CN103263667A

CN103263667A - 一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法

Info

Publication number: CN103263667A
Application number: CN2013101691873A
Authority: CN
Inventors: 蒋桃珍; 陈光华; 孙晔
Original assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: CN103263667B

Abstract

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的生产方法。通过对不同亚型鸡传染性法氏囊病毒的免疫原性、抗原谱、对法氏囊的致病性以及突破母源抗体能力等特性的研究，筛选出具有免疫原性好、抗原谱较广且具有免疫协同作用的毒株开展鸡传染性法氏囊病三价活疫苗的研究，研制出免疫原性好、能够突破较高水平母源抗体、免疫持续期长达3个月以上、对不同强毒株均有良好保护的活疫苗——鸡传染性法氏囊病三价活疫苗。

Description

一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病是由双股RNA病毒引起的雏鸡的一种急性、高度传染性、杀淋巴细胞性疾病,是世界各地危害养鸡业最严重的传染病之一，预防此病的主要措施是采用疫苗进行免疫接种。由于母源抗体对活疫苗的干扰较大，因此，必须根据母源抗体水平确定初免时间，以确保疫苗的免疫效果在实际生产中，由于同一鸡群中其不同个体母源抗体水平也存在较大差异，最适免疫时间不易确定，一旦免疫时间不当，野毒常常趁虚而入，导致发病。近年来，IBD疫苗研究方兴未艾，许多新型疫苗也相继研究成功，其中包括基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗等。本研究发明的鸡传染性法氏囊病活疫苗利用IBDV与一定量的猪抗IBDV高免血清特异结合，可延迟疫苗病毒在鸡体内的复制。其免疫机理是，当鸡体母源抗体降低到一定水平，病毒开始复制释放，产生主动免疫保护力，且诱导的免疫反应比常规活疫苗强。由于该疫苗受母源抗体干扰很小，采用18日龄鸡胚胚内接种或1日龄雏鸡颈部皮下接种即可产生良好免疫保护，避免鸡群早期感染。本发明采用猪抗IBDV高免血清为制苗材料，避免了采用鸡血清而导致的禽外源病毒污染，疫苗更加安全。

发明内容

本发明目的在于利用免疫原性好的IBDVCF-C株与猪抗IBDV高免血清特异结合制备疫苗，采用18日龄鸡胚实施胚内接种或对1日龄雏鸡进行颈部皮下接种，一次免疫即可产生良好的免疫保护力。此外疫苗以猪抗IBDV高免血清为制苗材料，避免了采用鸡血清而导致禽外源病毒污染，制备的疫苗更加安全。

技术路线

1.本发明所涉及的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗是含鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株和猪抗IBDV高免血清的活疫苗，其中鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus）CF-C株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7404。

2.本发明涉及的鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法为：

（1）鸡胚的接种、收获：用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤将生产用毒种CF-C株鸡传染性法氏囊病病毒稀释至含1000～10000EID₅₀/0.1ml，将稀释后的CF-C株病毒液经绒毛***接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚；分别分组收取48～96小时死胚及96小时存活胚胎儿及***，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存；冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清为制苗用CF-C株半成品，经过无菌检验合格的、病毒含量为每0.2ml≧10^4.5ELD₅₀，保存于-20℃以下；

（2）猪抗IBDV高免血清的制备：

用CF-C株鸡传染性法氏囊病病毒免疫健康猪获得猪抗IBDV高免血清，56℃灭活30min,保存于-20℃以下。

（3）配苗及分装配苗及分装取经过检验合格的并经灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释至病毒含量为每0.2ml≧10^4.5ELD₅₀的病毒液按体积比1:1与猪抗IBDV高免血清混合，加入常用冻干保护剂和抗生素经充分混匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。

本发明的实施方式

1．病毒株来源及特征

（1）毒株来源：鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）CF95株来自中国兽医药品监察所，由中国兽医药品监察所于1995年在北京市分离鉴定并经过人工多次传代致弱，此后本发明人通过终点稀释法得到较高病毒滴度的克隆株，命名为鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus）CF-C株，该株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CF-C株为CGMCCNo.7404。

1）分离在北京市某疑似鸡传染性法氏囊病感染的鸡场中采集病死鸡病变法氏囊，经抗生素除菌处理后，接种鸡胚，连续传代，增殖分离病毒，经鉴定为IBDV强毒株，对SPF鸡的法氏囊半数感染量为10^4.0BID₅₀/0.1ml，命名为CF95株.

