CN101261279B

CN101261279B - 子宫内膜癌诊断试剂、试剂盒及防治药物

Info

Publication number: CN101261279B
Application number: CN2008103010993A
Authority: CN
Inventors: 赵霞; 李征宇; 黄灿华; 魏于全
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2028-04-11
Also published as: CN101261279A

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种子宫内膜癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。本发明为早期诊断及防治子宫内膜癌提供了一种新的诊断试剂和药物，还为筛选防治子宫内膜癌的药物提供了一种新方法。本发明子宫内膜癌诊断试剂含有可检测人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA的含量的试剂。本发明防治子宫内膜癌的药物如：能表达人亲环素A的shRNA分子的表达载体等能改变人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA的含量。本发明诊断试剂可以用于早期诊断子宫内膜癌，具有广阔的应用前景。

Description

子宫内膜癌诊断试剂、试剂盒及防治药物

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种子宫内膜癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。

背景技术

子宫内膜癌作为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20-30％，在某些欧美国家已居女性生殖道恶性肿瘤首位，严重威胁妇女健康。随着社会发展和人类平均寿命的延长，内膜癌发病率逐年上升并伴有年轻化趋势。子宫内膜癌如果能做到早期诊断，合理治疗，其预后一般较好。子宫内膜癌的主要临床表现为不规则***流血，与卵巢癌等其他肿瘤不同，临床诊断主要依靠诊断性***，但哺乳期或浸润型子宫内膜癌的患者，其子宫壁薄弱，***时可能会造成穿孔，给患者造成伤害。

Cyclophilin A蛋白(CYPA)又称亲环素A(Gene Bank No.NP_066953)，位于胞质及胞核，具有肽酰脯氨酰顺反式异构酶活性，参与蛋白质折叠、装配与运输；在细胞内与环孢素A结合，抑制T细胞活化途径，表现出免疫抑制作用，此外还参与氧化应激诱导及胆固醇代谢过程，并发挥细胞因子的功能。研究发现该蛋白与自身免疫性疾病有比较密切的联系，在***性红斑狼疮、银屑病、类风湿性关节炎等患者的血清中其抗体表达水平都较高，认为这与该蛋白的免疫抑制作用有关。后来人们发现该蛋白可能参与了HIV-1病毒的感染过程，于是人们进行了大量实验，深入探讨该蛋白在此过程中的作用，并成为该蛋白的研究热点。目前研究认为在HIV-1病毒复制过程中，该蛋白与HIV-1病毒中的gag蛋白的p24衣壳蛋白域结合，参与病毒进入细胞后的脱衣壳过程，帮助病毒核心发生解装配，并在病毒颗粒装配过程中发挥分子伴侣作用。最近两年，在关于肿瘤蛋白质组学的研究中，又发现该蛋白在肺癌、胰腺癌、肝细胞癌等肿瘤组织中有高表达，并对其功能进行了初步的探讨，认为其异常表达与调节细胞增殖、诱导凋亡等有关。

到目前为止，未见有通过检测人亲环素A表达水平来早期诊断子宫内膜癌疾病的诊断试剂及试剂盒的相关报道，也未见有通过改变其表达水平达到防治子宫内膜癌的目的的相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对上述不足，提供一种可以早期诊断子宫内膜癌疾病的诊断试剂。

该子宫内膜癌诊断试剂含有可检测人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA的含量的试剂。

其中，上述可检测人亲环素A蛋白的表达水平的试剂包括人亲环素A蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。

进一步的，上述的多克隆抗体或单克隆抗体上耦联有标记物。

更进一步的，所述的标记物为同位素标记物或荧光标记物。

其中，上述的可检测人亲环素A基因的mRNA含量的试剂包括能特异扩增人亲环素A基因的mRNA的PCR引物。

进一步的，上述能特异扩增人亲环素A基因的mRNA的PCR引物为如下引物对：

正义链：5’-CATGGTCAACCCCACCGTGTTCTT-3’(SEQ ID NO.1)

反义链：5’-TAGATGGACTTGCCACCAGTGCCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明的第二个目的是提供一种上述诊断试剂在制备诊断子宫内膜癌疾病的试剂中的用途。

本发明的第三个目的是提供一种可以早期诊断子宫内膜癌的诊断试剂盒或生物芯片。该子宫内膜癌诊断试剂盒或生物芯片含有上述的诊断试剂。

本发明的第四个目的是提供一种用于治疗子宫内膜癌的方法，该方法能改变人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA含量。

进一步的，上述能改变人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA含量的药物可以是化学药、中药、化学药物组合物、中药组合物或生物制品中至少一种。

进一步的，上述的生物制品可以是针对人亲环素A的shRNA分子(即发夹状RNA分子)或能表达人亲环素A的shRNA分子的载体。

更进一步的，上述人亲环素A的shRNA分子包括下述核苷酸序列：

UUCUACUCUUGAAGUAGGAAAGUUCUGCUCCUACUUCAAGAGUAGAA(SEQ ID NO.7)。

更进一步的，能表达上述shRNA分子的载体包括下述核苷酸序列：

正义链：

5’-AAGATGAGAACTTCATCCTTTCAAGACGACGATGAAGTTCTCATCTTTTTTTTGTCGAC-3’(SEQ IDNO.3)

