CN103255119A - 高温β-甘露聚糖酶、编码基因及其工程菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高温β-甘露聚糖酶、编码基因及其工程菌和应用；该基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码获得的β-甘露聚糖酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，及包含编码该甘露聚糖酶基因的重组载体和酵母基因工程菌。本发明的甘露聚糖酶最适温度为80℃，最适pH为3.5-5.0，可耐受80℃高温，在pH2.2-8.0下稳定，作为新型高温酶，具有极大的生产应用价值，在饲料、医药、能源等行业中应用前景广阔。

Description

高温β-甘露聚糖酶、编码基因及其工程菌和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及一种高温β-甘露聚糖酶、编码基因和包含编码该高温酶基因的重组载体和酵母基因工程菌及应用。

技术背景

β-甘露聚糖酶是一类水解β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。其可水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。甘露聚糖在自然界中含量丰富，广泛存在于植物细胞中，如大豆、谷类种子、魔芋精粉、田青胶、角豆胶、澳大利亚蒲葵等（Dhawan S.&Kaur J.,Critical reviews in biotechnology,27(4):197-216）。β-甘露聚糖酶广泛应用于造纸、食品、医药、纺织、饲料和石油开采等领域，成为近年来研究的热点(van Zyl W,et al.,Process Biochemistry,45(8):1203-1213)。

目前，在微生物（细菌、放线菌和真菌）、植物和低等动物中均发现β-甘露聚糖酶的存在（Chauhan PS,et al.,Applied microbiology and biotechnology,93:1817-1830）。真菌和细菌来源的β-甘露聚糖酶具有宽泛的温度和pH作用范围，催化活力高，活力稳定而具有显著的工业应用优势（Akino,et al.,Appl.Microbial Biotech,26:323-327）。

近年来，国内外的研究和开发的β-甘露聚糖酶耐热性较差，不能满足工业应用中一些高温工艺要求。如中国发明专利201110086452.2公开的一种来源于硫色曲霉的新型酸性甘露聚糖酶突变体，其最适温度为65℃，在70℃有较好的稳定性；中国发明专利201110410537.1公开的来源于黑曲霉LW-1的新型酸性甘露聚糖酶，其最适温度为70℃，在60℃以下稳定；中国发明专利200810113343.3公开的来源于Bispora sp.MEY-1的新型酸性甘露聚糖酶，其最适温度为65℃，在60℃以下稳定。研究开发高温β-甘露聚糖酶将具有显著的市场竞争优势和重要的工业应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种高温β-甘露聚糖酶。

本发明的目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的全基因。

本发明的目的是提供包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组载体。

本发明再一目的是提供包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明再一目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的表达方法。

本发明再一目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的应用。

一种高温β-甘露聚糖酶ManT16^M，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M，是满足下列要求的核苷酸序列之一：

1）编码氨基酸序列如SEQ ID No.1的高温β-甘露聚糖酶的核苷酸序列；

2）序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

包含所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M的重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M。

包含所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M重组载体的高温β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌。

构建所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的方法，是将所述的重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M导入毕赤酵母中获得；所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M在重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M中位于α分泌引导肽基因序列下游。

用于构建表达所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的出发菌株为毕赤酵母X-33或GS115。

一种表达高温β-甘露聚糖酶的方法，培养所述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型高温β-甘露聚糖酶工程菌表达，提取纯化后，得到高温β-甘露聚糖酶。

所述的高温β-甘露聚糖酶能在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采和动物饲料添加剂中应用。

本发明是通过基因工程技术获得能够用于食品、医药、洗涤、纺织、饲料和石油开采领域的高温β-甘露聚糖酶。本发明对来源于真菌Aspergillus sp.T16（本菌株已于2013年4月3号保存于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013122）的β-甘露聚糖酶基因进行易错PCR随机突变，经微板培养法筛选得到一株耐热性显著提高的β-甘露聚糖酶。该酶最适温度为80℃，最适pH为3.5-5.0，80℃处理10min仍残留80%以上的酶活，在pH2.2-8.0长期稳定。

