CN103278634B - Cd73作为肾透明细胞癌干细胞表面标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CD73作为肾透明细胞癌干细胞表面标志物的应用。该应用即检测CD73的物质可用于制备如下产品：1）检测或筛选肾透明细胞癌干细胞的产品；2）诊断或辅助诊断肾透明细胞癌的产品；3）诊断或辅助诊断待测患者肾透明细胞癌恶性程度的产品；4）以CD73为靶点的治疗肾透明细胞癌的产品。本发明通过体外实验和动物实验证明，CD73可作为肾透明细胞癌干细胞的表面标志物；临床样本分析结果表明，CD73阳性细胞比例与肾透明细胞癌的临床分型密切相关。本发明为肾透明细胞癌干细胞的鉴定和肾透明细胞癌的诊断、分型及检测提供了一个新的分子靶标CD73，并为肾透明细胞癌的预后提供了一个简单有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及CD73作为肾透明细胞癌干细胞表面标志物的应用。
背景技术
肾癌又称为肾细胞癌，起源于泌尿小管上皮。肾癌约占成人恶性肿瘤的80%—90%。通常将肾细胞癌分为4型：透明细胞型、颗粒细胞型、混合细胞型、未分化细胞型。其中，肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)占肾癌的70%—80%，其癌细胞常排列成片状、条索状、腺泡状或管状，很像肾小管，早期常无症状，或只有发热、乏力等全身症状，肿瘤体积增大时才被发现（J.C.Cheville,et al.Comparisons of outcome and prognostic features among histologic subtypes ofrenal cell carcinoma.The American journal of surgical pathology 27(2003)612-624）。肾细胞癌的发病率在过去的30年里一直在稳步上升，对于大多数目前的治疗方法如化疗和放射治疗，肾细胞癌都有抗性（L.J.Costa,et al.Renal cellcarcinoma:new developments in molecular biology and potential for targetedtherapies.Oncologist,12(2007):1404-1415）。
肿瘤干细胞(tumor stem cell，TSC)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，它对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。本质上，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力。肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能。肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此，肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。肿瘤干细胞的鉴定和干预治疗是耐受肿瘤的治疗的新策略（T.Reya,et al.Stem cells,cancer,and cancer stem cells.Nature,414(2001):105-111）。
CD73是胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5’-nucleotidase,eNT),通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于质膜的一种糖蛋白。CD73广泛分布在人体组织细胞表面,具有水解酶活性和非水解酶作用。目前，尚未见有关利用CD73对肾透明细胞癌进行干性分析及临床分型的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供CD73作为肾透明细胞癌干细胞表面标志物的应用。
所述应用为检测CD73（即胞外-5’-核苷酸酶）的物质在制备如下1）—4）中至少一种产品中的应用：
1）检测肾透明细胞癌干细胞的产品；
2）诊断或辅助诊断肾透明细胞癌的产品；
3）诊断或辅助诊断待测患者肾透明细胞癌恶性程度的产品；
4）以CD73为靶点的治疗肾透明细胞癌的产品。
所述检测CD73（即胞外-5’-核苷酸酶）的物质具体可为检测CD73的单克隆抗体及相关试剂和检测设备。
在上述应用中，所述产品2）中所述恶性程度可分为G1、G2和G3三级；
