGFP
7.E4(SEQ ID.NO.18)-Pcmv-KDTA---Psv40-Hygro
8.E10(SEQ ID.NO.20)-Pefl-DTA24---ZEO::GFP-Pcmv
9.E143(SEQ ID.NO.21)-3多聚A-Prpl19-cDTAWT---Phsvtk-Fluc
受试质粒
1.E80(SEQ ID.NO.1)-Pcmv-4ORF∧-TD1-Tfluc-S-cDTAWT---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ IDNO.1的nt.420-938)；4ORF∧＝4个连续的ORF中由下列组成的抑制序列：9个TISU序列和57个kozak序列，相邻ATG密码子之间为57、57、36、36、21、21、21和21nt(SEQ ID NO.1的nt1027-3547)。第一ORF(SEQ IDNO.1的nt.1031-1651)为62Int&从TISU(SEQ ID NO.1的nt.1027-1038)翻译，且接下来的3个ORF∧(SEQ ID NO.1的nt.1662-2996、nt.2306-2941和nt2951-3547)从Kozak序列翻译。最后一个ORF(SEQ ID NO.1的nt2951-3547)在野生型DTA的编码序列(cDTAwt＝不含启动子/剪接/终止/多聚A位点且含有Kozak序列的wt DTA编码序列(SEQ ID NO.1的nt3568-4155)之前终止；接下来是SV40启动子控制下的TGFP编码序列。该质粒还包含靶位点TD1(SEQ ID NO.77)和Tfluc(SEQ ID NO.74)。
2.E54(SEQ ID.NO.2)-Pcmv-4CARZ-PTS-60ATG∧-3ORF∧-TD1-Tfluc-incDTAWT---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.2的核苷酸(nt.)420-938)；4CAR＝4个顺式作用核酶(SEQ ID NO.2的nt.1013-1373，)；PTS＝过氧化物酶体靶向信号(SEQ ID NO.2的nt.1420-1500)；60ATG∧＝61ATG，46个在Kozak序列内，几乎每两个ATG之间隔53nt(SEQ ID NO.2的nt.1534-4554)，且终止密码子在DTA编码序列(SEQ ID NO.2的nt.6745-7332)内；psv40启动子(SEQ ID.NO.2的nt.8092-8399)控制下的TGFP编码序列(SEQ ID NO.2的nt.8452-9143)。该质粒还包含靶位点TD1(SEQID NO.77)和Tfluc(SEQ ID NO.74)。
3.E113(SEQ ID.NO.3)-Pcmv-4ORF∧-TD1-Tfluc-PK-D5∧TA---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.3的nt.420-938)；4ORF∧(SEQ ID NO.3的nt.1027-3547)；PK＝假结(pseudoknot)-茎和环，其中环的6nt与DTA的起译密码子杂交(SEQ ID No.3的nt3561-3611)；5∧＝5个位于DTA的编码序列(SEQ ID NO.3的nt.3609-3806内且包含用于使RNA聚合酶1和/或3的转录终止的富含T的序列的人内含子(SEQ ID NO.3的nt.3712-3801、3856-3960、4066-4173、4380-4519和4617-4783)，这些内含子嵌入在cDTAwt编码序列中；psv40启动子(SEQ ID NO.3的nt.5546-5853)控制下的TGFP编码序列(SEQ ID NO.3的nt5906-6597)。该质粒还包含靶位点TD1(SEQ ID NO.77)和Tfluc(SEQ ID NO.74)。
4.E91(SEQ ID.NO.4)-Pcmv-4ORF∧-TD1-Tfluc-DT∧A---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.4的nt.420-938)，4ORF∧(SEQ ID NO.4的nt.1027-3507)；DT∧A＝含有来自人胶原蛋白16A1基因的内含子且不含启动子/剪接/多聚A信号的kozak DTA(SEQ ID NO.4的nt.3520-4444)；pSV40启动子(nt.5184-5491)控制下的TGFP编码序列(SEQ ID NO.4的nt.5544-6235)。该质粒还包含靶位点TD1(SEQ ID NO.77)和Tfluc(SEQ IDNO.74)。
5.E112(SEQ ID.NO.5)-Pcmv-4ORF∧-2xTLacZin内含子-8X[TCTL+TD1]-PK-D5∧TA---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.5的nt.420-938)，4ORF∧(SEQ ID NO.5的nt.1027-3436)；2xTLacZin内含子＝市售质粒pSELECT-GFPzeo-LacZ的内含子中的2个TLacZ靶(SEQID NO.5的nt.3438-3638)；8X[TCTL+TD1](SEQ ID NO.5的nt.3647-4052)；PK＝假结-茎和环，其中环的6nt与DTA的起译密码子杂交(SEQ ID NO.5的nt4059-4109)；5∧＝5个位于DTA的编码序列(SEQ IDNO.5的nt.4107-5304内且包含用于使RNA聚合酶1和/或3的转录终止的富含T的序列的人内含子(SEQ ID NO.5的nt.4210-4299、4354-4458、4564-4671、4878-5017和5115-5281)，这些内含子嵌入在cDTAwt编码序列中；pSV40启动子(SEQ ID NO.5的nt.6044-6351)控制下的TGFP编码序列(SEQ ID NO.5的nt6404-7095)。该质粒还包含8个拷贝的靶位点TD1(SEQ ID NO.77)、TCTL(SEQ ID NO.80)和2个拷贝的TLacZ(SEQ IDNO.71)。
