CN103275978B - 修饰的小干扰核酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸及其制备方法，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述第一片段为5’-UGAACGUCACCGAGGAGAATT-3，第二片段为3’-TTACUUGCAGUGGCUCCUCUU-5’。本发明增加了修饰后的小干扰核酸的血清稳定性，并且降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
Description
本申请是申请日为2009年4月3日、申请号为200910081145.8、发明名称为“一种修饰的小干扰核酸及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。
背景技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链 RNA（double-stranded
RNA，dsRNA）分子在 mRNA
水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低（knock-down）或基因沉默（gene
silencing），是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post-transcriptional
gene silencing，PTGS）。 最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小干扰核酸（siRNA）。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced
silencing complex, RISC）。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。
但是，由于小干扰核酸(siRNA) 的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA
进行化学修饰， 以增加siRNA 的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。
目前，由于人们对siRNA在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，只能依靠各自的经验随机地选择siRNA分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很好地提高siRNA分子的血清稳定性，但由于缺乏理论的指导，通常在siRNA分子中引入了过量的修饰，增加了修饰后的siRNA的潜在细胞毒性，并在很多情况下降低了siRNA的生物学活性，因而制约了修饰后的siRNA在体内的应用。
另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法，也限制了一些具有较好稳定效果，但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。
因此，设计具有针对性的修饰方案，通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的siRNA的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题，提供一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸。
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段,并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域,所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列,所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列,所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述第一片段为5’- UGAACGUCACCGAGGAGAATT -3，第二片段为3’- TTACUUGCAGUGGCUCCUCUU -5’。
优选地，所述CA/UG位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。
优选地，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。
本发明提供的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为如下的修饰中的至少一种：
（1）对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
（2）对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的修饰；
（3）对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
优选地，所述修饰为对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰。
进一步优选地，所述修饰为所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH被甲氧基或氟取代。
本发明通过对CA/UG位点进行特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
附图说明
图1为硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰结构图；
图2为2′-氟修饰、2′-氧甲基修饰 (2′-OME)、 2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)和2, 4′-二硝基苯酚修饰结构图；
图3为锁核酸、2′-氨基修饰和2′-脱氧修饰结构图；
图4为5′-溴尿嘧啶、5′-碘尿嘧啶、N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰和2, 6-二氨基嘌呤结构图。
具体实施方式
本发明的发明人对小干扰核酸分子在体内的降解过程进行了细致的研究，发现在CA/UG位点中仅引入少量修饰的情况下，即可提高修饰的小干扰核酸分子的稳定性，大大降低了由于随机地引入大量的修饰而导致的潜在细胞毒性较高，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
根据本发明，所述小干扰核酸分子的标靶可以为各种基因，例如，可以将在细胞内的功能有待分析的基因作为标靶，也可以将需要抑制其表达的基因作为标靶，例如，可以以与疾病或紊乱相关的基因作为标靶，如癌基因、病毒基因、细胞膜表面受体基因、细胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据其标靶基因，能够设计得到小干扰核酸分子(siRNA)，例如，将目的基因的靶标序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列号输入各种小干扰核酸设计程序，如Insert Design Tool for the shRNA Vectors
(Ambion)、shRNA Explorer (Gene Link)、siDirect (Yuki Naito et al. University of Tokyo)、SiRNA at Whitehead (Whitehead Institute for Biomedical
Research)，BLOCK-iT RNAi Designer (invitrogen)、RNAi Design (IDT)，RNAi
Explorer (Gene Link)、siRNA Target
Finder (Ambion)、或siSearch
(Stockholm Bioinformatics Center)等，该设计程序将会根据设计者的要求和siRNA的设计原则，针对所提供的基因或序列设计siRNA。并且，有些程序能够对设计好的siRNA做全基因组或mRNA转录组的同源性分析，从而设计出对靶基因或靶序列特异的siRNA。上述提及的siRNA设计程序及其涉及的原则为本领域技术人员所公知，其全部内容在此一并引入作为参考。