所述G1级是指待测患者肾透明细胞癌限于肾包膜内；
所述G2级是指待测患者肾透明细胞癌已穿破肾包膜，侵入脂肪层，且仍局限于肾筋膜内；
所述G3级是指待测患者肾透明细胞癌已侵入肾静脉或/和下腔静脉，侵入邻近脏器或发生远处转移。
在上述应用中，所述产品2）中包括记载如下诊断标准的载体：当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.49%±0.08%（即0.41—0.57%）时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G1级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.69%±0.12%（即在0.57%—0.81%）时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G2级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为1.10%±0.29%（即0.81%—1.39%）或高于1.39%时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G3级。
所述CD73阳性细胞为含有CD73的细胞。
本发明提供一种检测肾透明细胞癌干细胞的产品，该产品中包括所述检测CD73的物质。
本发明还提供一种诊断或辅助诊断待测患者肾透明细胞癌恶性程度的产品，该产品中包括所述检测CD73的物质；
所述恶性程度可分为G1、G2和G3三级；
所述G1级是指待测患者肾透明细胞癌限于肾包膜内；
所述G2级是指待测患者肾透明细胞癌已穿破肾包膜，侵入脂肪层，且仍局限于肾筋膜内；
所述G3级是指待测患者肾透明细胞癌已侵入肾静脉或/和下腔静脉，侵入邻近脏器或发生远处转移。
该产品还可包括记载所述诊断标准的所述载体。
上述CD73具体可为GenBank号为AAH65937.1的蛋白质。
本发明通过体外实验和动物实验证明，CD73为肾透明细胞癌干细胞的表面标志物；临床样本分析结果表明，CD73阳性细胞比例与肾透明细胞癌的临床分型密切相关。本发明为肾透明细胞癌干细胞的鉴定和肾透明细胞癌的诊断、分型及检测提供了一个新的分子靶标CD73，并为肾透明细胞癌的预后提供了一个简单有效的方法。
附图说明
图1为786-O微囊细胞经无血清培养3、7和14天时（从左至右）的电镜图。其中的标尺长度为100μm。
图2为786-O干细胞注射NOD/SCID小鼠120天后形成的肿瘤。左侧箭头所示处为注射786-O干细胞后形成的肿瘤，右侧箭头所示处为注射786-O普通培养细胞（对照）后未形成肿瘤。
图3为Western杂交检测786-O干细胞的CD73蛋白含量结果。其中，第一行为检测CD73蛋白的结果，第二行为检测对照β-actin蛋白的结果；左列的泳道为普通786-O细胞的检测结果，右列的泳道为786-O干细胞的检测结果。
图4为免疫荧光证明786-O干细胞表面存在CD73蛋白。
图5为流式细胞仪检测786-O干细胞的结果。其中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞比例（%）。
图6为CD73阳性细胞注射NOD/SCID小鼠120天后形成的肿瘤。左侧箭头所示处为注射CD73阴性细胞后未形成肿瘤，右侧箭头所示处为注射CD73阳性细胞后形成的肿瘤。
图7为无血清培养CD73阴性细胞和阳性细胞。
图8为CD73阴性细胞和阳性细胞的微囊形成比例统计结果。
图9为不同临床样本肾组织切片的免疫组化检测结果。其中，从左至右依次为正常肾组织、G1级肾组织、G2级肾组织和G3级肾组织的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
人肾透明细胞癌细胞系786-O：购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，其编号为TCHu186。
PRMI1640培养基：购自Gibco，产品目录编号为12633012。
血清：购自HyClone，产品目录编号为SV30087.02。
胰酶：购自Sigma，产品目录编号为T3924-500ML。
实施例1、CD73为肾透明细胞癌干细胞表面标志物
一、人肾透明细胞癌细胞系干细胞的获得及功能验证
1、干细胞的获得
1）取人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞，用添加10%胎牛血清、100IU/mL盘尼西林和100g/mL链霉素的无血清的1640培养基于5%CO2培养箱中37℃培养。