6.E87(SEQ ID.NO.6)-Pcmv-4ORF∧-TD1-3TLacZ-Tctl-BGlob-25G-XRN1S&L-DT∧A---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.6的nt.420-938)；4ORF∧(SEQ ID NO.6的nt.1027-3430)；BGlob＝加帽子的β球蛋白5’截短末端(SEQ ID NO.6的nt.3577-3655)。25G＝25个连续的G核苷酸段(SEQ ID NO.6的nt.3660-3684)，所述段可阻碍/干扰XRN核糖核酸外切酶；XRN1S&L＝可阻碍XRN1核糖核酸外切酶的黄热病毒3’UTR的茎和环结构(SEQ ID NO.6的nt.3687-3767)。DT∧A＝含有来自人胶原蛋白16A1基因的内含子且不含启动子/剪接/多聚A信号的kozak DTA(SEQID NO.6的nt.3787-4711)；psv40启动子(SEQ ID NO.6的nt.5811-6502)控制下的TGFP编码序列(SEQ ID NO.6的nt6404-7095)。该质粒还包含TD1(SEQ ID NO.77)、3拷贝的TLacz(SEQ ID NO.71)和TCTL靶位点(SEQID NO.80)。
7.E123(SEQ ID.NO.7)-Psv40-内含子-4ORF∧-3X[TD1-TLacZ]-4PTE-SV40内含子-HBB-DTA---Phsvtk-Fluc(pSV40启动子(SEQ ID NO.7的nt.7-419)，4ORF∧＝4个连续的ORF中的9个TISU序列和57个kozak序列，相邻的ATG密码子之间为57、57、36、36、21、21、21和21nt(SEQ ID NO.7的nt722-2387)；4PTE＝回文终止元件的4种茎和环结构(SEQ ID NO.7的nt.3318-3473)。SV40内含子＝SV40小t抗原的内含子(SEQ ID NO.7的nt.3505-3596)；HBB＝不含ATG且包括其第一内含子的血红蛋白βmRNA(SEQ ID NO.7的nt.3627-4406)；cDTAwt编码序列(SEQ ID NO.7的nt.4431-5014)；HSKVK启动子(SEQ ID NO.7的nt.5106-5858)和萤火虫萤光素酶编码序列(SEQ ID NO.7的nt.5894-7546)。该质粒还包含3拷贝的TD1(SEQ ID NO.77)和TLacz靶位点(SEQ ID NO.71)。
8.E30(SEQ ID.NO.8)-Pcmv-4ORF∧-TD1-Tfluc-incDTAWT---Psv40-TGFP(pCMV启动子(SEQ ID NO.8的nt.420-938)；4ORF∧＝4个连续的ORF中的9个TISU序列和57个kozak序列，相邻的ATG密码子之间为57、57、36、36、21、21、21和21nt(SEQ ID NO.8的nt1027-3547)。第一ORF(SEQ ID NO.8的nt.1031-1651)从TISU(SEQ ID NO.8的nt.1027-1038)翻译，且接下来的3个ORF∧(SEQ ID NO.8的nt.1662-2996、nt.2306-2941和nt2951-3547)从Kozak序列翻译。最后一个ORF(SEQ IDNO.8的nt2951-3516)在野生型DTA的编码序列(cDTAwt＝不含启动子/剪接/终止/多聚A位点且含有Kozak序列的wt DTA编码序列(SEQ ID NO.8的nt3568-4155)之前终止；接下来是SV40启动子控制下的TGFP编码序列。该质粒还包含靶位点TD1(SEQ ID NO.77)和Tfluc(SEQ ID NO.74)。
9.E142(SEQ ID.NO.9)-3多聚A-Prpl19-4ORF∧-TD1-Tfluc-S-cDTAWT---Phsvtk-Fluc。3多聚A＝HSV多聚A、SV40多聚A、合成的多聚A(SEQ ID NO.9的nt.60-247)；Prpl19＝携带其第一内含子的RPL19(核糖体蛋白L19)的启动子(SEQ ID NO.9的nt.248-1941)；4ORF∧＝4个连续的ORF中的9个TISU序列和57个kozak序列，相邻的ATG密码子之间为57、57、36、36、21、21、21和21nt(SEQ ID NO.9的nt1948-4366)；野生型DTA的编码序列(SEQ ID NO.9的nt.4457-5044)；HSKVK启动子(nt.5136-5888)和萤火虫萤光素酶的编码序列(SEQ ID.NO.9的nt.5924-7576)。该质粒还包含靶位点TD1(SEQ ID NO.77)和Tfluc(SEQ IDNO.74)。
结果：
下表1-5和6A-C中呈现了结果。这些结果示出了在各种实验条件下在转染了所指示的质粒和siRNA分子的细胞中测量的RLU。所用的siRNA+分子是可结合其在被测试的质粒内的其相应靶序列的siRNA分子。
