CN101592664A - 乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫分析技术领域，涉及一种乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒。主要由乙肝e抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗体校准品、化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管组成。本发明可用于临床检测人血清中乙肝e抗体含量，具有简便、快速、重复性好等优点。

Description

乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体地，本发明提供了一种乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎是一种严重的常见的肝脏疾病，在全球影响到数百万人。目前全球人口中，超过20亿人已经在其生命中的某个时期感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中，大约3.5亿仍然为慢性感染者，成为病毒的携带者。全世界四分之三的人口生活在感染的高发区。每年HBV急性临床病例超过4百万，携带者中大约25％，也就是每年100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。

对于HBsAg阳性的慢性感染患者，HBeAg和Anti-HBe可以用于确定感染的状态。Anti-HBe在Anti-HBc后出现，它的出现与降低的传染性相关。在疾病的恢复期，Anti-HBe将替代HBeAg。HBeAg向乙型肝炎病毒e抗体(Anti-HBe)的血清转换预示着循环中HBV DNA的减少。HBeAg以及Anti-HBe在HBsAg阳性的患者的病情监测中具有及其重要的意义。

目前用于检测乙肝病毒血清标志物的免疫方法主要有酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫荧光测定(fluoroimmunoassay，FIA)以及化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)等。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。

放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有一定污染性，并存在仪器成本贵，灵敏度不高，操作复杂，测定结果不稳定，试剂保存时间短等缺点。酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10^-18摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，又因为酶标记物稳定，可长期使用，因而得到了越来越多的关注。

免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒径大小的磁性微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒。制备好的免疫磁颗粒可以悬浮于液体中，这为免疫反应提供了更多的可接触面积，同时，免疫磁微粒可以在液体中运动，加速抗原抗体碰撞的几率，使反应快速，充分，并且可重复性好而越来越受到大家的青睐。

发明内容

本发明利用免疫磁微粒为载体，结合化学发光免疫分析技术开发了一种简便、快速、特异、稳定的乙肝e抗体测定试剂盒。

本发明的目的是提供一种乙肝e抗体的磁微粒化学发光免疫测定试剂盒。

本发明的试剂盒包括：乙肝e抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗体校准品、化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

本发明试剂盒的制备方法包括以下步骤：

a)配制乙肝e抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液：

混合液是由乙肝e抗体包被的磁微粒和辣根过氧化物酶乙肝e抗体以体积比为1∶1混合，以含20～40％的新生牛血清的磷酸盐缓冲液配制而成；

所述磁微粒为1～10μm粒径、三氧化二铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为1～10mg/mL；

所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法将乙肝e抗体包被于磁微粒上，以含有0.5％～2.0％牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液为封闭液封闭包被的磁微粒。

b)配制乙肝e抗原作为中和抗原试剂：所述中和抗原是为基因工程制备的乙肝e抗原。

c)以多克隆乙肝e抗体配制校准品：辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体是以改良过碘酸钠法标记制备。

d)配制化学发光底物液：所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液包括10mM鲁米诺、0.5mM的1，6-二溴-2-苯酚、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.1M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；B液包括3.5mM过氧化脲、0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。

e)配制浓缩洗涤液；洗涤缓冲液是含有0.1～0.5％吐温-20、0.1％生物防腐剂的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。使用时用蒸馏水稀释20倍。

f)分装上述半成品及反应管：试剂盒使用的反应管材料为透明塑料或玻璃。组装即为成品试剂盒。

根据本发明的试剂盒，乙肝e抗体包被的磁微粒先与中和抗原即乙肝e抗原结合生成磁微粒e抗体-e抗原复合物，当待测样品中含有乙肝e抗体时，则与酶标记的乙肝e抗体同时与磁微粒复合物竞争结合，当样品中不含乙肝e抗体时，则酶标记的乙肝e抗体直接与磁微粒复合物反应，洗涤除去游离酶标记物后，加入化学发光底物液，通过化学发光仪读数，其产生的信号与样本中乙肝e抗体的含量成反比。本发明采用“中和抑制法”反应模式，有效地利用了化学发光技术结合磁微粒和化学发光免疫分析技术，定量检测人体血清、血浆样品中乙肝e抗体。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。

本发明“乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒”可以非常有效地检测出样品中乙型肝炎病毒e抗体的含量。具有简便、快速、重复性好等优点，可为临床乙肝检测提供一种很好的方法。

具体实施方式

实施例1制备本发明的乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒

一、乙肝e抗体包被磁微粒与辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液的制备

1、乙肝e抗体包被磁微粒的制备

将粒径为1～10μm的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀3小时后，加磁场，静置20～25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50～100mg/mL；每毫升悬浮液中加入乙肝e抗体40～100μg，在4℃下搅拌过夜后，加磁场，静置10～15min，倒出上清，用含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭3～4小时；最后用pH值为7.4、含吐温-20和生物防腐剂的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3～5次，并用该溶液配制成5～10mg/mL的工作液。磁微粒在4℃保存。

2、辣根过氧化物酶标记的乙肝e抗体的制备

辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体采用改良过碘酸钠法，具体标记过程如下：溶解4.4mg HRP于1mL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min，经1mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 4.4透析后加入8mg乙肝e抗体，搅拌2h，最后用200mmol/L NaBH₄进行还原，经0.02M PBS缓冲液透析后，加等体积甘油，-20℃以下保存。

3、混合液的制备

将乙肝e抗体包被磁微粒与辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体以体积比为1∶1混合，以20～40％新生牛血清配制而成。