2）将步骤1）培养至指数期的786-O细胞用胰酶消化后，再用含10ng/mL成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素和0.4%胎牛血清蛋白的无血清1640培养基重悬，将细胞悬液以5000细胞/孔种入无贴壁因子的6孔板，7—10天形成微囊。富集微囊细胞后用温和的细胞分离液(Invitrogen,Eugene,OR,USA)重悬细胞后，用正常含血清的1640培养基培养，得到786-O的干细胞。
2、普通细胞的获得
1）取人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞，用含血清的1640培养基于5%CO2培养箱中37℃培养。
2）将步骤1）培养至指数期的786-O细胞用胰酶消化后，再用含血清的1640培养基重悬，将细胞悬液以5000细胞/孔种入有贴壁因子的6孔板，进行贴壁培养，获得普通786-O细胞。
3、786-O干细胞的验证
1）无血清培养法验证
将步骤1中2）得到的786-O的干细胞用胰酶消化后，用含10ng/mL成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素和0.4%胎牛血清蛋白的无血清1640培养基培养7—15天后形成直径200μm左右的微囊（如图1所示）。
将步骤2中2）得到的普通786-O细胞用胰酶消化后，用含10ng/mL成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素和0.4%胎牛血清蛋白的无血清1640培养基培养7—15天后，无微囊形成。
这证明了步骤1中2）得到微囊细胞中含有786-O的干细胞。
2）NOD/SCID小鼠肿瘤模型法验证
处理：将步骤1中2）得到的786-O的干细胞用胰酶消化后，用PBS重悬并调整细胞浓度到5000细胞/mL，获得细胞悬液A；将该细胞悬液A注射于6—8周龄的雌性NOD/SCID小鼠（中国医学科学院实验动物研究中心）下肢腋窝左侧，注射量为0.1mL（即500个细胞）。
对照：将步骤2中2）得到的普通786-O细胞用胰酶消化后，用PBS重悬并调整细胞浓度到5000细胞/mL，获得细胞悬液B；将该细胞悬液B同时注射于经上述处理的同一小鼠下肢腋窝右侧，注射量为0.1mL（即500个细胞）。
实验设3次重复，每个重复5只小鼠。
结果（如图2所示）：注射120天后，将小鼠处死、解剖小鼠，对照的成瘤率为0，而处理的成瘤率为100%。
实验一的结果表明，无血清培养形成的微囊细胞含有肿瘤干细胞。
二、CD73是肾透明细胞癌（786-O）干细胞的表面标志物
1、CD73是肾透明细胞癌（786-O）干细胞的表面标志物
1）Western杂交检测
富集实验一中步骤1获得的786-O微囊和实验一中步骤2获得的普通786-O细胞，分别提取细胞总蛋白并进行Western杂交，杂交中使用CD73单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab59462）检测CD73蛋白含量，使用β-actin单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab6276）检测β-actin蛋白含量（对照），结果如图3所示，786-O的干细胞中CD73蛋白含量明显高于普通786-O细胞。
2）免疫荧光检测
富集实验一中步骤1获得的786-O微囊，用含0.5%胎牛血清的PBS轻柔的洗两次后，用含0.5%胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至1×105个/mL，按400:1的体积比加入PE荧光标记的CD73单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab59462），冰浴30分钟后用PBS洗两次，将得到的细胞悬液滴片，用DAPI封片后进行激光共聚焦显微镜检，结果如图4所示，图4从左至右第一幅图为明视场下的786-O微囊细胞，第二幅图为340nm激发光下786-O微囊细胞细胞核DAPI结合处发出蓝色荧光的结果，第三幅图为594nm激发光下CD73单克隆抗体结合处（即CD73存在位置）发出红色荧光的结果，第四幅图为第三幅和第四幅图的整合结果；图4结果表明，CD73在786-O微囊细胞表面高表达。
3）流式细胞术检测和分选
以下各处理均设三次重复，每个重复至少分选10000个细胞。