表1：
Figure BDA00003427178600991
表2：
Figure BDA00003427178601001
表3：
表4：
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表5：
Figure BDA00003427178601012
表6A：
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表6B：
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表6C
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关于表6A-6C：
*＝表示所述2种siRNA+表现出显著的活化；
**＝还与155ng的质粒E38(SEQ ID NO.19)共转染。
以上表1-5和6A-6C中呈现的结果清楚地表明在能够引发外源目的RNA裂解的siRNA分子的存在下，外源目的蛋白(DTA)表达，其表达继而导致增加的细胞死亡。所述增加的细胞死亡导致孔中总的RLU测量值减少，因为更少的细胞表达/产生萤光素酶基因。这些结果证实了，事实上，仅在包含特定siRNA的细胞中，外源目的蛋白(在本实施例中为DTA)表达，因为仅在这些细胞中，外源目的RNA在裂解位点处的裂解被引发，从而允许外源目的蛋白在这些细胞中的表达。
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Claims (69)

1.一种组合物，包含用于指导外源目的RNA在特定靶位点特异性裂解的一种或多种多核苷酸，所述裂解仅在细胞中存在内源性信号RNA时发生，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的任何预定序列，
其中将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中指导所述外源目的RNA在位于特定序列内的所述特定靶位点处被裂解，所述特定序列具有与所述预定信号序列杂交的足够的互补性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种多核苷酸包含：
第一多核苷酸序列，其编码所述外源目的RNA；
第二多核苷酸序列，其编码能够介导所述内源性信号RNA在预定裂解位点处裂解的功能性RNA；以及
第三多核苷酸序列，其编码载体RNA。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列和边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；并且
其中所述预定裂解位点是所述预定信号序列的5’端。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述载体RNA包含长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；并且
其中所述预定裂解位点是所述预定信号序列的3’端。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的3’端的载体裂解位点处被裂解；
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现；并且
其中所述预定裂解位点是所述预定信号序列的5’端。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的5’端的载体裂解位点处被裂解；
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现；并且
其中所述预定裂解位点是所述预定信号序列的3’端。
7.根据权利要求3或5所述的组合物，其中所述边缘序列为23-28个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游约23-28个核苷酸处，其中所述第二序列的长度为2个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
8.根据权利要求4或6所述的组合物，其中所述边缘序列为25-30个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游2个核苷酸处，并向上游延伸到所述内源性信号RNA中，其中所述第二序列的长度为0个核苷酸，且其中所述第三序列的长度为0个核苷酸。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述内源性信号RNA是细胞的mRNA或病毒RNA或二者。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述预定信号序列是赘生性细胞、病毒感染细胞或二者所特有的。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中足够的互补性是至少30％的互补性。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中足够的互补性是至少90％。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种多核苷酸包含一种或多种DNA分子、一种或多种RNA分子或其组合。
