CN103255189A

CN103255189A - 一种替考拉宁的制备方法

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Publication number: CN103255189A
Application number: CN2013101710709A
Authority: CN
Inventors: 胡海艳; 赵培静; 黄魁英; 夏枫耿; 明飞平; 梁淑娃; 秦鹏; 张玮亮; 缪承杜
Original assignee: GUANGZHOU CITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Current assignee: GUANGZHOU CITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY; Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及抗生素的发酵领域，公开了一种替考拉宁的制备方法。该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，在发酵过程中不断将产生的替考拉宁移出发酵体系。将产生的替考拉宁移出发酵体系后可以降低抗生素在发酵液中的浓度，得以避开其替考拉宁产生菌的有害作用，极大的提高了替考拉宁发酵水平，产量达到3.9g/L。

Description

一种替考拉宁的制备方法

技术领域

本发明涉及抗生素的发酵领域，更具体地，涉及一种替考拉宁的制备方法。

背景技术

抗生素是微生物的一种次级代谢产物, 在它的合成过程受到代谢调节的控制, 对其产生菌具有一定影响, 研究抗生素产生菌对其自身产物的耐受性机制,对提高抗生素生产能力，开发新种类的抗生素具有重要的指导意义。

替考拉宁( Teicoplanin) 又称肽可霉素(Teicomycin A2) ，它是继万古霉素之后的又一目前临床治疗多重耐药菌感染的重要抗生素。万古霉素和替考拉宁是目前仅有的能有效作用于金黄色葡萄球菌(MRSA)的有效药物，MRAS的世界性问题导致了万古霉素和替考拉宁的需求量增多。与万古霉素相比，替考拉宁因其毒副作用更低，在体内半衰期更长而更具有优势。

多年来，研究人员一直在致力提高替考拉宁的产量，多是从筛选突变菌株与改善发酵条件来提高，并取得了一定的效果。目前替考拉宁最高产量为2.8 g/L (Lee et al., Optimization of culture conditions and scale-up to plant scales for teicoplanin production by Actinoplanes teichomyceticus. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 80:21–27)。但是要想利用发酵法进一步提高替考拉宁的产量，在技术上较为困难。

常规的替考拉宁纯化方法是发酵完成后向发酵液中加入氢氧化钠使 pH升为11进行碱化处理，溶解菌丝体以便释放替考拉宁，搅拌一小时后用盐酸中和至pH8.0,如果是5000 L发酵罐发酵替考拉宁，可想而知需要大量的氢氧化钠和盐酸，对环境造成极大的压力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中存在的利用发酵法无法进一步提高替考拉宁产量的不足，提供一种替考拉宁的制备方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种替考拉宁的制备方法，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，在发酵过程中不断将产生的替考拉宁移出发酵体系。

发明人发现抗生素替考拉宁对自身菌体的有害作用。针对这个现象，本发明，在发酵过程中，不断将产生的替考拉宁移出发酵体系，降低抗生素在发酵液中的浓度，得以避开其对替考拉宁产生菌的有害作用，从而提高替考拉宁的产量。

一种替考拉宁的制备方法，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，在发酵过程中不断将产生的替考拉宁移出发酵体系，使发酵体系中的替考拉宁含量低于15 mg/L。

作为一种优选方案，使发酵体系中的替考拉宁含量低于5 mg/L。

作为一种优选方案，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，在替考拉宁产生菌的发酵过程中，加入可吸附替考拉宁的树脂。

向发酵液中加入有效量的可吸附抗生素替考拉宁的树脂，有效降低了由于替考拉宁的积累而引起对自身菌体的有害作用，大大提高了替考拉宁的产量。而且运用此法可以简化了产物提取纯化过程，避免了常规方法提取纯化替考拉宁过程中使用酸和碱，节约了生产成本，有利于环境保护。

作为一种优选方案，所述的树脂为弱极性大孔树脂、非极性大孔树脂和/或亲和树脂。

作为一种最优选方案，所述的非极性树脂为聚苯乙烯树脂；所述的弱极性树脂为聚烷酯树脂；所述的亲和树脂为D-Ala-DAla-AGA树脂。

上述树脂都能够从市场上购买得到。例如，聚苯乙烯树脂商品有Amberlite XAD 16 HP树脂。

作为一种优选方案，树脂的加入体积为培养基体积或发酵液体积的1~10%。

作为一种最优选方案，树脂的加入体积为培养基体积或发酵液体积的5~7%。

作为一种优选方案，加入树脂的时间为在发酵起始时直接将树脂加入灭菌前培养基中或在发酵进行一段时间后将树脂加入发酵液中。所述的发酵进行一段时间，是指发酵进行12~72小时后加入。比如可以在发酵进行12、24、36、48、60或72小时时加入。