对照：将实验一中步骤1获得的786-O干细胞用胰酶消化后，用含0.5%胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至1×106个/mL，冰浴30分钟后用0.5%胎牛血清的PBS洗两次后，将细胞通过BD FACSCalibur流式细胞仪（生产商：BD公司，型号：Calibur）检测。结果：荧光强度大于101.5的细胞比例为0.473%（如图5中的A图所示）。
处理1：将实验一中步骤1获得的786-O干细胞用胰酶消化后，用含0.5%胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至1×106个/mL，按400:1的体积比加入PE荧光标记的CD73单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab59462），冰浴30分钟后用0.5%胎牛血清的PBS洗两次后，将细胞通过BD FACSCalibur流式细胞仪（生产商：BD公司，型号：Calibur）检测并同时分别收集荧光强度大于101.5的细胞（即CD73高表达细胞）和荧光强度小于101.5的细胞（即CD73低表达细胞）。结果：荧光强度大于101.5的细胞比例为98.2%（如图5中的B图所示）。
处理2：将实验一中步骤2获得的786-O普通细胞用胰酶消化后，用含0.5%胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至1×106个/mL，按400:1的体积比加入PE荧光标记的CD73单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab59462），冰浴30分钟后用0.5%胎牛血清的PBS洗两次后，将细胞通过BD FACSCalibur流式细胞仪（生产商：BD公司，型号：Calibur）进行检测。结果：荧光强度大于101.5的细胞比例为0.331%（如图5中的C图所示）。
步骤1）—3）的结果表明，CD73可作为786-O干细胞的特异表面标志物。
2、分选的CD73阳性细胞亚群为786-O干细胞
将步骤1中3）分选的CD73高表达细胞定义为CD73阳性细胞，将步骤1中3）分选的CD73低表达和不表达细胞定义为CD73阴性细胞。
1）NOD/SCID小鼠肿瘤模型法验证
将步骤1中3）分选收集的CD73阳性细胞和阴性细胞分别用PBS调整浓度，分别获得浓度均为5000细胞/mL的细胞悬液X和X-；
取6—8周龄的雌性NOD/SCID小鼠（中国医学科学院实验动物研究中心），在下肢腋窝右侧注射0.1mL细胞悬液X，下肢腋窝左侧注射0.1mL细胞悬液X-；实验设3次重复，每个重复5只小鼠；注射120天后处死、解剖小鼠，结果显示CD73阴性细胞成瘤率为0，CD73阳性细胞成瘤率为100%（如图6所示）。
2）无血清培养法验证
将步骤1中3）分选收集的CD73阴性细胞和阳性细胞分别用含10ng/mL成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素和0.4%胎牛血清蛋白的无血清1640培养基培养，12天后，CD73阴性细胞基本无微囊形成（如图7中的左图所示），CD73阳性细胞形成的微囊（如图7中的右图所示），统计CD73阴性细胞和阳性细胞形成微囊的比例，结果如图8所示，CD73阳性细胞的微囊形成平均比例为22%，明显高于CD73阴性细胞的微囊形成平均比例为2%（p=0.0007）。
结果说明，CD73阳性细胞为786-O干细胞。
实施例2、CD73的表达量与肾透明细胞癌恶性程度（或临床分型）相关
肾透明细胞癌临床样本来源兰州大学第二附属医院，所有样本均为肾透明细胞癌局部或全部手术切除后获得，实验样本的获得符合甘肃伦理委员会的规定。其中，正常肾组织样本量为15、肾透明细胞癌样本量为150。样本获取时间为2010.9—2012.4。所有样本母体均未接受放射线治疗或化学药物治疗。
1、临床分型
首先，将待测患者的肾透明细胞癌恶性程度（或临床分型）按照如下临床标准分为G1、G2和G3三级：
所述G1级是指待测患者肾透明细胞癌限于肾包膜内；
所述G2级是指待测患者肾透明细胞癌已穿破肾包膜，侵入脂肪层，且仍局限于肾筋膜内；
所述G3级是指待测患者肾透明细胞癌已侵入肾静脉或/和下腔静脉，侵入邻近脏器或发生远处转移。
按照上述标准，记录各临床样本的恶性程度（或临床分型）结果如表1所示。
2、CD73阳性细胞比例检测
从临床样本上取一小块肾组织，用***固定，石蜡包埋后做组织切片，切片厚度为4μm。切片用二甲苯去除石蜡、乙醇清洗后，蒸汽加热进行抗原修复20分钟。将切片按1:400的体积比与CD73单克隆抗体（购自Abcam，产品目录编号为ab59462）杂交，二氨基联苯胺染色，苏木精复染。统计每张切片中随机视野下CD73阳性细胞数占该视野中细胞总数的比例，将恶性程度为G1、G2和G3的结果取平均值±标准差列于表1，部分染色结果如图9所示。其中，CD73阳性细胞的染色结果为细胞核为蓝色，细胞质为棕色；CD73阴性细胞的染色结果为细胞核为蓝色，细胞质为无色。统计细胞质为棕色的细胞比例，即CD73阳性细胞比例。