反义链：

3’-TTCTACTCTTGAAGTAGGAAAGTTCTGCTCCTACTTCAAGAGTAGAAAAA AAACAGCTG-5’。(SEQ IDNO.4)

本发明的第五个目的是提供一种筛选上述的治疗子宫内膜癌的药物的方法，该方法包括以下步骤：

a、建立子宫内膜癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；

b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA含量；

c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中人亲环素A蛋白的表达水平或其基因的mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。

本发明的建立是基于对子宫内膜癌发生发展相关蛋白的研究，采用双向电泳分离子宫内膜癌与正常子宫内膜组织的总蛋白质，建立双向电泳图谱，寻找表达差异点，通过质谱分析鉴定出子宫内膜癌相关蛋白候选分子。共筛选出112个差异点，其中60个在癌组织中上调，52个下调。经质谱分析和数据库检索成功鉴定出99个蛋白，质谱分析成功率达88.4％，其中21个蛋白质谱结果理想，胶上差异明显，重复次数在4次以上。对鉴定出的差异蛋白进行了功能和细胞定位的分析和归类，并确定人亲环素A蛋白为子宫内膜癌相关蛋白候选分子。

本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究人亲环素A蛋白在子宫内膜癌及癌前病损中的表达，功能研究提示与子宫内膜癌密切相关的人亲环素A蛋白能应用于临床诊断、预后判断及药物开发中。

正是在上述大量的开创性研究的基础上，发明了将上述人亲环素A蛋白或其基因的mRNA作为检测目标的子宫内膜癌诊断试剂及试剂盒；同时也发明了以上述人亲环素A蛋白或其基因的mRNA作为靶标的筛选治疗子宫内膜癌药物的方法；还发明了能防治子宫内膜癌的药物，比如：得到防治效果好的shRNA分子和能表达人亲环素A的shRNA分子的质粒。

本发明创新之处及有益效果在于：本发明子宫内膜癌诊断试剂可以在早期有效诊断子宫内膜癌疾病，大大提高了患者的生存率；本发明子宫内膜癌诊断试剂只需要少量子宫内膜上皮组织即可进行有效诊断，避免了现有的***诊断子宫内膜癌给患者造成的伤害；本发明子宫内膜癌诊断试剂能准确诊断出患者的子宫内膜癌的分化情况，有利于医生选择适合的药物及方法对患者进行针对性治疗。本发明防治子宫内膜癌疾病的药物，如：人亲环素A的shRNA分子、能表达人亲环素A的shRNA分子的载体等药物可以有效防治子宫内膜癌，为临床子宫内膜癌疾病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治子宫内膜癌疾病的药物的方法，为寻找防治子宫内膜癌疾病的药物提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是构建的shRNA质粒结构图；

图2是裸鼠肿瘤体积测量结果图，纵坐标为肿瘤体积，横坐标为接种HEC-1-B后的天数；

图3是人亲环素A表达结果图；

图4是免疫组化分析结果图，是PCNA在肿瘤组织中的表达结果，纵坐标为PCNA表达阳性细胞百分率。

图5是TUNEL检测结果图，纵坐标为TUNEL表达阳性细胞百分率。

图6为TUNEL检测的结果图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例一人亲环素A蛋白为子宫内膜癌发生发展相关蛋白的初步确定

1、子宫内膜样腺癌及增生期正常子宫内膜组织标本来源

本实施例选用的子宫内膜癌组织标本于2006年3月～5月采集自四川大学华西第二医院妇产科接受手术治疗的子宫内膜癌患者。患者年龄分布在45～60岁之间，平均年龄为52.75±4.71岁。所有患者术前未经化疗、放疗，术后病理诊断明确，临床资料齐备。正常子宫内膜标本于同期采集自该院妇产科接受手术治疗的子宫肌瘤等良性疾病患者。患者年龄分布在41～50岁，平均年龄为45.63±3.42岁。所有患者术前无激素服用史，临床资料齐备。8例癌组织标本均为子宫宫内膜样腺癌，其中高分化腺癌3例，中-低分化腺癌5例；手术-病理分期为I_b期4例，I_c期3例，II_a期1例。8例正常内膜标本均为增生期正常宫内膜。子宫内膜癌分期参照国际妇产科联盟(FIGO)1988年手术病理分期标准，病理组织学分级参照WHO分级标准。

组织标本切下后，PBS液反复清洗，去除血污及坏死组织，滤纸吸干，切为0.5cm直径大小组织块，以冻存管分装，标记，迅速保存于液氮备用。

2、试剂来源

双向电泳相关试剂：变性剂尿素(UREA)，表面活性剂CHAPS，还原剂TBP、DTT，载体两性电解质ampholyte，Dnase I，Rnase A，碘乙酰胺，SDS，丙烯酰胺，哌嗪双丙烯酰胺，Tris，低熔点琼脂糖，ReadyStrip^TMIPG胶条(17cm)，考马斯亮蓝(Coomassiebrilliant blue)G250染料，蛋白定量试剂Protein Assay Kit均购自Bio-Rad公司；硫脲，蛋白酶抑制剂PMSF，交联引发剂TEMED、APS，矿物油购自Sigma公司。

酶解及质谱分析相关试剂：胰蛋白酶Trypsin Gold购自Promega公司；乙腈(ACN)，三氟乙酸(TFA)，碳酸氢胺，甲酸均为色谱纯级，购自Sigma公司；基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自Sigma公司。