2）致弱采用鸡胚传代致弱，传至90代时，病毒失去对鸡的致病力，命名为CF株。通过CF株在3～5周龄SPF鸡体内连续传5代后，取基础种毒与第5代法氏囊进行毒力比较，表明CF株在易感鸡体内连续传代后毒力稳定，未出现毒力返强现象，各代次囊毒接种鸡法氏囊均无明显病变，颜色和弹性正常，略小于正常对照鸡法氏囊。本发明人将CF株经终点稀释法克隆，获得的克隆株病毒含量得到显著提高，其病毒含量≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml，命名为CF–C株(或简称CF株)。

（2）毒株特点

1）对鸡胚的毒力将CF-C株毒种用无菌生理盐水稀释，经绒毛***接种10枚10～11日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2ml（含1000个ELD₅₀），鸡胚应在接种后48～168小时内死亡8只以上，剖检胎儿全身应明显水肿，脑部充血，脚趾充血，肝有斑驳状等病变。

2）对雏鸡的安全性将CF-C株毒种用7～10日龄SPF雏鸡30只进行安全性试验。试验鸡分成两组，第一组20只，每只点眼或滴鼻接种10^4.0ELD₅₀的病毒液；第二组10只，不接种病毒作为对照，两组隔离饲养。接种后72小时，接种组剖检10只，对照组5只，雏鸡法氏囊均不应有出血、坏死、黄色粘液等病理变化出现。其余雏鸡继续饲养观察至21日，应健活。

3）病毒含量将CF-C株毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5和10^-63个稀释度，经绒毛***接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置37℃孵育168小时，计算ELD₅₀，病毒含量应≥10^4.5ELD₅₀/0.2ml。

4）特异性将CF-C株毒种用灭菌Hank’s液稀释至10^3.0ELD₅₀/0.1ml，与鸡传染性法氏囊病阳性血清等量混合，37℃中和60分钟，经绒毛***上接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml；同时设病毒对照5个，每胚接种病毒液0.2ml（含10^3.0ELD₅₀），同条件观察培养168小时。血清中和组鸡胚应全部健活，病毒对照组应至少有4枚死亡，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验(HA)应为阴性。

5）免疫原性将CF-C株毒种用2～4周龄SPF雏鸡20只进行免疫原性试验。其中10只各滴鼻或点眼接种病毒液0.03ml，约含50ELD₅₀，另10只不接种作对照，隔离饲养。14日后，免疫鸡连同对照鸡5只，均用10个法氏囊最小感染剂量的强毒BC6-85株点眼0.1ml，72小时后，将所有鸡扑杀，剖检。攻毒对照鸡的法氏囊应至少4只出现明显病变，免疫鸡的法氏囊应至少有8只无病变，健康对照组5只鸡的法氏囊均应无任何变化。

6）免疫抑制性将CF-C株毒种用20只1日龄SPF鸡进行免疫抑制性试验。将试验鸡分成2组，每组10只，其中1组接种1个使用剂量的病毒液，另10只作为对照，隔离饲养。14日后每组鸡每只接种1个使用剂量的鸡新城疫疫苗，同条件下隔离饲养观察。免疫后14日采血，测定鸡新城疫的HI抗体效价，免疫组与鸡新城疫对照组之间鸡新城疫抗体效价的几何平均滴度（GMT）经统计学分析，应无显著性差异。

2疫苗制造及半成品检验

（1）生产用毒种制备

将CF-C株毒种用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲肉汤稀释至1000～10000EID₅₀/0.1ml，经绒毛 ***或尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚。收取48～96小时死胚及96小时活胚胎儿及***，装于无菌容器内剪碎，取样作无菌检验，胚液置-30℃冻存。将检验无菌的鸡胚液冻融2～3次，鸡胚液离心去沉渣，上清液加适量的抗生素混匀分装，置-30℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。经鉴定，符合标准的毒种作为生产用种子。毒种保存在-20℃以下保存，应不超过12个月，毒种继代应不超过3代。

（2）制苗病毒液的制备

选择发育良好的10～11日龄SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞作为制苗材料。取生产用毒种，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲肉汤稀释至含1000～10000EID₅₀/0.1ml，经绒毛***接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚。分别分组收取48～96小时死胚及96小时存活胚胎儿及***，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。

（3）制苗高免血清的制备

用鸡传染性法氏囊病病毒多次免疫健康猪获得猪抗IBDV高免血清，56℃灭活30min，保存于-20℃以下待检。

（4）半成品检验

1）无菌检验抽取鸡胚病毒液和猪抗IBDV高免血清，按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

2）病毒含量测定将CF-C株用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5和10^-63个稀释度，经绒毛***接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置37℃孵育168小时，计算ELD₅₀，病毒含量应≧10^4.5ELD₅₀/0.2ml。