表1、样本的恶性程度及细胞CD73阳性比例统计结果
| 恶性程度 | 样本数 | CD73阳性细胞的比例（%） |
| G1 | 35 | 0.49±0.08 |
| G2 | 65 | 0.69±0.12 |
| G3 | 50 | 1.10±0.29 |
3、判断肾透明细胞癌恶性程度的标准
根据表1的结果，制定如下判断肾透明细胞癌恶性程度（或临床分型）标准或方法：当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.49%±0.08%（即0.41—0.57%）时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G1级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.69%±0.12%（即0.57%—0.81%）时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G2级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为1.10%±0.29%（即0.81%—1.39%）或高于1.39%时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G3级。
实施例3、利用CD73的表达量判断肾透明细胞癌恶性程度（或临床分型）
1、待测样本的获得
来自健康人的正常肾组织，样本量为15；来自肾透明细胞癌患者的肾组织，样本量为25，所有样本均为肾透明细胞癌局部或全部手术切除后获得，实验样本的获得符合甘肃伦理委员会的规定。所有样本母体均未接受放射线治疗或化学药物治疗。
2、CD73阳性细胞比例检测
按照实施例2中步骤2的方法进行，结果15例健康人的肾组织细胞中CD73阳性细胞比例均极显著低于0.41%，25例肾透明细胞癌患者的肾组织的结果如表2所示。
按照实施例2中步骤3的标准，根据CD73阳性细胞比例预测肾透明细胞癌样本的临床分型，结果记录在表2的“预测恶性程度”一栏中。
3、临床分型
按照实施例2中步骤1中的肾透明细胞癌恶性程度分级标准将步骤1中的25例患者的肾透明细胞癌恶性程度进行分级，将结果记录在表2的“实测恶性程度”一栏中。
表2.待测患者肾透明细胞癌恶性程度的结果
表2的结果表明，通过检测肾组织细胞中CD73阳性细胞的比例按照实施例2的标准预测肾透明细胞癌恶性程度的结果中，有23例的预测结果与实测结果相符，准确率达92.0%。
综上所述，CD73可作为肾透明细胞癌干细胞的表面标志物。且CD73的表达与肾透明细胞癌的临床分型密切相关，因此，CD73可用于肾透明细胞癌干细胞的鉴定和肾透明细胞癌的诊断、分型及检测的分子靶标，并可作为肾透明细胞癌生物治疗的靶基因。
Claims (3)
1.检测CD73的物质在制备诊断或辅助诊断待测患者肾透明细胞癌恶性程度的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述恶性程度分为G1、G2和G3三级；
所述G1级是指待测患者肾透明细胞癌限于肾包膜内；
所述G2级是指待测患者肾透明细胞癌已穿破肾包膜，侵入脂肪层，且仍局限于肾筋膜内；
所述G3级是指待测患者肾透明细胞癌已侵入肾静脉或/和下腔静脉，侵入邻近脏器或发生远处转移。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
诊断或辅助诊断待测患者肾透明细胞癌恶性程度的产品中包括记载如下诊断标准的载体：当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.41—0.57％时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G1级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.57％—0.81％时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G2级；当待测患者肾组织细胞中CD73阳性细胞比例为0.81％—1.39％或高于1.39％时，将所述待测患者肾透明细胞癌候选为所述G3级。
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