3、方法

取8例子宫内膜样腺癌和8例增生期正常子宫内膜组织标本，配对分为8组。提取组织总蛋白，通过双向电泳技术分离总蛋白，并得到8组双向电泳凝胶图谱。通过PDQuest7.1.1软件对图像进行裁剪、斑点检测和匹配分析，评价图像的匹配率，并检测出表达差异点。将差异点切下后进行胶上原位酶解，然后通过基质辅助激光解吸电离四极杆飞行时间质谱(MALDI-Q-TOF MS/MS)及蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定。在鉴定出的差异点中选择表达恒定，差异明显且稳定，质谱结果理想可靠的蛋白即为子宫内膜癌相关蛋白候选分子。

4、结果及分析

对8组子宫内膜癌和正常子宫内膜组织标本进行随机配对，然后进行双向电泳，共得到8组双向电泳凝胶图象。使用PDQuest 7.1.1分析软件对凝胶图象进行裁剪、自动斑点检测，得到子宫内膜癌与正常子宫内膜组织凝胶图象上检测的斑点数分别为782±28和760±33。通过建立标准胶进行匹配分析，得到各组内两张胶的匹配率(％)平均为85.625±4.2。任意选取凝胶中较为清晰的20个斑点，以其中一个点为坐标，检测其他点在位置上的偏差。结果显示各点在位置上有较好的重复性，在第一向IEF与第二向SDS-PAGE方向上的偏差都很微弱。

使用PDQuest 7.1.1分析软件对各组的两张胶建立标准胶，经过坐标校正，在各组内两张凝胶图像之间进行差异点的检测。通过建立分析组，将差异点定义为两张胶之间浓度差异2.5倍以上，并且在8组图像中重复至少两次以上有相同变化的点。根据此定义，共筛选出差异点112个，其中60个在癌组织中上表达上调，52个表达下调。

为验证图像匹配结果的准确性，选取了同一组两张胶上相互匹配的点进行质谱分析，搜索数据库后发现均为同一蛋白，提示图像分析结果可信。将经图像差异分析筛选的112个点进行胶上原位酶解后，进行MALDI-Q-TOF串级质谱分析。经一级质谱检测后得到肽质量指纹图谱(PMF)，每个样品自动选取丰度最强的10个肽段进行二级串级质谱(MS/MS)检测。所有检测点均获得质谱图谱，大部分质谱图峰信号强，信噪比高，结果理想；少数信号较弱。

质谱数据解谱使用MassLynx 4.1控制软件，从原始的MS/MS谱中产生PKL格式的数据文件，在Mascot检索***(http://www.matrixscience.com)内以NCBInr为数据库进行检索。每次检索时，根据输入的PKL数据，数据库将根据其与库内储存数据进行匹配，得到若干候选蛋白分子，并根据MOWSE得分多少排序，并产生一个及格线。最高分超过及格线者认为检索结果有意义，未达及格线则认为检索无结果。得分高低表示匹配性高低，即可能性的大小。理想的检索结果应为第一候选蛋白得分较高，其他候选蛋白得分较低(低于及格线)，二者分数相差较大，并且该蛋白肽段匹配数目较多，氨基酸序列覆盖率较高，则该检索结果可靠性较高。根据此标准，112个差异蛋白点中经检索，有99个点得到检索结果，13个点未检索到相应结果。质谱分析成功率达88.4％。在鉴定出的99个蛋白分子中，选择了21个质谱检索结果理想，并且胶上差异表达明显，重复相同变化达4次以上的蛋白分子，计算其表达差异量。

在鉴定出的99个蛋白分子中，在癌组织中上调55个，下调44个。

对癌相关蛋白进行后续验证的候选分子的选择，按以下标准：

(1)在子宫内膜癌与正常子宫内膜组织之间差异显著，PDQuest 7.1.1分析软件计算表达差异应在5倍以上；

(2)在子宫内膜癌与正常子宫内膜组织中，分别表达恒定，且表达量较高；

(3)差异重复性好，重复至少应在4次(50％)以上；

(4)质谱检测信号强，信噪比高；

(5)信息学检索，MOWSE得分较高，可靠性理想；

(6)功能检索提示该蛋白应具有较重要生理功能，且目前在癌症研究领域文献报道较少，与子宫内膜癌的基础研究与临床实践尚无确切联系。该蛋白与子宫内膜癌的相关性具有一定临床意义。

根据以上标准，在99个鉴定出的差异蛋白中，确定人亲环素A作为癌相关蛋白候选分子。该蛋白在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中表达恒定，分别为136.133±53.857和6.067±4.652(PDQuest表达强度值)；差异明显，二者表达差异为27.23±9.52倍；质谱鉴定结果理想，匹配肽段4个，氨基酸序列覆盖率36％，MOWSE得分139，该蛋白序列含氨基酸165个，序列覆盖率为36％，匹配4个肽段，分别为第2-19、56-69、56-69、77-91、132-144位氨基酸。

实施例二人亲环素A蛋白为子宫内膜癌发生发展相关蛋白的验证

采用RT-PCR和Western Blot方法对人亲环素A在子宫内膜癌与正常子宫内膜组织间的表达差异在mRNA和蛋白水平进行验证。

1、试剂来源

RT-PCR相关试剂：Trizol Reagent购自Invitrogen公司；Oligo(dT)、MgCl₂、dNTPmix、RNase Inhibitor、AMV-Optimized Taq、AMV RTase XL等购自TaKaRa公司。