3）配苗及分装取检验合格并用灭菌生理盐水稀释至病毒含量应≧10^4.5ELD₅₀/0.2ml的CF-C株病毒液和猪高免血清按体积1:1混合，加适当比例的保护剂，同时加入适量的抗生素充分混匀，定量分装。

（5）冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3．成品检验

（1）性状乳白色海绵状疏松团块，易于瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

（2）无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无菌生长。

（3）支原体检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无支原体生长。

（4）外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应符合规定。

（5）安全检验将疫苗用稀释液稀释至0.1ml/10羽，然后分别经胚内接种18日龄SPF 鸡胚（30枚）或颈部皮下接种1日龄SPF鸡（20只），雏鸡8日龄，各免疫组取10只鸡，对照取5只鸡剖检，观察法氏囊变化，雏鸡法氏囊均不应有出血、坏死、黄色粘液等病理变化出现。其余鸡继续饲养至21日龄，观察鸡的生长情况，应健活。胚内接种免疫组还应比较不同组的孵化率，免疫组与对照组之间孵化率应无显著差异。

（6）效力试验将疫苗稀释成0.1ml/0.1羽，然后经1日龄皮下接种10只SPF鸡，免疫后14日采血测抗体同时用BC6/85强毒攻击。攻击后72h剖检法氏囊，免疫组法氏囊应无出血、坏死、黄色粘液等病理变化，8/10以上保护，未免疫攻毒组法氏囊应4/5病变，空白对照组法氏囊应5/5正常。

（7）剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，应符合规定。

（8）真空度测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，应符合规定。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物为鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株，由中国兽医药品监察所1995年在北京市分离鉴定，并通过鸡胚多次传代致弱，命名为鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursaldiseasevirus）CF株，本发明人将CF株进一步纯化克隆得到病毒滴度较高的鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus）CF-C株该株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CF-C株为CGMCCNo.7404。

本发明的积极意义

本发明利用免疫原性好的IBDVCF-C株与猪抗IBDV高免血清特异结合制备疫苗，可采用18日龄鸡胚胚内接种或对1日龄雏鸡进行颈部皮下接种，疫苗不受母源抗体干扰，一次免疫即可产生良好的免疫保护力；疫苗安全有效，免疫后对鸡胚孵化率和雏鸡生长均无明显影响。此外采用猪抗IBDV高免血清作为制苗材料，避免了采用鸡血清而导致禽类外源病毒污染，疫苗更加安全。

附图说明

图1：疫苗制备工艺流程图。

实施例

以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

——疫苗制造

1.材料

（1）鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株病毒含量10^5.25ELD₅₀/0.2ml，由本发明人制备、保存提供。

（2）猪抗IBDV高免血清由本发明人制备。

（3）检验用强毒鸡传染性法氏囊病BC6-85强毒株，由中国兽医药品监察所提供。

（4）SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

（5）SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

2．生产用种毒制备

（1）鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株

1）接种及收获将CF-C株种子病毒液稀释至100倍（体积比），接种于10日龄鸡胚的绒毛***，每胚0.2ml，共45个，37℃、65%湿度孵化观察，48h～96h收40个，共收获组织300g；将收获组织装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。

2）无菌检验无菌检验合格。

3）病毒含量测定将上述种毒液按10^-3、10^-4、10^-5稀释，每个滴度接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，经绒毛***接种，37℃、65%湿度培养168h，判定病毒含量为10^5.17ELD₅₀/0.2ml，为合格。

4）特异性检验将毒液稀释为10^3.0ELD₅₀/0.1ml，毒种与血清1：1中和，37℃中和60分种，绒毛***接种10日龄鸡胚（SPF）每胚0.2ml，中和组5个，对照组5个，37℃、65%湿度孵化观察168h，中和组5/5活，病毒对照组0/5活，判为合格。

5）安全性检验将毒液10倍稀释后点眼接种7日龄SPF雏鸡10只，0.2ml/只，留10只不接种做对照组，隔离饲养，观察21天。接种后72h剖检（5只/组），接种鸡和对照鸡法氏囊均无出血、坏死、黄色粘液样等变化。21天观察期内，接种鸡和对照鸡均5/5健活。

6）支原体检验将5ml毒种接种于改良Frey氏培养基中，移植4次，37℃观察28天，微黄，pH值为7.6，支原体检验为阴性。

7）鸡胚的毒力每胚SPF鸡胚接种0.2ml含1000个ELD₅₀，11日龄鸡胚20个，绒毛***接种，每胚0.2ml，观察7天，累计死亡20只，剖检胎儿全身水肿，脑部充血，肝有斑驳状病变，心脏呈熟肉状灰白色。判为合格。