本发明提供了编码该高温β-甘露聚糖酶的基因manT16^M，其cDNA序列如序列表中SEQID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M。所述高温β-甘露聚糖酶基因在上述重组载体中位于α分泌引导肽基因序列下游。本发明的最优方案是将高温β-甘露聚糖酶基因***到质粒pGAPZαA中的XhoⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于GAP启动子下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pGAPZα-manT16^M。

本发明提供了包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组菌，是将上述重组载体导入毕赤酵母X-33或GS115中获得。

本发明提供了表达高温β-甘露聚糖酶的方法：培养上述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型表达，过滤除菌后，得到高温β-甘露聚糖酶。

本发明提供了高温β-甘露聚糖酶的应用，在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采或动物饲料添加剂领域中得到广泛应用。

本发明提供的高温β-甘露聚糖酶具有极好的耐热性和较宽的pH作用范围，可应用于食品、纺织、洗涤、医药和饲料行业，根据本发明技术方案可实现利用基因工程手段生产该高温β-甘露聚糖酶。

附图说明

图1：本发明重组菌株X-33/pGAPZα-manT16^M表达产物的SDS-PAGE检测结果。泳道1为重组菌株X-33/pGAPZα-manT16^M发酵上清中蛋白；泳道2为重组菌株X-33/pGAPZα-manT16^M发酵液经Sephadex^TM G-75凝胶纯化所得蛋白；

图2：本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的最适pH检测结果；

图3：本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的pH稳定性检测结果；

图4：本发明表达的野生β-甘露聚糖酶和高温β-甘露聚糖酶的最适温度检测结果；

■为野生β-甘露聚糖酶ManT16，□为高温β-甘露聚糖酶ManT16^M；

图5：本发明表达的野生β-甘露聚糖酶和高温β-甘露聚糖酶的温度稳定性检测结果。

孵育温度为80℃；

图6：本发明表达的高温β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖（刺槐豆胶）质谱检测结果。

A为酶解2h检测结果，B为酶解64h检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，不会对本发明形成限制。

实验材料和试剂

1、菌株及载体：表达载体pGAPZαA和pPICZαA，毕赤酵母菌株X-33和GS115购自于Invitrogen公司；真菌Aspergillus sp.T16为本发明人筛选分离获得，已保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M2013122。

2、试剂：连接酶、限制性内切酶、Pfu DNA Polymerase、反转录试剂盒购自于Fermentas公司，RNA提取试剂盒购自于Promega公司，刺槐豆角购自于Sigma公司，其它试剂均为国产试剂，可从一般的生化试剂公司购买。

3、培养基：

（1）野生菌株的筛选培养基为：0.5%魔芋粉溶于基础盐培养基（NaNO₃，0.2%；K₂HPO₄，0.1%；KCl，0.05%；MgSO₄·7H₂O，0.05%；FeSO₄·7H₂O，0.001%；pH4.5）。Aspergillus sp.T16培养基为：魔芋粉，0.5%；蛋白胨，1%；NaNO₃，0.2%；K₂HPO₄，0.1%；KCl，0.05%；MgSO₄·7H₂O，0.05%；FeSO₄·7H₂O，0.001%（pH4.5）。

（2）大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，pH7.0）和LLB培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，pH7.4）；在LB或LLB液体培养基中加入1.5%琼脂粉得到相应的固体培养基。

（3）酵母菌培养基YPD（2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖）和YPDS（2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖，1M山梨醇）；在YPD或YPDS液体培养基中加入1.5%琼脂粉得到相应的固体培养基。

下述实施例中所采用方法如无特殊说明均为常规的方法；所述引物，序列测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例1、产高温β-甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16筛选

将采自于湖南省长沙市岳麓山桔园的土样经富集培养（富集培养基：0.5%的魔芋粉溶于基础盐培养基，调pH至5.0，30℃，200rpm）48h。富集培养液稀释10⁴-10⁶倍后各0.2mL涂初筛平板（富集培养基中加入1.5%琼脂粉和0.2%刚果红），30℃恒温培养2-3天。初筛平板长出后，待菌落周围有透明的水解圈出现，挑取接种于含有富集培养基的24孔细胞培养板中，30℃，200rpm培养48h。取培养液上清稀释合适的倍数，以0.5%的刺槐豆胶做底物，在pH5.0和80℃，采用DNS法测量培养液中酶活，选取具有较高酶活的菌株。通过此方法筛选到产高温β-甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16。