Wstern Blot相关试剂：兔抗人人亲环素A多克隆抗体购自Upstate公司；小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG与羊抗小鼠IgG(二抗)购自北京中衫金桥生物技术有限公司；蛋白质预染Marker购自MBI公司；硝酸纤维素(NC)膜购自Millipore公司；Tween-20、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

2、mRNA水平人亲环素A的表达差异验证

2.1 RT-PCR引物序列设计与合成

设计RT-PCR引物，并由英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成，具体见表1(其中，GAPDH为看家基因，其作为内参，确保上样量一致)。

表1 RT-PCR引物序列及产物片段大小

基因名称	引物序列	产物bp
			人亲环素A	正义链：5’-CATGGTCAACCCCACCGTGTTCTT-3’(SEQ IDNO.1)反义链：5’-TAGATGGACTTGCCACCAGTGCCAT-3’(SEQ IDNO.2)	236
CD147	正义链：5’-AGCGGTTGGAGGTTGTAGG-3’(SEQ IDNO.3)反义链：5’-GGGAGGAAGACGCAGGA-3’(SEQ ID NO.4)	311
			GAPDH	正义链：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(SEQ IDNO.5)反义链：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ IDNO.6)	352

2.2组织总RNA提取(Trizol法)

从实施例一中的液氮中取出30mg组织样品，迅速于液氮下充分研磨至粉末，置于0.5ml Trizol试剂中，反复吹打以裂解组织细胞，室温下静置5分钟。按1/5体积加入氯仿，剧烈振荡，室温下静置2分钟，4℃12,000g离心15分钟。取上层水相，加入0.25ml异丙醇，室温静置10分钟，4℃12,000 g离心15分钟。弃上清，加入0.5ml 75％乙醇涡旋洗涤，4℃下8,000g离心5分钟。弃上清，自然干燥，以RNase-free水溶解RNA。取少量进行1％琼脂糖电泳鉴定，紫外分光光度计检测浓度、纯度，分装置-80℃保存备用。RNA纯度根据A260nm/A280nm比值判定，比值小于1.6提示有蛋白杂质，1.6-1.8提示含有DNA，在1.8-2.0之间提示RNA纯度较高，无降解、无杂质。

本实施例中提取的RNA的A260nm/A280nm比值为1.85，因此，其纯度较高，无降解、无杂质。

2.3 cDNA第一链的合成

取本实施例1.2提取的总RNA2μl(1μg/μl)经RNase Free DNase消化除去可能存在的痕量DNA后，与1μl Oligo(dT)(0.5μg/μl)混合，加RNase Free水定容至12μl，混匀后65℃水浴5分钟使二级结构变性，立即置冰浴冷却。然后按以下反应体系(表2)42℃逆转录45分钟，95℃5分钟灭活AMV-RTase XL，立即置冰浴冷却。-20℃保存合成的cDNA。

表2 RNA逆转录反应体系

试剂	体积
		Oligo(dT)	1μl
10mM dNTP mix	1μl
		RNase Inhibitor(40U/μl)	0.5μl
AMV RTase XL(5U/μl)	0.5μl
		5×First Strand Buffer	4μl
DTT(0.1M)	2μl
		RNA模板	2μl
RNase-free Water	9μl
		Total	20μl

2.4 PCR反应

取上述合成的cDNA 5μl为模板进行PCR扩增。反应体系50μl，如表3；反应条件如表4。

表3 PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR Buffer	5μl
MaCl₂(25mM)	4μl
		AMV-Optimized Taq	1μl
上游引物(20μM)	1μl
		下游引物(20μM)	1μl
cDNA	5μl
		dNTP mix(2.5mM)	4μl
RNase Free Water	29μl
		Total	50μl

表4 PCR反应条件

步骤	温度，℃	时间，分钟	循环次数
				起始变性	94	2	1
变性	94	0.5
				退火	①60②57.5③50	0.5	30
延伸	72	0.5
				最终延伸	72	10	1

注：退火温度①为人亲环素A；②为CD147；③为GAPDH

2.5图像及结果分析

PCR反应结束后，取部分产物进行1.5％琼脂糖电泳，紫外光下扫描成像。使用QuantityOne 4.6分析软件对图像进行分析，以扩增产物条带的光密度值(Density)，相对于GAPDH反映该基因在RNA水平的表达。如表5所示，4例子宫内膜癌组织人亲环素A表达强度平均为90.15±17.04；对应的4例正常子宫内膜组织表达强度为36.2±5.09，在癌组织中该基因mRNA表达为正常组织中的2.49倍，有显著性差异(t检验，P＜0.01)。此结果显示了相对于正常组织，人亲环素A的mRNA在癌组织中的高表达，证明了人亲环素A蛋白为子宫内膜癌发生发展相关蛋白。