14.根据权利要求2所述的组合物，其中所述功能性RNA选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含：
(a)编码外源目的蛋白的序列；和
(b)能够抑制所述外源目的蛋白表达的抑制序列；
其中所述特定靶位点位于所述抑制序列和所述编码外源目的蛋白的序列之间，其中在将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中后，所述外源目的RNA被转录并在所述特定靶位点处被裂解，其中所述抑制序列与所述编码所述外源目的蛋白的序列分离且所述外源目的蛋白能够被表达。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述外源目的蛋白选自由下列组成的组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素A链及其修饰形式。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述外源目的蛋白选自由下列组成的组：α毒素、皂草素、玉蜀黍RIP、大麦RIP、小麦RIP、玉米RIP、黑麦RIP、亚麻RIP、志贺毒素、志贺样RIP、木鳖子甙、胸苷激酶、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌(Escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶及其修饰形式。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抑制序列位于所述特定靶位点上游且其中所述抑制序列降低所述外源目的蛋白的翻译效率。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述抑制序列包含多个起始密码子，其中每个所述起始密码子和所述编码所述外源目的蛋白的序列不在同一读码框内。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含位于所述起始密码子和所述编码所述外源目的蛋白的序列的起译密码子之间的终止密码子，其中所述终止密码子和所述起始密码子在同一读码框内。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述抑制序列还包含所述起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子在同一读码框内，且其中所述核苷酸序列编码用于亚细胞定位的分选信号。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述亚细胞定位选自由下列组成的组：线粒体、核、内体、溶酶体、过氧化物酶体和内质网(ER)。
23.根据权利要求19所述的组合物，其中所述抑制序列还包含所述起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子在同一读码框内；且其中所述核苷酸序列编码蛋白降解信号。
24.根据权利要求19所述的组合物，其中所述抑制序列还包含所述起始密码子下游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列和所述起始密码子在同一读码框内；其中所述核苷酸序列和所述编码所述外源目的蛋白的序列在同一读码框内，其中所述核苷酸序列编码氨基酸序列，其中当所述氨基酸序列被融合到所述外源目的蛋白时，所述外源目的蛋白的生物学功能被抑制。
25.根据权利要求19所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含所述起始密码子下游的终止密码子，其中所述终止密码子和所述起始密码子在同一读码框内，且其中所述外源目的RNA还包含所述终止密码子下游的内含子，其中所述外源目的RNA是无义介导的衰变(NMD)的靶。
26.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抑制序列位于所述编码所述外源目的蛋白的序列下游，且其中所述抑制序列包含用于亚细胞定位的RNA定位信号或内源性miRNA结合位点。
27.根据权利要求15所述的组合物，其中所述外源目的RNA包含所述特定裂解位点下游和所述编码所述外源目的蛋白的序列上游的内部核糖体进入位点(IRES)序列，其中所述IRES序列在裂解的外源目的RNA内比在完整的外源目的RNA内功能更强。
28.根据权利要求15所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含紧邻所述编码所述外源目的蛋白的序列上游的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含能够增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率的内部核糖体进入位点(IRES)序列。
29.根据权利要求15所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含含有紧邻所述编码所述外源目的蛋白的序列下游定位的细胞质多聚腺苷酸化元件的核苷酸序列，其中所述细胞质多聚腺苷酸化元件增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