3．病毒液制备

（1）鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株病毒液的制备

1）接种及收获将以上CF-C株种子病毒液稀释100倍（体积比），绒毛***接种10日龄SPF鸡胚100枚，每胚0.2ml。37℃、65%湿度孵化观察48～96h，48h早死胚为8枚，弃去不用。48～96h收获92枚于4℃冷库过夜，收获鸡胚组织720g；将收获组织装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。2）无菌检验取样进行无菌检验，无细菌、霉菌生长。

3）病毒含量测定将病毒液进行10倍用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，分别绒毛***接种10日龄SPF鸡胚各5个，每胚0.2ml，37℃、65%湿度观察168h，该批病毒液的病毒含量为10^5.32ELD₅₀/0.2ml。

4．成品制造201301批鸡传染性法氏囊病抗原抗体疫苗的制备（500羽份/瓶）

（1）配苗将检验合格取检验合格并用灭菌生理盐水稀释至病毒含量10^5.32ELD₅₀/0.2ml的CF-C株半成品与猪抗IBDV高免血清按体积比为1:1比例配苗，共500ml，加入500ml保护剂，共1000ml，加入一定量抗生素。

（2）分装冻干共分装500瓶，每瓶2ml，装入真空冷冻干燥机进行冻干。

实施例2

——成品检验（以1301批疫苗为例）

1．性状疫苗为乳白色海绵状疏松团块，易于瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2．无菌检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行，无细菌、霉菌生长。

3．支原体检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行，无支原体生长。

4．外源病毒检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。

5．安全检验将疫苗稀释为10羽份/0.1ml，分别经胚内接种18日龄SPF鸡胚（30枚）和颈部皮下接种1日龄SPF鸡（20只），留30枚18日龄鸡胚和20只1日龄SPF鸡不接种作为空白对照，同条件隔离孵化和饲养，雏鸡8日时，各免疫组取10只鸡，对照取5只鸡剖检，观察法氏囊变化，雏鸡法氏囊均无出血、坏死、黄色粘液等病理变化出现。其余鸡继续饲养至21日龄，观察鸡的生长情况，均健活。胚内接种免疫组与对照组孵化率均为97%。

6．效力检验疫苗稀释成0.1ml/0.1羽，然后经1日龄皮下接种10只SPF鸡，留10只不接种做空白对照，免疫后14日天全部免疫组鸡与空白对照组鸡5只采血测抗体同时用BC6/85强毒攻击。攻击后72h剖检法氏囊，免疫组法氏囊10/10正常，未免疫攻毒组法氏囊5/5黄色胶冻状病变，空白对照组法氏囊5/5正常。免疫组10/10抗体阳性，对照组5/5抗体阴性。

7．剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行，抽检的4瓶疫苗剩余水分分别为2.33%、1.95%、2.02%、2.08%。

8．真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行，35/35出现紫色辉光。

实施例3

——与同类产品比较试验

取与CF-C株相同血清亚型的国外鸡传染性法氏囊病（2512株）单苗与实验室生产的201201批疫苗进行安全性和免疫效力对比试验。

将1日龄不同母源抗体水平的肉鸡随机分为3组，每组30只，标号，采血，测抗体效价。将实验室201201批疫苗稀释成1羽/0.1ml，各经颈部皮下接种1日龄肉鸡30只，0.1ml/只。将单苗按说明书稀释至1羽/0.1ml，滴鼻点眼，0.1ml/只，留30只不免疫做为对照，同等条件隔离饲养。

于免疫后14日、21日、28日取各免疫组10只、对照组5只采血测抗体，同时用BC6/85强毒（剂量：0.1ml/只，含100BID，滴鼻点眼）攻击。攻毒后观察72小时，剖检，观察法氏囊病变情况。

结果表明，免疫后21日和28日，实验室制品攻毒保护率和抗体阳性率均为90%以上，而国外单苗攻毒保护率和抗体阳性率均为10%以下。

Claims

1.一种鸡传染性法氏囊病活疫苗，其特征在于该活疫苗含有鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株和猪抗IBDV高免血清，鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus）CF-C株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CF-C株为CGMCCNo.7404。

2.权利要求1所述一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法，其特征在于

（2）配苗及分装取经过检验合格的并经灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释至病毒含量为每0.2ml≧10^4.5ELD₅₀的病毒液按体积比1:1与猪抗IBDV高免血清混合，加入常用冻干保护剂和抗生素经充分混匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3.如权利要求2所述一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法，其特征在于其中猪抗IBDV高免血清的制备方法是：用CF-C株鸡传染性法氏囊病病毒免疫健康猪获得猪抗IBDV高免血清，56℃灭活30min。