CN103267749B - 一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，由位于上半部的芯片主体和位于下半部的底片所组成；在芯片主体内刻蚀有多个独立的检测单元，每一个检测单元包括排气孔、反应舱、通道以及加样孔，加样孔通过所述通道与反应舱连通，在反应舱内设与芯片主体外部导通的所述排气孔，在反应舱中封闭有作为检测载体的微球，在微球的表面固定有生物分子探针。本发明以光子晶体液相芯片技术为基础，将其整合入自行设计的PDMS盒式芯片中，有效地降低了光子晶体液相芯片分析技术的操作难度，规范了操作流程，并有利于后期自动化检测的开展。该芯片化检测方案简洁，高效，有望成为临床分析技术的替代方案。

Description

一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片

技术领域

本发明涉及的是一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片及其制备方法。它可以用来检测蛋白质、核酸等生物大分子，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。

背景技术

多元检测技术因其高通量，低耗时的方法学特性受到广泛关注。其最初的形态为基因芯片，主要应用于基因组学的研究。直到上世纪末，液相芯片技术的出现使多元检测技术在蛋白组学研究以及临床实际应用中崭露头角，多应用于新型标志物的筛选，大样本的分析以及微生物的分型等。液相芯片技术的发展也可以看作是其编码技术的发展，到目前为止出现的不同编码技术包括：荧光染料编码，量子点编码，光子晶体编码，形状编码，条形码编码等数十种编码方式。其中，光子晶体编码因其出色的编码稳定性，与检测信号的无干扰性获得了青睐。在基于光子晶体编码微球的多元检测重复实验中，微球的难操作性成为限制其进一步应用的制肘。因为微球的尺寸过小，肉眼难以分辨，所以在未芯片化的检测模式中，经常出现人为损坏微球，或者微球丢失的情况。由于获得的每一个实验数据都是多个微球测得数据的平均，因此微球的损坏或丢失将会大大降低实验数据的准确性和重复性，导致方法的精确性降低。同时，未芯片化的检测模式所带来的不同操作员之间的实验误差不可控，进一步影响方法的准确性与重复性。因此，配套的生物芯片装置被设计出来应用于光子晶体微球的封装以及标准化实验进程的开展，有利于该方法准确性与重复性的提升。目前的生物芯片主要有阵列式芯片，盒式芯片以及微通道式芯片这三种模式，但设计样式各不相同。其大小在几个平方厘米左右，选用生物相容性良好且无毒的化学材料制作。通过蚀刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用电、压力、重力等方式驱动通道内的流体，最后采用化学发光、电化学、荧光检测器等进行检测。该芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构（包括其通道、反应室和其它功能部件）至少在一个维度上为微米级尺度，以适应微纳级别的微球的封装。生物芯片的出现极大地方便了相关仪器的设计与制作，以及后期应用的实现。它把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上,用以完成不同的实验过程,并能对产物进行分析。它不仅使试剂的消耗降低,而且使实验速度提高,费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。由于生物芯片将整个样品分析的过程，包括加样，洗涤，生物反应，抽取废液和信号检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比实现了亚微升甚至纳升级的试剂和样品消耗，反应速度加快，同时降低了生产成本并便于携带。

发明内容

技术问题: 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，而提供一种实验中不破坏微球从而简便操作提高检测真实性的盒式检测芯片。

技术方案: 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，该生物芯片由位于上半部的芯片主体和位于下半部的底片所组成；在芯片主体内刻蚀有多个独立的检测单元，每一个检测单元包括排气孔、反应舱、通道以及加样孔，所述加样孔通过所述通道与反应舱连通，在反应舱内设与芯片主体外部导通的所述排气孔，在反应舱中封闭有作为检测载体的微球，所述微球具有可通过肉眼以颜色区分解码或用光纤光谱仪测反射峰位置解码的光子晶体编码，在微球的表面固定有生物分子探针。