表5 RT-PCR检测人亲环素A mRNA表达

基因	子宫内膜癌	正常子宫内膜	T/N	P值^*
					人亲环素A	90.15±17.04	36.2±5.09	2.49	P＜0.01

注：表达强度以光密度值表示；T：子宫内膜癌；N：正常子宫内膜；*t检验

3、蛋白水平人亲环素A的表达差异验证

3.1组织总蛋白样品制备

从实施例一中的液氮中取出30mg组织样品，迅速于液氮下充分研磨至粉末，置于400ml Modified RIPA组织裂解缓冲液，震荡混匀。冰浴下超声数次，使裂解液清亮，4℃孵育1小时，然后置4℃下高速离心12,000g×15分钟，取上清，标记，置-80℃保存，备用。

3.2 SDS-PAGE电泳

制备浓度分别为12％和5％的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶(表6)。以提取的组织总蛋白为样品，以结构蛋白β-actin作为内参，上样前按Bradford法对样品进行蛋白浓度测定，以确保上样量和上样体积的一致性。然后在样品中加入等体积2×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟，离心12,000g×5分钟，取上清。每孔上样15μl(蛋白含量30μg)，并加上预染蛋白Marker。电泳时起始电压80V，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，调整为120V，至指示剂到达底部边缘时停止电泳，取出凝胶，切角作记号。

表6 5％浓缩胶与12％分离胶配置方法

5％浓缩胶	体积(ml)	12％分离胶	体积(ml)
				ddH₂O	1.4	ddH₂O	1.1
30％丙烯酰胺	0.33	30％丙烯酰胺	2.5
				1M Tris(pH 6.8)	0.25	1.5M Tris(pH 8.8)	1.3
10％SDS	0.02	10％SDS	0.05
				10％APS	0.02	10％APS	0.05
TEMED	0.002	TEMED	0.003
				Total	2	Total	5

3.3转膜

依据凝胶的大小剪取滤纸6片和NC膜1张，将凝胶、滤纸、膜置于转移缓冲液中平衡10分钟。然后按顺序装配转移三明治：负极-海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵-正极；置于转移槽内在冰浴下进行转膜。转膜电压100V，时间50分钟，结束后将膜取出。

3.4免疫杂交与显色

PBS液洗膜5分钟后，置于25ml封闭缓冲液中，室温下封闭2小时。PBST缓冲液漂洗3次后，加入1∶5000稀释的兔抗人人亲环素A抗体或1∶500稀释的小鼠抗人β-actin抗体，4℃孵育过夜。PBST缓冲液漂洗3次后，加入1∶10000稀释的HRP标记羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG，室温孵育1小时，PBST缓冲液漂洗3次。将膜置于预先配置的DAB显色液，显色3分钟后置蒸馏水中终止。

3.5图像及结果分析

将膜扫描成像后，使用Quantity One 4.6分析软件对图像进行分析，以显色条带的光密度值(Density)，相对于β-actin反映该蛋白的表达情况。如表7所示，2例子宫内膜癌组织人亲环素A表达强度平均为62.45±2.75；对应的2例正常子宫内膜组织表达强度为24.45±2.05，在癌组织中该蛋白表达为正常组织中的2.55倍，有显著性差异(t检验，P＜0.01)。此结果与RT-PCR结果所示的差异趋势一致，在蛋白水平上证明了人亲环素A蛋白为子宫内膜癌发生发展相关蛋白。

表7 Western Blot检测人亲环素A蛋白表达

蛋白分子	子宫内膜癌	正常子宫内膜	T/N	P值^*
					人亲环素A	62.45±2.75	24.45±2.05	2.55	P＜0.01

实施例三、免疫组化分析人亲环素A在子宫内膜癌与正常子宫内膜组织上的表达

1、组织样品来源

石蜡标本来自四川大学华西第二医院病理科。其中子宫内膜癌标本采集自2005年3月～2006年3月四川大学华西第二医院妇产科接受手术治疗的子宫内膜癌患者，共52例。病理诊断均为子宫内膜样腺癌，其中高分化腺癌20例，中分化腺癌20例，低分化腺癌12例；手术病理分期为I期40例，II期8例，III期4例。正常子宫内膜标本同期采集自该院妇产科接受手术治疗的子宫肌瘤、子宫腺肌症等良性疾病患者，共39例。病理诊断均为增生期正常子宫内膜。所有患者临床资料齐备。子宫内膜癌分期参照国际妇产科联盟(FIGO)1988年手术病理分期标准，病理组织学分级参照WHO分级标准。以上病理诊断均由资深病理医师复核。

2、试剂来源

EnVision+辣根过氧化物酶(HRP)免疫组化染色***购自DakoCytomation公司，其中包括过氧化物酶封闭液(Peroxidase Block)、辣根过氧化物酶标记多聚物结合羊抗兔IgG(Labelled Polymer-HRP ANTI-RABBIT)、底物缓冲液(Substrate Buffer)、DAB染色液(DAB+Chromogen)。

3、组织切片准备

将石蜡组织块做4μm连续切片5张，裱于APES预处理的玻片上，65℃烤片2小时后，置4℃长期保存。每例标本均取一张切片进行常规HE染色。

4、Envision+免疫组化法，步骤参考试剂盒操作指南(Dako公司)

①62℃烤片4小时，二甲苯脱蜡两次，每次10分钟。

②100％、90％、80％、70％梯度酒精依次脱水，每次2分钟，蒸馏水洗涤两次，每次2分钟。

③灭菌锅内煮沸抗原修复液，将切片放入，继续煮沸15分钟。自来水冲洗10分钟。

④3％过氧化氢封闭10分钟，避光。PBST缓冲液洗涤2次，每次5分钟。

⑤蛋白封闭液封闭1小时，室温，弃多余液体，不洗。

⑥滴加1∶1000稀释的兔抗人人亲环素A抗体，置湿盒中4℃孵育过夜。PBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。