根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以包括多个CA/UG位点，并且该多个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。
根据本发明的一个方面，所述修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其生物活性，还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小化，从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。
本发明中，术语“正义链”是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。并且，当所述修饰的小干扰核酸为双链分子且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链时，术语“正义链”和“第一片段”可以互换使用，术语“反义链”和“第二片段”可以互换使用。
根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以由核糖核苷酸组成，也可以为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
根据本发明，术语“潜在细胞毒性”是指由于对核苷酸分子进行修饰而造成的对细胞的毒性作用。
本发明中，所述修饰的方式为本领域技术人员所公知，例如，本发明对所述小分子干扰核酸进行的化学修饰为以下的一种或几种：
（1）对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
（2）对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的的修饰；
（3）对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰（Phosphorthioate）和硼烷化磷酸盐修饰 (Boranophosphate)。如图1所示分别用硫和硼烷置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定小分子干扰核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。而硼烷化磷酸盐修饰的小干扰核酸的疏水性强，易于在血浆中形成水合蛋白，对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯。
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中羟基(2′-OH)的修饰。在核糖的羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清核糖核酸酶不易识别小干扰核酸，增加了小干扰核酸的稳定性。使小干扰核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中羟基的修饰包括2′-氟修饰 (2′-fluro
modification); 2′-氧甲基修饰 (2′-OME);
2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)；2, 4′-二硝基苯酚修饰 (2′-DNP modification)；锁核酸
(LNA);2′-氨基修饰
(Amina modification)；2′-脱氧修饰 (2′-Deoxy modification)等等，如图2和图3所示。
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5 位点引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶（5′-bromo-uracil）和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰，2, 6-二氨基嘌呤(2,
6-diaminopurine)修饰等，如图4所示。
优选情况下，所述修饰为对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰。进一步优选为，所述修饰为所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH被甲氧基或氟取代。上述修饰均可以增加所述小干扰核酸的血清稳定性，增强其对血清核酸酶水解的抵抗能力。
本发明还提供了一种修饰的小干扰核酸的制备方法，其中，该方法包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。
根据本发明的一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括一个CA/UG位点，并且该一个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。
根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括多个CA/UG位点，并且该多个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。
在一种优选的情况下，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。
本发明中，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸的结构为本领域技术人员所公知，可以为各种小干扰核酸的存在结构。
根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸可以为为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
本发明中，合成小干扰核酸的方法可以为各种常规的小干扰核酸的合成方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)、广州锐博生物科技有限公司、或英俊生物技术有限公司（invitrogen）进行合成。
一般来说，用于合成小干扰核酸的方法包括以下四个过程：（1）寡聚核糖核苷酸的合成；（2）脱保护；（3）纯化分离；（4）脱盐。
例如，具有表1所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下：
（1）寡聚核糖核苷酸的合成：在自动DNA/RNA合成仪（例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909）上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次（19≥n≥2）循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
（2）脱保护
将连接有小干扰核酸的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1：3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有小干扰核酸的固相支持物并用双蒸水淋洗2次（每次1毫升），收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液（1M），室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小干扰核酸的粗产物。
（3）纯化分离
将得到的小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的小干扰核酸产物。
（4）脱盐
用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的小干扰核酸产物2-4次（每次2毫升），除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中（10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl），将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有小干扰核酸的溶液。
上文中给出多种实施方式的目的仅为示例性地对本发明进行说明，而不是为了限制本发明的范围。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1