所述的生物分子探针是核酸或蛋白质。

微球的材料是玻璃、聚苯乙烯或橡胶，微球的大小在250μm～300μm之间。

所述的芯片主体以聚二甲基硅氧烷复制模板获得，所述底片为玻片。

所述反应舱的直径为5mm，高3mm；通道高度在150μm～200μm之间；加样孔直径1.5mm，高2mm；排气孔直径为200μm。

本发明检测芯片的工作原理是：

a)        经过预处理的不同编码的光子晶体微球在芯片上下两部分组装的过程中，被封装于反应舱内，可以在反应舱内自由移动，但无法跑出反应舱外。

b)       检测样本时，吸取后的样本和相关试剂经加样针刺穿加样孔上方的由PDM制成的芯片主体，加入加样孔中，PDMS很好地起到封闭的作用，可以防止液体的回流。加入的样本及试剂经过通道，进入反应舱。

c)      生物反应在相应的温度和缓慢漩涡式振荡（300rpm）的条件下进行，保证溶液与微球表面的充分接触。反应结束后，废液同样经由加样孔吸出，并加入洗液。

d)     洗涤在相同反应温度，高速漩涡式振荡的条件下进行。洗涤完全后，吸出洗液，加入清洁的缓冲液。

e)      检测结果由倒置荧光显微镜捕捉获得。

本发明以光子晶体液相芯片技术为基础，将其整合入自行设计的PDMS盒式芯片中，有效地降低了光子晶体液相芯片分析技术的操作难度，规范了操作流程，并有利于后期自动化检测的开展。该芯片化检测方案简洁，高效，有望成为临床分析技术的替代方案。

有益效果：根据本发明，利用盒式检测芯片进行样品注样，反应，洗涤和检测的连续化操作，以光子晶体微球为生物分子检测的固相载体具有以下优点：

（1）操作简便、规范：由于获得的每一个实验数据都是多个微球测得数据的平均，因此微球的破碎丢失将会大大降低实验数据的准确性和重复性，导致方法的精确性降低。而本发明将微球被封装于反应舱中，在操作过程中不会碰触，所以降低了肉眼操作的难度，使其在实验过程中不会破碎、丢失，从而提高了实验数据的精确性。

（2）分类的多元分析检测：临床免疫分析项目大多是成套的，例如乙肝两对半。由于反应用的光子晶体微球具有编码，因此可以编码多元生物分子检测，同时检测同一个样品中的多个指标，非常适合成套系的临床指标的分析。同时球形载体具有比表面积大，可以滚动等特点，所以检测反应的灵敏度高，样品需要量少，反应速度快。虽然光子晶体微球的编码数量受限（大约十多种），但是一套临床检测指标一般不超过十种，因此相同编码的微球可以在不同的组别中检测不同的生物分子，同时结合芯片本身携带的二位条形编码，可以胜任所有免疫检测指标的分析；

（3）实验中人为产生误差减少：未芯片化检测模式完全由操作员手工完成全部实验步骤，没有标准化的操作方案，实验的重复性受限。而芯片化的检测模式同时带来了标准操作流程，减少了人为误差，提高了方法的可重复性与准确性。

（4）可自动化程度高：由于芯片化的检测模式使得实验操作的规范化程度高并且分析方法简单，使得配套实验仪器的研发难度大大降低；

（5）本发明同时结合了微球载体以及生物芯片的生物分子检测优势，操作简单，具有鲜明的优势。

附图说明

图1为本发明芯片的的俯视图。

图2是本发明单一检测单元的侧视图。

以上的图中有: 排气孔1、反应舱2、通道3、加样孔4、底片5。

具体实施方式  

下面结合附图，对本发明作详细说明，如图1所示，本发明是一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，由位于上半部的芯片主体和位于下半部的底片5所组成；其中底片5为玻片，芯片主体以聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模板获得，在芯片主体内分为若干个检测单元，每个检测单元设有一个排气孔1，一个反应舱2，通道3，以及一个加样孔4。在反应舱2内封闭具有不同编码的光子晶体微球，其粒径大小在250μm～300μm，微球的制备材料为二氧化硅和/或水凝胶。排气孔直径为200μm；反应舱的直径为5mm，高度为3mm；通道高度为200μm；加样孔直径为1.5mm，高度为2mm。作为探针分子载体的微球其材料可以是二氧化硅和/或水凝胶。