该菌株在平板分离培养基上30℃培养2天，菌落直径在4cm～5cm，质地疏松，丝绒状。菌落颜色初为白色，3天后变为淡黄色，产生孢子之后变为黑色。菌落中央菌丝生长形成突起边缘不整齐，菌落背面呈淡黄色；孢子头呈球形至放射状，直径约为200～400μm；孢子梗长1～3mm，直径20～25μm，壁光滑，无横隔，无色；分生孢子呈球形，黑色，直径5.0～6.0μm，壁粗糙，有刺状突起；菌丝透明无色，有横隔，一部分伸入培养基内，一部分形成气生菌丝，菌丝顶端膨大形成分生孢子梗。

根据以上形态学和培养特征，初步判定该真菌为曲霉属真菌。该产高温β-甘露聚糖酶的真菌Aspergillus sp.T16已保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M2013122。

实施例2、高温β-甘露聚糖酶及其编码基因的获得

1、编码野生β-甘露聚糖酶基因的克隆

Aspergillus sp.T16在诱导培养基（0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于基础盐培养基，pH5.0，35℃，200rpm）培养48小时，纱布过滤除去菌丝体，培养液上清经透析袋浓缩、透析和SephadexTM G-75凝胶纯化后进行N和C端氨基酸测序，其N端序列为SFASTSGLQF，其C端测序结果为TDHVAAIGSA，两者与来源于Aspergillus usamii（ADZ99027.1）、Aspergilluskawachii（GAA89125.1）、Aspergillus niger（ACJ06979.1，ADK88903.1，AEY76082.1）和Aspergillus sulphureus（ABC59553.1）具有很高的同源性；根据编码上述蛋白相应N端和C端氨基酸的基因序列比对，设计上游简并引物ManTF-5TCCTTCGCCAGCACCTCSGG3和下游简并引物ManTR-5CATGTKGCTGCTATTGGTAGYGCT3。

Aspergillus sp.T16在诱导培养基（0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于查氏基础盐培养基，pH5.0，35℃，200rpm）中培养48小时，纱布过滤获得菌丝体0.1g，置于液氮研钵中充分研磨，之后按照Promega公司产的RNA提取试剂盒提取Aspergillus sp.T16的总RNA。

以提取的Aspergillus sp.T16总RNA为模板，利用Promega的反转录试剂盒得到编码野生β-甘露聚糖酶的cDNA第一链；以第一链cDNA为模板，以上述设计合成的ManTF和ManTR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃充分延伸15min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化产物即为野生β-甘露聚糖酶基因manT16，其序列SEQ ID No.4所示，编码如SEQ ID No.3所示的β-甘露聚糖酶。

2、β-甘露聚糖酶随机突变文库的构建与筛选

以上述野生β-甘露聚糖酶基因manT16为模板，以ManMF-5CATGCCATGGATTCCTTCGCCAGCACC3（CTCGAG为Nco I酶切位点）和ManMR-5CCGCTCGAGAGCACTACCAATAGCAGC3（CTCGAG为Xho I酶切位点）为引物，采用上海博耀生物工程有限公司生产的即用型易错PCR试剂盒进行易错PCR。易错PCR产物经NcoI和XhoI双酶切后连接到双酶切后的pET-22b（+）质粒，电击转化到E.coliBL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆子转接于含氨苄青霉素的LB液体培养基中（置于96孔细胞培养板中），37℃，200rpm，培养至菌浓的OD600等于0.5-0.7，加入1mM的IPTG，于25℃诱导表达12-16h。培养液于5000g离心5min，取上清于80℃孵育10min后，于80℃（pH4.5）测量酶活，选取酶活较高的克隆子为正向突变子，以该突变子为模板进行下一轮易错PCR和正向突变子筛选。经过5轮易错PCR和筛选后，获得一株耐热性显著提高的β-甘露聚糖酶，较野生型β-甘露聚糖酶最适温度提高3至5℃。