选取下表1中的基因为靶基因，并委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)合成表1中的siRNA。
实施例2
通过以下方法分别对表1中所示的siRNA进行血清稳定性检测、基因沉默效率检测和细胞毒性检测：
1. 血清稳定性检测
将4 μL浓度为20 μM的未修饰的和不同化学修饰小干扰核酸加入到含有4 μL 胎牛血清和32 μL 1× PBS溶液中，血清的终浓度为10%；在37℃条件下将反应体系孵育一定的时间后取样,一般为0，3和6小时；每次取10 μL样本并进行液氮速冻，以立即中止血清核酸酶对siRNA的作用，然后将样本保存于-80℃条件下备用。
配置20%的聚丙烯酰氨凝胶，将3 μL 5×的上样缓冲液(30mM EDTA, 36% 甘油, 0.06% 溴氛蓝) 与siRNA的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电泳结束后，用1×Sybr
Gold染料(Invitrogen， Cat. 11494) 进行10分钟的染色后照相，结果如表1所示。
2．基因沉默效率检测
将在DMEM培养基 (10%
FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 µg/ml的链霉素) 中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中（1×105细胞/0.5
ml 培养基/孔)。待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基
(Gibco公司)。然后将带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告质粒和pRL-TK (编码海肾萤光素酶)的对照质粒 (Promega公司，Madison WI, USA)与化学合成的siRNA通过Lipofectamine
2000 (Invitrogen公司, 美国)进行细胞转染，每孔含0.17g重组质粒和0.017g pRL-TK对照质粒，siRNA的终浓度为13 nM。每种siRNA平行转染三个复孔，以只转染同样量的两种报告基因质粒，不转染siRNA的三个复孔作为对照。4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基（10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 µg/ml的链霉素）。24小时后收获细胞，以10 μl细胞裂解液细胞，利用双荧光素酶报告基因分析*** (Dual-Luciferase Assay System, Promega公司) 和酶标仪(Novostar, BMG
Labtechnologies GmbH, Germany)测定两种荧光酶的活性，以未转染siRNA的孔中的报告基因的表达量作为标准对照，通过以下公式计算得到siRNA对靶位点的沉默效率，结果如表1所示。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复2次，结果如表1所示。
沉默效率＝（实验组Firefly荧光素酶的表达量/实验组Renilla荧光素酶表达量）/（对照组Firefly荧光素酶的表达量/对照组Renilla荧光素酶表达量）
3、修饰siRNA的细胞毒性检测
将在DMEM培养基 (10%
FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 µg/ml的链霉素) 中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中（1×105细胞/孔)；待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基 (Gibco公司)；然后将化学合成的siRNA通过Lipofectamine
2000 (Invitrogen公司, 美国)进行细胞转染，siRNA的终浓度为13 nM，每种siRNA平行转染三个复孔，无siRNA的三个转染复孔作为对照；4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基（10%
FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 µg/ml的链霉素）；24小时后吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加1ml PBS和10μl MTT(噻唑蓝)染液，在37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养4-6小时；每孔加0.1ml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解；酶联免疫检测仪测定570nm处各孔A值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率，结果如表1所示。
细胞生长抑制率（%）=（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100%。
表1
在上表1中：
黑体字母表示的“A”、“U”、“G”或”C”字母表示经过修饰的核苷酸；
“+”表示经血清孵育后，siRNA主带完全消失，可见明显的降解条带；
“++”表示经血清孵育后，siRNA主带虽有降解但仍清晰可见，可见明显的降解条带；
“+++”表示经血清孵育后，siRNA主带清晰未见降解，未见明显的降解条带。
另外，从上表1中可以看出，与经过随机修饰的小干扰核酸相比，本发明提供的小干扰核酸在提高了稳定性的同时，还显著地降低了小干扰核酸的细胞毒性，并且对小干扰核酸的表达抑制效率基本没有影响，由此可见，本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 百奥迈科生物技术有限公司
<120> 修饰的小干扰核酸及其制备方法
<130> 20130102
<150> 200910081145.8
<151> 2009-04-03
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
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aacctcagcc ctaacggtgg tggagaaccc aaaggggagt tgctggaagc
catcaaacgt 300
gactttggtt cctttgacaa gtttaaggag aagctgacgg ctgcatctgt
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2'-O-Methyl
<400> 8
ugaacgucac cgaggagaat
t
21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 2'-O-Methyl
<400> 9
uucuccucgg ugacguucat
t
21
Claims (3)
1.一种修饰的小干扰核酸，其包括正义链5’-UGAACGUCACCGAGGAGAATT-3’和反义链3’-TTACUUGCAGUGGCUCCUCUU-5’，所述正义链与所述反义链形成至少一个CA/UG或UG/CA位点，其特征在于，所述CA/UG或UG/CA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述修饰为小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH被甲氧基取代。
2.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述CA/UG或UG/CA位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，除了所述CA/UG或UG/CA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。
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| Sorim Choung et al..Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy.《Biochemical and Biophysical Research Communications》.2006,第342卷919-927. |
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