30.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含编码另外的RNA分子的另外的多核苷酸序列，所述另外的RNA分子在3’端包含能够结合位于所述特定靶位点上游和所述编码所述外源目的蛋白的序列下游的序列的核苷酸序列，其中所述另外的RNA分子增加裂解的外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
31.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含另外的多核苷酸序列，所述另外的多核苷酸序列编码能够实现所述外源目的RNA在位于所述抑制序列上游的位置处的裂解的裂解组分，其中所述裂解组分选自由下列组成的组：
(a)位于所述外源目的RNA内的核酸序列，其中所述核酸序列选自由下列组成的组：核酸内切酶识别位点、内源性miRNA结合位点、顺式作用型核酶和miRNA序列，其中所述核酸序列降低所述外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率；和
(b)抑制性RNA，其中所述抑制性RNA选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶，其中所述抑制性RNA降低所述外源目的RNA中所述外源目的蛋白的翻译效率。
32.根据权利要求15所述的组合物，其中所述特定序列是多个特定序列且其中所述特定靶位点是多个特定靶位点。
33.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抑制序列位于所述编码所述外源目的蛋白的序列的上游，其中所述抑制序列能够形成具有低于-30kcal/mol的折叠自由能的二级结构，其中所述二级结构足以阻碍正在扫描核糖体到达所述外源目的蛋白的起译密码子。
34.根据权利要求2所述的组合物，其中所述外源目的RNA和所述功能性RNA能够位于相同或不同的多核苷酸分子上。
35.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述外源目的RNA、所述功能性RNA和所述功能性核酸能够位于一个或多个多核苷酸分子上。
36.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种多核苷酸被整合到所述细胞的基因组中。
37.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞选自由下列组成的组：人细胞、动物细胞、培养的细胞和植物细胞。
38.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞存在于生物体内。
39.一种组合物，包含用于指导外源目的蛋白在细胞中特异性表达的一种或多种多核苷酸，其中所述外源目的蛋白仅在细胞中存在内源性信号RNA时表达，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸序列的任何预定序列，其中将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点处被裂解，所述特定序列具有与所述预定信号序列杂交的足够的互补性，其中仅在所述外源目的RNA在所述细胞中裂解之后，由所述裂解的外源目的RNA编码的所述外源目的蛋白能够在所述细胞中表达。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述一种或多种多种多核苷酸包含：
编码所述外源目的RNA的第一多核苷酸序列；
编码能够调节所述内源性信号RNA在预定裂解位点处裂解的功能性RNA的第二多核苷酸序列；和
编码载体RNA的第三多核苷酸序列。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述载体RNA包含长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
43.根据权利要求40所述的组合物，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的3’端的载体裂解位点处被裂解；并且
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现。
44.根据权利要求40所述的组合物，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的5’端的载体裂解位点处被裂解；并且
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现。
45.根据权利要求39所述的组合物，其中所述外源目的RNA还包含：
(a)编码所述外源目的蛋白的序列；和
(b)能够抑制所述外源目的蛋白表达的抑制序列；
其中所述特定靶位点位于所述抑制序列和所述编码所述外源目的序列的序列之间，其中，在将所述组合物引入到包含所述内源性信号RNA的细胞中后，所述外源目的RNA被转录并在所述特定靶位点被裂解，其中所述抑制序列与所述编码所述外源目的序列的序列分离且所述外源目的蛋白能够被表达。
46.根据权利要求39所述的组合物，其中所述内源性信号RNA是细胞的mRNA或病毒RNA或二者。
47.根据权利要求39所述的组合物，其中所述预定信号序列是赘生性细胞、病毒感染细胞或二者所特有的。
48.根据权利要求39所述的组合物，其中足够的互补性是至少30％的互补性。
49.根据权利要求39所述的组合物，其中足够的互补性是至少90％。
50.根据权利要求39所述的组合物，其中所述一种或多种多核苷酸包含一种或多种DNA分子、一种或多种RNA分子或其组合。