3、定点饱和突变文库的构建和筛选

选取上述正向突变子，提取重组质粒，进行测序。测序结果如SEQ ID No.2，其编码的高温β-甘露聚糖酶如SEQ ID No.1，同野生型β-甘露聚糖酶相比，共有10处氨基酸发生突变，分别发生在34、54、55、56、101、112、129、170、204和306位氨基酸，他们突变后的氨基酸分别为I、F、A、H、K、F、V、H、D和F，SEQ ID No.1中对应于编码该10处氨基酸的碱基分别为ATA、TTC、GCG、CAC、AAA、TTC、GTA、CAC、GAC和TTC。针对上述10个氨基酸位点设计10对简并引物（如表1），进行全质粒饱和突变PCR，PCR产物经Dpn I酶切后，电击转化到E.coli BL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆子转接于含氨苄青霉素的LB液体培养基中（置于96孔细胞培养板中），37℃，200rpm，培养至菌浓的OD600等于0.5-0.7，加入1mM的IPTG，于25℃诱导表达12-16h。培养液于5000g离心5min，取上清于80℃孵育10min后，于80℃（pH4.5）测量酶活，选取酶活较高的克隆子为正向突变子。经过筛选获得数十株耐热性显著高于亲本的高温β-甘露聚糖酶以用于后续研究。

表1定点饱和突变引物

4、高温β-甘露聚糖酶及其编码基因的获得

选取上述正向突变子，提取重组质粒(命名为pET-22b-manT16M)，进行测序，进而推导出其对应的编码氨基酸，各种氨基酸和碱基在本发明序列中的简写如表2，测序结果表明野生β-甘露聚糖酶氨基酸序列发生如下方式的突变将利于提高其耐热性：SEQ ID No.1所示的序列中第34、55和129位点氨基酸突变为脂肪族类氨基酸，即第34、55和129位的Xaa可以为A、G、I、L或V；第101、170和204位点氨基酸突变为带电荷类氨基酸，即第101、170和204位的Xaa可以为D、E、R、K或H；第54、56、112和306位点氨基酸突变为芳香族类氨基酸，即第54、56、112和306位的Xaa可以为F、W、Y、H；相对应的SEQ ID No.2所示的序列中，s可以为g或c；k可以为g或t；y可以为c或t；b可以为t、c或g；d可以为t、a或g；r可以为a或g；v可以为c、a或g；n可以为a、t、c或g。以上单个位点或多个位点发生上述突变均可提高野生β-甘露聚糖酶的耐热性。

表2各类氨基酸和碱基在本发明序列中的简写

实施例3、高温β-甘露聚糖酶的制备

以上述重组质粒pET-22b-manT16^M和野生β-甘露聚糖酶基因manT16为模板，以ManF-5CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCTTCGCCAGCACCTCCGG3和ManR-5GCTCTAGATCAAGCACTACCAATAGCAGCAACATG3为引物，进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退活1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃充分延伸15min。用Xho I和Xba I双酶切pGAPZαA和pPICZαA质粒，同时双酶切上述PCR产物，用T4连接酶将双酶切PCR产物与双酶切pGAPZαA和pPICZαA质粒纯化产物进行连接。将连接产物通过热激法转入E.coli DH5α，挑取阳性克隆子菌落PCR鉴定后测序。提取测序正确的重组质粒pGAPZα-manT16、pPICZα-manT16、pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M，电击转化毕赤酵母X33和GS115，涂布于含100μg/mL的YPDS平板，30℃培养2-3天，长出的重组子即为产野生β-甘露聚糖酶和高温β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌。

挑取上述高温β-甘露聚糖酶重组菌株接种于5mL YPD培养基中，28℃，250rpm培养24小时，取1mL接种于100mL YPD培养基中，28℃，250rpm培养36小时，取上清5000g离心5min，测定上清中甘露聚糖酶酶活并进行SDS-PAGE。高温β-甘露聚糖酶重组菌株发酵液中酶活为539U/mL，SDS-PAGE表明发酵液中80%以上为高温甘露聚糖酶（图1）。