作为一种最优选方案，加入树脂的时间为在发酵起始时直接将树脂加入灭菌前培养基中。

作为一种优选方案，所述替考拉宁产生菌为游动放线菌A. teichomyceticus。

作为一种优选方案，发酵完成后，将吸附有替考拉宁的树脂用pH值为4~9.5的解析液进行解析，即得替考拉宁；所述的解析液为有机溶剂。

作为一种最优选方案，所述的PH值为4~7；所述的有机溶剂为体积分数为50~100%的甲醇、50~100%乙醇和/或50~100%丙酮。

作为一种优选方案，所述解析液中还包含无机盐。加入无机盐可以加快解析速度。

作为一种最优选方案，所述的无机盐为铵盐或磷酸盐。

作为一种优选方案，所述解析液体积为树脂体积的3~10倍。

作为一种优选方案，所述的解析温度为5~30℃，搅拌解析液和树脂的混合

液30~60分钟。

作为一种优选方案，在进行解析液解析前，将吸附有替考拉宁的树脂进行水洗。水洗的作用为除去树脂所吸附的杂质。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明所述的替考拉宁的制备方法，极大的提高了替考拉宁发酵水平，产量达到3.9 g/L，超过目前报道的最高2.8g/L的产量；

（2）简化了下游提取过程，对环境更友好。因本发明在替考拉宁发酵过程中，利用树脂吸附替考拉宁，发酵上清液中残余的替考拉宁的含量很少，与传统的方法相比不需要用氢氧化钠对发酵液进行碱化处理及酸中和步骤，在替考拉宁的提取过程中节省了大量的酸和碱，减少生产过程中的管理风险，有利于环保和降低成本。

附图说明

图1为发酵液中加入替考拉宁对终产物的反馈抑制作用。

图2为发酵液中加入替考拉宁对菌体湿重的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明本身不做任何形式的限定。

本发明实施例替考拉宁的效价测定方法

效价测定采用琼脂平板扩散法，测量替考拉宁生物效价的指示菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC 63501。将已知效价的替考拉宁标准溶液和待测品溶液，在枯草芽孢杆菌生长的培养基上进行对照培养，产生透明抑菌圈。比较标准品与待测品抑菌圈的大小，利用两剂量法计算，求出替考拉宁的抗菌效价。

实施例1 替考拉宁对自身菌体生长的影响

替考拉宁固体平板培养基配方组成为(g/L)：葡萄糖1.0，酵母粉2.0，K₂HPO₄1.0,KCl 6.0,MgSO₄.7H₂O 0.6, FeSO₄.7H₂O 0.04, pH 7.0。将替考拉宁成品配制成一定浓度的溶液，过滤除菌后涂布到替考拉宁产生菌固体培养基上，再将替考拉宁孢子悬液涂布于其上。28℃培养箱培养7~10天，观察孢子生长情况。结果如表1所示。

从表1显示替考拉宁对自身菌体的影响，随着涂布在平板表面的替考拉宁浓度增大，孢子开始萌发的时间越长，且生长速度缓慢，当涂布有0.012 g替考拉宁时，其自身孢子几乎不生长。

实施例2替考拉宁对发酵的影响

替考拉宁发酵培养基配方组成为 (g/L)：糊精12，可溶性淀粉20，黄豆粉24，玉米浆16，CaCO₃2.0，pH 6.8。发酵体积150 mL,在发酵途中(24小时) 向发酵液中添加不同浓度(0至30 mg/L) 的经过滤除菌的替考拉宁产品溶液。28℃，150 rpm摇床振荡发酵培养8 d后测其效价及菌体湿重(菌体重量/发酵液重量×%)，观测替考拉宁的生产产率及菌体生长是否受到影响。结果如图1和图2所示。