51.根据权利要求39述的组合物，其中所述外源目的蛋白选自由下列组成的组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素A链、α毒素、皂草素、玉蜀黍RIP、大麦RIP、小麦RIP、玉米RIP、黑麦RIP、亚麻RIP、志贺毒素、志贺样RIP、木鳖子甙、胸苷激酶、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶及其修饰形式。
52.根据权利要求39所述的组合物，其中所述功能性RNA选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶。
53.根据权利要求42所述的组合物，其中所述细胞选自由下列组成的组：人细胞、动物细胞、培养的细胞和植物细胞。
54.根据权利要求42所述的组合物，其中所述细胞存在于生物体内。
55.一种用于杀死包含内源性信号RNA的特定细胞群的方法，所述方法包括：将包含用于指导外源目的RNA在位于特定序列内的特定靶位点处裂解的一种或多种多核苷酸的组合物引入到所述细胞群中，所述特定序列具有与所述内源性信号RNA杂交的足够的互补性，所述内源性信号RNA是包含信号序列的RNA分子，所述信号序列是长度为18至25个核苷酸的任何预定序列；并且
其中所述外源目的RNA在所述细胞群中的裂解允许能够杀死所述细胞群的外源目的蛋白的表达。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸包含：
编码所述外源目的RNA的第一多核苷酸序列；
编码能够调节所述内源性信号RNA在预定裂解位点处裂解的功能性RNA的第二多核苷酸序列；和
编码载体RNA的第三多核苷酸序列。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述载体RNA是长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述载体RNA包含长度为至少约18个核苷酸且主要由下列组成的RNA分子：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点下游的0-5个核苷酸处且向下游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列下游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列上游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的3’端的载体裂解位点处被裂解；并且
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述载体RNA由包含长度为至少约18个核苷酸的载体序列的多核苷酸序列加工得到，所述载体序列主要由下列组成：
(1)长度为14至31个核苷酸的第一序列，所述第一序列与边缘序列具有足够的互补性以与其杂交，所述边缘序列为14至31个核苷酸长且位于所述预定裂解位点上游的0-5个核苷酸处且向上游延伸到所述内源性信号RNA中；
(2)所述第一序列上游的第二序列，其中所述第二序列是长度为0-5个核苷酸的随机序列；和
(3)所述第一序列下游的第三序列，其中所述第三序列的长度为0-7000个核苷酸；
其中所述多核苷酸序列在所述细胞内在为所述载体序列的5’端的载体裂解位点处被裂解；并且
其中在所述载体裂解位点处的裂解通过由所述组合物的第四多核苷酸序列编码的功能性核酸实现。
61.根据权利要求55所述的方法，其中所述内源性信号RNA是细胞的mRNA或病毒RNA或二者。
62.根据权利要求55所述的方法，其中足够的互补性是至少30％的互补性。
63.根据权利要求55所述的方法，其中足够的互补性是至少90％。
64.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸包含一种或多种DNA分子、一种或多种RNA分子或其组合。
65.根据权利要求55所述的方法，其中所述功能性RNA选自由下列组成的组：微小RNA(miRNA)、套索形式的RNA、短发夹RNA(shRNA)、siRNA表达结构域、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)和核酶。
66.根据权利要求55所述的方法，其中所述外源目的蛋白选自由下列组成的组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素A链、α毒素、皂草素、玉蜀黍RIP、大麦RIP、小麦RIP、玉米RIP、黑麦RIP、亚麻RIP、志贺毒素、志贺样RIP、木鳖子甙、胸苷激酶、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶及其修饰形式。
67.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞群选自由下列组成的组：人细胞、动物细胞、培养的细胞和植物细胞。
68.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞群是赘生性细胞群。
69.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞群存在于生物体内。
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