实施例4、高温β-甘露聚糖酶的活性分析

采用DNS法对本发明制备的高温β-甘露聚糖酶进行活性分析。具体测量方法如下，取500μL稀释合适倍数的β-甘露聚糖酶溶液加入到500μL溶于0.1M磷酸盐缓冲液的1.0%的刺槐豆角（pH4.5）中，于80℃反应10min后，加入1000μL DNS溶液，沸水煮5min后用冷水冷却，于540nm测量吸光度。

酶活定义：在pH4.5、80℃、1min催化终浓度为0.5%的刺槐豆角（Sigma G0753）产生1μmol甘露糖所需要的酶量为一个酶活单位。

实施例5、高温β-甘露聚糖酶酶学性质分析

1、最适工作pH与pH稳定性分析

最适工作pH值的确定：用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH2.2-8.0）稀释酶液和配制底物，分别于不同pH下按实施例4测定β-甘露聚糖酶的活力。

pH稳定性的测定：纯酶样品置于pH2.2至8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中于室温放置24h后，按实施例4测定残留的酶活力。

结果如图2和3所示，该高温β-甘露聚糖酶的最适pH为3.5-5.0，在pH3.5-6.0具有85%以上的相对酶活，在pH3.0具有60%以上的相对酶活；其在pH2.2-8.0条件下室温放置24h仍残留70%以上的相对酶活。以上表明该酶为酸性β-甘露聚糖酶，具有极好的pH稳定性，适宜于用于饲料、食品、医药、纺织、造纸和石油开采等行业。

2、最适工作温度与温度稳定性分析

最适工作温度的确定：适当稀释纯酶样品后，分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃和90℃按照实施例3测定β-甘露聚糖酶的活力。

温度稳定性的确定：纯酶样品置于80℃下保温不同时间，按实施例4测定残留酶活力（野生型β-甘露聚糖酶纯酶样品置于80℃下保温不同时间后，在75℃反应温度下按实施例4测定残留酶活力）。

结果如图4和5，该酶的最适温度为80℃，显著高于野生型β-甘露聚糖酶；其在80℃保温10min仍残留80%以上的相对酶活，而野生型β-甘露聚糖酶80℃保温10min后活性完全丧失。以上表明，通过对野生型β-甘露聚糖酶多位点氨基酸突变获得的β-甘露聚糖酶具有极好的耐热性，满足了饲料等行业对该酶的耐热性的需求，具有广泛的应用前景。

实施例5、高温β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖特性分析

取10U的高温β-甘露聚糖酶加入甘露聚糖底物溶液中（1%的刺槐豆胶溶于蒸馏水中），于60℃孵育2h和60h以使底物充分水解。14000g离心10min，经超滤除去残留蛋白。酶解产物NH⁴⁺离子化、钠离子化和钾离子化后进行质谱MS分析。

结果如图6所示，质谱分析结果表明，高温β-甘露聚糖酶水解刺槐豆胶主要产物为甘露二糖，及相对少量的甘露糖、甘露三糖和甘露四糖，表明该高温β-甘露聚糖酶可降解甘露聚糖产生低聚合度的甘露寡糖，可广泛应用于食品、医药、饲料、纺织、造纸和石油开采以降解甘露聚糖。

Claims (8)

1.一种高温β-甘露聚糖酶ManT16^M，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 

2.一种高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M，其特征在于，是满足下列要求的核苷酸序列之一： 

1）编码氨基酸序列如SEQ ID No.1的高温β-甘露聚糖酶的核苷酸序列； 

2）序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。 

3.包含权利要求2所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M的重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M。 

4.包含权利要求3所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M重组载体的高温β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌。 

5.构建权利要求4所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的方法，是将权利要求3所述的重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M导入毕赤酵母中获得；所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16^M在重组载体pGAPZα-manT16^M和pPICZα-manT16^M中位于α分泌引导肽基因序列下游。 

6.根据权利要求5所述构建工程菌的方法，其特征在于，用于构建表达所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的出发菌株为毕赤酵母X-33或GS115。 

7.一种表达高温β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，培养权利要求4所述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型高温β-甘露聚糖酶工程菌表达，提取纯化后，得到高温β-甘露聚糖酶。 

8.权利要求1所述的高温β-甘露聚糖酶在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采和动物饲料添加剂中的应用。 

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