实施例一：在光子晶体编码二氧化硅微球上固定核酸探针进行肿瘤多药耐药相关基因表达情况分析

a、 基因序列的筛选与核酸探针设计：通过Gene Bank查找待测基因的核酸序列，并筛选待扩增和检测的最佳片段。通过如见Primer Express设计该片段的杂交探针。

b、核酸探针的固定：洗净的微球经亲水处理和环氧硅烷化，然后将一端经氨基修饰的探针分子通过共价结合固定到光子晶体编码微球的表面；

c、 盒式检测芯片的封装：用PDMS将模板填充，经70度45分钟后固化取出形成芯片主体部分。接着与玻片同时进行表面亲水处理，后将处理好的微球放入反应舱中，热粘合玻片和PDMS芯片主体；

d、  反应：通过注射泵将待检测肿瘤耐药细胞提取液和荧光标记探针的混合溶液通过加样孔4推入反应舱中，充分反应。

e、 洗涤：反应完毕后，通过注射泵从加样孔4抽出上述混合液并推入梯度洗涤缓冲液（共三种）到反应舱2对微球进行充分洗涤；

f、 检测：抽干反应舱2中的洗涤缓冲液，利用注射泵从加样孔4注入清洁的清洗缓冲液，利用倒置荧光显微镜捕捉反应后明场和暗场的照片，并对照片进行图像分析获得数据结果。

实施例二：在光子晶体编码硅-水凝胶复合材料微球上固定蛋白分子进行血清中相同蛋白分子的定量分析

a、 蛋白分子的固定：洗净的微球经亲水处理和环氧硅烷化，然后将蛋白分子经氨基和环氧基团的氧化还原反应固定到光子晶体编码微球的表面；

b、盒式检测芯片的封装：用PDMS将模板填充，经70度45分钟后固化取出形成芯片主体部分。接着与玻片同时进行表面亲水处理，后将处理好的微球放入反应舱中，热粘合玻片和PDMS芯片主体；

c、 反应：通过注射泵将待检测血清样本和稍过量的荧光标记抗体的混合溶液通过加样孔4推入反应舱中，充分反应。

d、  洗涤：反应完毕后，通过注射泵从加样孔4抽出上述混合液并推入洗涤缓冲液到反应舱2对微球进行充分洗涤；

e、 检测：抽干反应舱2中的洗涤缓冲液，利用注射泵从加样孔4注入清洁的清洗缓冲液，利用倒置荧光显微镜捕捉反应后明场和暗场的照片，并对照片进行图像分析获得数据结果。

Claims (5)

1.一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，其特征在于：该生物芯片由位于上半部的芯片主体和位于下半部的底片（5）所组成；在芯片主体内刻蚀有多个独立的检测单元，每一个检测单元包括排气孔（1）、反应舱（2）、通道（3）以及加样孔（4），所述加样孔（4）通过所述通道（3）与反应舱（2）连通，在反应舱（2）内设与芯片主体外部导通的所述排气孔（1），在反应舱（2）中封闭有作为检测载体的微球，所述微球具有可通过肉眼以颜色区分解码或用光纤光谱仪测反射峰位置解码的光子晶体编码，在微球的表面固定有生物分子探针。

2.根据权利要求1所述的一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，其特征在于：所述的生物分子探针是核酸或蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，其特征在于：微球的材料是玻璃、聚苯乙烯或橡胶，微球的大小在250μm～300μm之间。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，其特征在于：所述的芯片主体以聚二甲基硅氧烷复制模板获得，所述底片（5）为玻片。

5.根据权利要求1或2所述的一种基于光子编码微球的多元生物标志物检测盒式芯片，其特征在于：反应舱（2）的直径为5mm，高3mm；通道（3）高度在150μm～200μm之间；加样孔（4）直径1.5mm，高2mm；排气孔（1）直径为200μm。