⑦滴加辣根过氧化物酶标记多聚物结合羊抗兔IgG，置湿盒中37℃孵育1小时。PBST缓冲液洗涤2次，每次5分钟。

⑧滴加新配置DAB显色液，镜下控制显色(5-10分钟)，适时终止。

⑨苏木素复染0.5分钟，自来水冲洗20分钟。依次过70％、80％、90％、100％梯度酒精，每次10分钟。自然干燥后中性树脂封片。

每批实验均设立阴性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。

5、图像分析与结果判定

人亲环素A蛋白免疫组化阳性染色主要表现为显微镜下细胞浆内出现黄色颗粒沉着，部分也可表现为胞核染色。使用ECLIPSE E600图像采集***采集图像，采用半定量综合积分和定量IOD(积分光密度)检测两种方法进行结果判定。

综合积分法[5]：按细胞显色有无及深浅计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；按显色细胞所占比例计分：0分＜5％，1分5-25％，2分26-50％，3分51-75％，4分＞76％。两者乘积即为该切片积分，0分为阴性(-)，1-3分为弱阳性(+)，4-7分为阳性(++)，8-12分为强阳性(+++)。所有切片均为盲法判定。

IOD检测法：采用Imagepro-Plus5.0显微镜图像分析软件，检测图像IOD值。该值可反映免疫组化染色的强弱。

从图像分析结果可以看出，人亲环素A蛋白在正常子宫内膜组织表达较弱，有少部分为部分胞核表达；在子宫内膜癌组织中主要为胞浆表达，并伴有少量胞核表达。根据半定量综合积分法，该蛋白在正常子宫内膜组织表达阴性(-)为23％(9/39)，弱阳性(+)为77％(30/39)，阳性(++)、强阳性(+++)均为0例；在子宫内膜癌组织表达阴性为0例，弱阳性表达为9.6％(5/52)，阳性为44.2％(23/52)，强阳性为46.2％(24/52)(表8)，二者表达有显著性差异(秩和检验，P＜0.01)。正常子宫内膜组织积分总分为44，平均分1.13±0.76；子宫内膜癌组织为355，平均分6.83±2.48，二者表达有显著性差异(t检验，P＜0.01)。此结果显示该蛋白在子宫内膜癌组织中表达显著高于正常子宫内膜组织，与实施例二的结果一致。

表8 人亲环素A在正常子宫内膜与子宫内膜癌组织中的表达

例数

-

+

++

+++*

总分

平均分**

N

39

23％(9/39)

77％(30/39)

0

44

1.13±0.76

T

52

0

9.6％(5/52)

44.2％(23/52)

46.2％(24/52)

355

6.83±2.48

注：T：子宫内膜癌；N：正常子宫内膜；*秩和检验，P＜0.01；**t检验，P＜0.01。

采用Imagepro-Plus5.0图像分析软件，检测图像IOD值。以此值表示该蛋白表达强度。结果显示人亲环素A在正常子宫内膜组织IOD值平均为5.991±1.515；在子宫内膜癌组织为34.028±6.91，同样显示在正常子宫内膜与子宫内膜癌组织上表达有显著差异(t检验，P＜0.01)。

6、人亲环素A表达与子宫内膜癌病理组织学分级关系的分析

52例子宫内膜癌标本中，参照WHO分级标准，高分化20例，中分化20例，低分化12例。根据半定量综合积分法，该蛋白在高分化子宫内膜癌组织表达阴性为0，弱阳性为15％(3/20)，阳性为75％(15/20)、强阳性为10％(2/20)，积分总分为104，平均分5.2±1.61；中分化子宫内膜癌组织表达阴性为0，弱阳性为5％(1/20)，阳性为30％(6/20)、强阳性为65％(13/20)，积分总分为148，平均分7.4±2.41；低分化子宫内膜癌组织表达阴性为0，弱阳性为8.3％(1/12)，阳性为16.7％(2/12)、强阳性为75％(9/12)，积分总分为103，平均分8.58±2.71(表9)。统计分析显示随组织分化程度降低，该蛋白的表达有升高趋势，故认为人亲环素A的表达与病理组织学分级具有关联性(列联表x²检验，P＜0.01)。积分统计也显示高分化组与中、低分化组表达均有显著差异(LSD-t检验，P＜0.01)，而中、低分化组间差异不明显(LSD-t检验，P＞0.05)。

表9 人亲环素A表达与子宫内膜癌病理组织学分级关系

分级

例数

-

+

++

+++*

总分

平均分**

高分化

20

0

15％(3/20)

75％(15/20)

10％(2/20)

104

5.2±1.61

中分化

20

0

5％(1/20)

30％(6/20)

65％(13/20)

148

7.4±2.41

低分化

12

0

8.3％(1/12)

16.7％(2/12)

75％(9/12)

103

8.58±2.71

注：*列联表x²检验，P＜0.01；**LSD-t检验，P＜0.01(高与中、低)、P＞0.05(中与低)；N：正常子宫内膜；T：子宫内膜癌；0分为(-)，1-3分为(+)，4-7分为(++)，8-12分为(+++)。