从图1、图2中可看出，不加替考拉宁的效价为 521.32 U/mL，菌体湿重为20.7%，当替考拉宁的添加浓度为 5~15 mg/L时，替考拉宁的效价呈缓慢增加趋势，湿重缓慢下降；当替考拉宁的浓度为 20 mg/L时，最终替考拉宁的效价为 306.70 U/mL，下降了41%，湿重为 13.63%，下降了35%；当替考拉宁浓度为 30 mg/L时，最终效价仅有116.62 U/mL，其产量下降了将近80%，菌体湿重下降了79%。其形成受到严重抑制作用。

以上结果明确地说明发酵过程中次生代谢产物替考拉宁的积累对其自身菌体及生产都具有较强的抑制作用。

实施例3

替考拉宁发酵培养基如实施例2所示，发酵温度28℃，发酵体积1L。在发酵0、24、48、72小时时，分别加入0%~10%的弱极性聚烷酯树脂(%，M/V)或非极性聚苯乙烯树脂(%，M/V)，全部发酵时间为8天。表2所示为0小时时（即发酵开始时）加入0%至10%的弱极性聚烷酯树脂的效价结果。

所述树脂在加入之前，需要经过预处理，处理方法可以如下：先用100%的甲醇浸泡12 h，以除去其中的杂质，用纯化水洗至中性后，将树脂放入超声波清洗器中超声脱气，处理后的树脂加入未灭菌的发酵培养基中或单独121℃，30 min灭菌。

结果表明，在不同的树脂加入量中，其中5%~7% (树脂体积/发酵液体积) 的效果最佳。如表2所示，在发酵0小时时，添加7%的弱极性聚烷酯树脂和非极性聚苯乙烯树脂，替考拉宁的产量分别是1892.42 U/mL和3173.20U/mL，分别是不加树脂的3.36倍和5.63倍。折合产量为3.9 g/L，本发明中替考拉宁的产量已经超过目前替考拉宁最高产量2.8 g/L。且发酵液中残余的替考拉宁的含量极少，仅为总产量的 1%。

实施例4 替考拉宁的纯化

向实施例3的发酵液发酵完成后，发酵液经过滤分离出吸附树脂，吸附树脂浸泡至80%甲醇溶液中解析。解析在室温下进行，搅拌树脂与80%甲醇溶液的混合液30至60分钟。

对比例1 替考拉宁的常规发酵

替考拉宁发酵培养基配方组成为 (g/L)：糊精12，可溶性淀粉20，黄豆粉24，玉米浆16，CaCO₃2.0，pH 6.8。发酵温度28℃，发酵体积1L。发酵时间8天。

结果表明：实施例3中，加入7%的弱极性聚烷酯树脂(%，W/V)的产量比对比例1高3.36倍，加入7%的非极性聚苯乙烯树脂(%，W/V) 产量比对比例1高5.63倍。

对比例2 替考拉宁的常规纯化

对比例1发酵完毕后，发酵完成后向发酵液中加入氢氧化钠使 pH升为11进行碱化处理，溶解菌丝体以便释放替考拉宁，搅拌一小时后用盐酸中和至pH8.0,过滤后上柱色谱柱，用碱性缓冲液如 pH 9.5，4mol/ L NaHCO₃(含乙腈)洗柱，收集有效部分。结果比本发明实施例4的发酵水平低约70%~80%，且需要大量的酸和碱。

Claims

1.一种替考拉宁的制备方法，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，其特征在于，在发酵过程中不断将产生的替考拉宁移出发酵体系。

2.一种替考拉宁的制备方法，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，其特征在于，在发酵过程中不断将产生的替考拉宁移出发酵体系，使发酵体系中的替考拉宁含量低于15 mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，该制备方法为：利用替考拉宁产生菌发酵制备替考拉宁，其特征在于，在替考拉宁产生菌的发酵过程中，加入可吸附替考拉宁的树脂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的树脂为弱极性大孔树脂、非极性大孔树脂和/或亲和树脂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的非极性树脂为聚苯乙烯树脂；弱极性树脂为聚烷酯树脂；所述的亲和树脂为D-Ala-DAla-AGA树脂。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，树脂的加入体积为培养基体积或发酵液体积的1~10%。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，树脂的加入体积为培养基体积或发酵液体积的5~7%。

8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述替考拉宁产生菌为游动放线菌A. teichomyceticus。

9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，发酵完成后，将吸附有替考拉宁的树脂用pH值为4~9.5的解析液进行解析，即得替考拉宁；所述的解析液为有机溶剂。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述解析液的PH值为4~7；所述的有机溶剂为体积分数为50~100%的甲醇、50~100%乙醇和/或50~100%丙酮。