二、中和用乙肝e抗原的制备

用含1％BSA的pH 7.4磷酸盐缓冲液对乙肝e抗原进行稀释，选择合适的浓度，制备成中和抗原，分装。

三、乙肝e抗体校准品的制备

用马血清将高浓度乙肝e抗体稀释成校准品，浓度分别为0NCU/mL、2NCU/mL、4NCU/mL、8NCU/mL、16NCU/mL、32NCU/mL，共6瓶。

四、酶标记物的制备

先配制酶稀释液，每1000ml酶稀释液中含Tris 12.12g，BSA 5g，甘油100ml，Proclin300 1ml，加双蒸水至900ml，用盐酸调pH至7.4，再用双蒸水定容至1000ml，配成酶稀释液。采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1∶1000～5000。

五、配制化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

A液：A液包括10mM鲁米诺、0.5mM的1，6-二溴-2-苯酚、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.1M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0。

B液：包括3.5mM过氧化脲、0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。

使用方法：A、B液双组分试剂，在使用前根据使用量等体积混合，或先加一份的A液，再加一份等体积的B液，混匀。

六、配制浓缩洗涤液

洗涤缓冲液是含有0.1～0.5％吐温-20、0.1％生物防腐剂的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。使用时用蒸馏水稀释20倍。

七、半成品及成品组成

上述试剂及反应管经检验合格后进行分装，贴上标签，即为半成品。再把各半成品根据要求组装成成品试剂盒。

实施例2本发明的试剂盒的使用方法

一、样品的准备

采用正确医学方法收集病人血清用于检测。

二、检测方法

1、使用本试剂盒进行实验前，需先取出抗体包被磁微粒与辣根过氧化物酶标记抗体的混合液、乙肝e抗原、校准品/待测样品、酶标记的亲和素在室温放置15～30分钟，使它们平衡到室温；并注意将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。

2、将反应试管编号，向反应管中加入50μL血清样品或系列校准品溶液，校准品每管加0NCU/mL、2NCU/mL、4NCU/mL、8NCU/mL、16NCU/mL、32NCU/mL各50μL。

3、每管加入抗体包被磁微粒与辣根过氧化物酶标记抗体的混合液50μL。

4、每管再加入乙肝e抗原各50μL，37℃振荡反应30min。

5、每管加入洗涤液500μL，充分混匀，置于磁分离器上分离5min，倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复5次。

6、每管加入化学发光底物A液100μL，再加入B液100μL，充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置10min，而后在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。

7、以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Logit值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的乙肝e抗体的浓度。

实施例3本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下：

1、试剂盒精密度测定

(1)校准品精密度实验

将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，每批抽取10个试剂盒。以实施例1中所抽取的试剂盒测定4NCU/mL的HBeAb校准品5次。计算其变异系数，结果表明变异系数在4.6％～7.7％之间。

2、试剂盒准确性测定

用临检中心乙肝e抗体4NCU/ml质控血清进行检测，测值偏差小于10％。

3、试剂盒特异性、灵敏度实验

与HAV、HCV、类风湿、***性红斑狼疮等疾病未见交叉反应。用国家参考品进行检测，其中15份阴性国家参考品全部检出阴性符合率100％(15/15)，10份阳性国家参考品全部检出阳性，符合率100％(10/10)，三个系列稀释灵敏度参考血清9份全部检出阳性。

4、试剂盒稳定性实验

对实施例1的试剂盒进行37℃6天加速实验后，与4℃放置试剂盒平行检测高、中、低值质控品，结果表明37℃6天后质控血清测值偏差均小于15％，对实施例1试剂盒进行2～8℃8个月的跟踪实验，结果表明各项指标完全符合临床要求。该试剂盒在37℃放置6天和2～8℃放置8个月均能通过国家参考品标准，稳定性良好，完全符合临床需要。

实施例4本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对

用本发明试剂盒和国外知名公司的进口HBeAb化学发光试剂盒分别对1056例随机血样，其检测结果见表1

表1临床检验结果

对照试剂HBeAb阳性率为18.84％，本发明试剂临床阳性率为18.94％；两者间的总符合率为99.72％。通过以上结果表明，本发明试剂灵敏度高，特异性好，临床符合性好，且无污染，对于临床检测具有很好的推广价值。

Claims (9)

1、一种乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括乙肝e抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗体校准品、上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述乙肝e抗体包被磁微粒与辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合比例为1∶1。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述乙肝e抗原为中和抗原，采用基因工程乙肝e抗原。

4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，

A液包括10mM鲁米诺、0.5mM的1，6-二溴-2-苯酚、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.1M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；

B液包括3.5mM过氧化脲、0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

配制乙肝e抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体的混合液；配制乙肝e抗原作为中和抗原试剂；以多克隆乙肝e抗体配制校准品；配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；配制浓缩洗涤液；分装上述半成品及反应管。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述配制抗体包被磁微粒和辣根过氧化物酶标记抗体的混合液的步骤中：

所述的混合液是由乙肝e抗体包被的磁微粒和辣根过氧化物酶乙肝e抗体以体积比为1∶1混合，以含20～40％的新生牛血清的磷酸盐缓冲液配制而成；

所述磁微粒为1～10μm粒径、三氧化二铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为1～10mg/mL；

所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法将乙肝e抗体包被于磁微粒上，以含有0.5％～2.0％牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液为封闭液封闭包被的磁微粒。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记乙肝e抗体是通过改良过碘酸钠法标记实现的。

8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中和抗原是为基因工程制备的乙肝e抗原。

9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液包括10mM鲁米诺、0.5mM的1，6-二溴-2-苯酚、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.1M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；

B液包括3.5mM过氧化脲、0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6。