7、人亲环素A表达与子宫内膜癌手术-病理分期关系的分析

参照国际妇产科联盟(FIGO)1988年手术-病理分期标准，52例子宫内膜癌标本中，I期40例，II期8例，III期4例。I期病例癌局限于子宫内膜或浸润肌层，II期病例累及宫颈，III期病例盆腔***转移。根据半定量积分法，I期病例中表达阴性为0，弱阳性10％(4/40)，阳性42.5％(17/40)，强阳性47.5％(19/40)，积分总分274，平均6.85±2.56；II期病例中表达阴性为0，弱阳性12.5％(1/8)，阳性50％(4/8)，强阳性37.5％(3/8)，积分总分53，平均分6.63±2.77；III期病例中表达阴性与弱阳性均为0例，阳性表达2/4，强阳性表达2/4，积分总分28，平均分7.00±1.15(表10)。统计结果显示随手术-病理分期改变，该蛋白的表达无变化趋势，故人亲环素A的表达与手术-病理分期无关联性(列联表x²检验，P＞0.05)，积分统计也显示各期别间该蛋白表达差异不明显(方差分析，P＞0.05)。

表10 人亲环素A表达与子宫内膜癌手术-病理分期关系

分期

例数

-

+

++

+++*

总分

平均分**

I期

40

0

10％(4/40)

42.5％(17/40)

47.5％(19/40)

274

6.85±2.56

II期

8

0

12.5％(1/8)

50％(4/8)

37.5％(3/8)

53

6.63±2.77

III期

4

0

2/4

28

7.00±1.15

注：*列联表x²检验，P＞0.05；**方差分析，P＞0.05。

实施例四本发明子宫内膜癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片的制备及检测效果

在实施例一和实施例二确定了人亲环素A与子宫内膜癌的关系后，通过本领域的常规技术制备得到可检测人亲环素A的表达水平及其mRNA含量的试剂，比如耦联有标记物的人亲环素A蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体，以及能特异扩增人亲环素A基因的mRNA的PCR引物，用这些作为主要原料制得到本发明子宫内膜癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片。

用实施例二的引物对(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示序列)、和RT-PCR所需的其他试剂体系相应的试剂体系制得本发明子宫内膜癌诊断试剂，用实施例二的方法检测病人子宫内膜组织细胞中人亲环素A基因的mRNA的表达量，如果病人子宫内膜组织细胞中的人亲环素A基因的mRNA的表达量比正常水平明显偏高，则可确定病人已患有子宫内膜癌疾病；通过比较免疫组化染色强度(与表9中数据比较)，即可确定患者子宫内膜癌分化阶段，即高分化或中、低分化。

实施例五、特异性针对人亲环素A的shRNA的表达质粒构建及药效验证

1、短发夹shRNA的表达质粒构建

特异性针对CYPA(人亲环素A)序列265-283bp的短发夹shRNA序列设计如下：

正义链(SEQ ID NO.3)：

5’-

AAGATGAGAACTTCATCCT TTCAAGACG AGGATGAAGTTCTCATCTTTTTTTTGTCGAC

-3’

反义链(SEQ ID NO.4)：

3’-

TTCTACTCTTGAAGTAGGAAAGTTCTGCTCCTACTTCAAGAGTAGAAAAAAAACAGCTG

-5’

引物结构：

以TTCAAGACG为发夹环，GATCC为转录终止子。无序序列GAC TTC ATA AGG CGC ATG C为阴性对照(SV)。含卡那霉素耐药基因的Pgenesil-2质粒(晶赛公司，武汉)通过BamHI和HindIII(NEB，London，UK)双酶切线性化，寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与质粒载体连接。连接产物转化感受态细胞DH5α，并挑选阳性克隆，按标准方法扩增质粒载体，并以SaII进行酶切鉴定表明目的片段已经连接在了Pgenesil-2载体上。然后外送表达载体测序，结果表明转染成功，获得了CYPA-shRNA表达载体(质粒结构如图1所示)。构建的该表达载体所表达的人亲环素A的shRNA分子的核苷酸序列为：

UUCUACUCUUGAAGUAGGAAAGUUCUGCUCCUACUUCAAGAGUAGAA(SEQ ID NO.7)。

2、动物模型建立、药物筛选与药效确认

每只健康雌性BALB/C裸鼠(由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室提供，裸鼠年龄：6-8周；未生育；重量：18-20克)右肋下注射含有5×10⁶HEC-1-B细胞的100μlPBS悬液。当6天后瘤体直径达到0.6cm左右时，裸鼠随机分为4组，每组5只。

未处理组(mock)：PBS 100μl；

脂质体组(lipo)：脂质体lipofectamine 20006 2.5μg/100μlPBS；

阴性对照组(sv)：无序载体25μg/100μlPBS；

CYPA-shRNA组(sh-CYPA)：CYPA-shRNA载体25μg/100μlPBS。

质粒与脂质体比例为1∶2.5。以上处理均为瘤内注射，每3天一次。第8次注射后3天处死裸鼠。治疗的副作用，如体重，食欲和行为等也同时记录。

2.1、肿瘤体积测量与组织学分析

肿瘤体积在接种后每3天测量一次直至裸鼠被处死，按以下公式计算：0.52×最长径×最短径²。剥离的肿瘤以中性***固定，石蜡包埋，并切片进行HE染色，在显微镜下观察进行组织学检测。

结果：当对裸鼠进行了8次注射后处死裸鼠，瘤体被剥离称重。虽然各组肿瘤初始体积相同，但经过治疗后，各组肿瘤体积生长产生了明显差异，如图2所示。即使sh-CYPA没有实现对肿瘤的完全抑制，但与其他各组相比，其肿瘤生长仍得到更为显著抑制。而且在第6次注射后，还观察到肿瘤体积的缩小。PBS组，脂质体组和阴性对照组，平均体积分别为603.64±59.68；563.16±61.87；534.17±61.73mm³。而sh-CYPA处理组体积仅为159.56±43.33mm³，较其他各组减少70-74％(P＜0.01)。对肿瘤进行免疫组化分析也证实了在sh-CYPA组CYPA表达的显著下降，与各对照组相比，处理组CYPA表达下降60％以上(P＜0.01)，如图3所示。

2.2、免疫组化分析

试验分组及处理同前。采用抗体为兔抗人CYPA抗体，羊抗人PCNA抗体(Santa Cruz公司)。结果分析方法：CYPA抗体同前，PCNA抗体：在5个随机视野中，计算核阳性细胞的百分比。为检测细胞的凋亡，还进行了TUNEL实验，试验分组及处理同前，TUNEL试验方法采用常规方法。

结果：如图4所示，PBS组，脂质体组和阴性对照组中PCNA表达阳性细胞百分率分别为89.4±6.42，87.6±7.09，81.6±9.73。而sh-CYPA处理组则为39.0±11.13(P＜0.01)。表明sh-CYPA处理引起显著的细胞增殖抑制。

在TUNEL检测中(染色照片见图5，计数结果见图6)，PBS组，脂质体组和阴性对照组中TUNEL阳性细胞百分率分别为6.6±2.70，8.2±2.86，11.6±4.39。而sh-CYPA处理组则为29.2±7.62(P＜0.01)，显著高于其他各组。此外，在PBS组，脂质体组和阴性对照组之间，细胞增殖与凋亡未发现明显差异，提示脂质体与阴性对照载体对肿瘤生长无显著影响。说明本发明sh-CYPA能够显著地引发肿瘤细胞调亡。

为判断以上处理是否有潜在的毒副作用，治疗期间观察了裸鼠可能的毒性反应，在体重，食欲和行为等方面，均未发现显著异常。对裸鼠肝，肾，心脏，肺等器官的石蜡切片进行组织学观察，也未见病理学改变。这些结果显示通过shRNA抑制CYPA表达，可显著抑制体内肿瘤细胞增殖与促进细胞凋亡，并导致肿瘤生长抑制，没有明显毒副作用，即本发明能表达人亲环素A的shRNA分子的载体可以有效治疗子宫内膜癌疾病。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>子宫内膜癌诊断试剂、试剂盒及防治药物

<130>A080085K

<160>7

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial

<400>1

catggtcaac cccaccgtgt tctt 24

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial

<400>2

tagatggact tgccaccagt gccat 25

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial

<400>3

aagatgagaa cttcatcctt tcaagacgac gatgaagttc tcatcttttt tttgtcgac 59

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

ttctactctt gaagtaggaa agttctgctc ctacttcaag agtagaaaaa aaacagctg 59

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

accacagtcc atgccatcac 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>7

<211>47

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

uucuacucuu gaaguaggaa aguucugcuc cuacuucaag aguagaa 47

Claims

1.能改变人亲环素A的蛋白表达水平或其基因的mRNA含量的药物在制备防治子宫内膜癌的药物中的用途：所述能改变人亲环素A的蛋白表达水平或其基因的mRNA含量的药物为人亲环素A的shRNA分子或能表达人亲环素A的shRNA分子的表达载体；所述的人亲环素A的shRNA分子核苷酸序列为下所示：

UUCUACUCUUGAAGUAGGAAAGUUCUGCUCCUACUUCAAGAGUAGAA。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的能表达人亲环素A的shRNA分子的表达载体中表达人亲环素A的shRNA分子的核苷酸序列为：

正义链：

5’-AAGATGAGAACTTCATCCTTTCAAGACGACGATGAAGTTCTCATCTTTTTTTTGTCGAC-3’

反义链：

3’-TTCTACTCTTGAAGTAGGAAAGTTCTGCTCCTACTTCAAGAGTAGAAAAAAAACAGCTG-5’。

3.防治子宫内膜癌的药物，所述药物为人亲环素A的shRNA分子或表达该shRNA分子的表达载体，其特征在于：所述的人亲环素A的shRNA分子序列为：

UUCUACUCUUGAAGUAGGAAAGUUCUGCUCCUACUUCAAGAGUAGAA。

4.根据权利要求3所述的防治子宫内膜癌的药物，其特征在于：所述的表达载体中用于表达人亲环素A的shRNA分子的核苷酸序列为：

正义链：

5’-AAGATGAGAACTTCATCCTTTCAAGACGACGATGAAGTTCTCATCTTTTTTTTGTCGAC-3’

反义链：

3’-TTCTACTCTTGAAGTAGGAAAGTTCTGCTCCTACTTCAAGAGTAGAAAAAAAACAGCTG-5’。