CN103245651B - 一种适用于毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测装置的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的领域为分析仪器研究领域。本发明是一种适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，装置中，激光由激光器发出，分别经过激光滤光片的过滤，经过呈水平45度放置的二向色镜的反射，以及物镜的聚焦，从水平位置偏移毛细管中心一定距离的位置入射进入圆形毛细管的通道内，激发通道内的待测组分产生荧光，激发产生的荧光经物镜的收集，分别经过二向色镜，聚焦透镜，空间滤波小孔，荧光滤光片，最后进入光电检测器件。该方法不仅适用于毛细管电泳、毛细管色谱、毛细管电色谱等微柱分离***中，还可以用于基于圆形毛细管流通池的流动注射分析、顺序注射分析、微流控液滴分析、流式细胞仪等分析***中。<!--1-->

Description

一种适用于毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测装置的检测方法

技术领域

本发明涉及的领域为分析仪器研究领域，特别是涉及一种适用于毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测方法与装置。

背景技术

本专利涉及的是有关适用于毛细管柱上检测的高灵敏荧光检测***的研究。激光诱导荧光检测（Laserinducedfluorescence,LIF）是化学分析领域最灵敏的检测技术之一。与其他检测技术相比，激光诱导荧光检测具有以下优点：超微样品检测体积（皮升至飞升级）、高灵敏度、高特异性、高重现性。更重要的是，将激光诱导荧光检测***与高分辨率分离技术相结合（例如毛细管电泳、毛细管液相色谱），其应用领域从分析化学扩展到了生物医学领域，如基因组学、蛋白质组学、单分子及单细胞分析、以及临床诊断等，并对这些学科的发展产生了较大的推动作用。

激光诱导荧光检测（LIF）的灵敏度主要受到来自于光学元件及溶剂的背景信号的影响（AmbroseWP,GoodwinPM,JettJH,et.al.Chem.Rev.1999,99,10,2929-2956）。因此，提高LIF检测***灵敏度的主要途径是尽量地降低检测***的背景信号强度。目前，已有各种方法来降低背景信号。例如设计具有鞘流池的正交光路***（ChengYF,DovichiNJ.,Science1988,242,4878,562-564）；使用高性能的荧光发射滤光片或者滤光片组合（JiangGF,AttiyaS,OcvirkG,LeeWE,HarrisonDJ.,Biosens.Bioelectron.2000,14,10,861-869）；以及使用远红外激光激发（SoperSA,MattinglyQL,VeguntaP.,Anal.Chem.,1993,65,6,740-747）等方法。然而，这些方法往往存在光学结构相对复杂、操作繁琐、设备昂贵、适用性不强等缺点。

目前，激光诱导荧光检测器的光路结构主要分为正交型光路结构（ChengYF,DovichiNJ.,Science1988,242,4878,562-564）和共焦型光路结构（JiangGF,AttiyaS,OcvirkG,LeeWE,HarrisonDJ.,Biosens.Bioelectron.2000,14,10,861-869）。共焦型光路结构具有易于搭建、集成度高、易于微型化、灵敏度高的特点，因此广泛应用于商品化的激光诱导荧光检测器中。然而，在将共焦型激光诱导荧光检测器用于毛细管电泳和毛细管色谱***的柱上检测器时，常常难以获得较低的检测限。这是由于石英毛细管材料与空气的折射率指数相差较大，当激发光入射到圆形毛细管上时，会在毛细管的内外表面产生较强的反射光和散射光，造成较高的检测背景信号。并且，由于圆柱形毛细管存在的透镜效应，对激光光束产生较大的光学畸变，从而导致难以采用小孔空间滤波的方法降低背景信号。

为了提高用于毛细管柱上共焦荧光检测***的灵敏度，Lundqvist等人（Lundqvist,A.,Chiu,D.T.,Orwar,O.,Electrophoresis,2003,24,1737–1744）在毛细管和聚焦透镜之间填充与毛细管折射率接近的油相液体，来降低由于折射率相差较大导致的界面反射和散射造成的高检测背景，从而提高检测灵敏度。并且，为了匹配高倍数的油镜，他们还将毛细管进行了拉细处理，使其内径至0.8–8微米。尽管这种方法可有效提高检测灵敏度，但是其采用的超细内径的毛细管加工困难、容易堵塞，且比较脆弱，易折断，因而限制了该方法在常规实验和商品化仪器中的进一步应用。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题是提供一种适用于圆形毛细管柱上检测的激光诱导荧光检测方法和装置。该方法具有检测灵敏度高、光学结构简单、易加工和搭建、易于集成化和微型化，特别适用于基于圆形毛细管的电泳和色谱分离***的柱上检测。

本发明的具体技术方案是：

本发明是一种适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，所述的装置中，激光由激光器发出，分别经过激光滤光片的过滤，经过呈水平45度放置的二向色镜的反射，以及物镜的聚焦，从水平位置偏移毛细管中心一定距离的位置入射进入圆形毛细管的通道内，激发通道内的待测组分产生荧光，定义激光在毛细管内的聚焦中心位置与毛细管的中心的距离为偏移距离，激发产生的荧光经物镜的收集，分别经过二向色镜，聚焦透镜，空间滤波小孔，荧光滤光片，最后进入光电检测器件进行检测。

作为一种改进，本发明所述的激光从水平方向上偏移圆形毛细管中心一定距离的位置入射到毛细管内，偏移距离的绝对值大于0，小于毛细管外径值的一半；优选为大于10微米，小于毛细管通道内径值的一半。

作为一种改进，本发明所述的适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，圆形毛细管的材质为石英或者玻璃或者透明高分子聚合物材料。

作为一种改进，本发明所述的圆形毛细管的内径范围为10–1000微米，外径范围为50–5000微米，圆形毛细管横截面的形状为正圆形或者椭圆形。

作为一种改进，本发明所述的物镜的放大倍数为10×–100×，优选为25×-60×。

作为一种改进，本发明所述的空间滤波小孔的孔径为50–1000微米，由所选的物镜（5）以及毛细管（7）内径确定，空间滤波小孔（11）的孔径优选为100–500微米。

本发明的主要优点在于，激光聚焦位置偏移所引起的荧光检测光路中的反射激光光束和荧光光束自发的分离，显著地降低了荧光检测中的检测背景，而荧光强度基本不变，从而显著提高了检测灵敏度，有利于溶液中超低浓度物质的分析。该方法无需额外的复杂光路设计或者毛细管的加工，光路结构简单，容易在常规的共焦型激光诱导荧光检测器上实现。该方法不仅适用于毛细管电泳、毛细管色谱、毛细管电色谱等微柱分离***中，还可以用于基于圆形毛细管流通池的流动注射分析、顺序注射分析、微流控液滴分析、流式细胞仪等分析***中。

附图说明

图1是根据本发明的一个优选实施例1的荧光检测***的光路结构侧视示意图；

图2是根据本发明的优选实施例1的装置在不同聚焦偏移距离对应的信噪比实验测试结果示意图；

图3是根据本发明的优选实施例1的装置测定不同浓度荧光素钠的信号示意图；

图4是根据本发明的优选实施例1的装置用于毛细管电泳分离***的柱上检测信号示意图。

图中，1是激光，2是激光器，3是激光滤光片，4是二向色镜，5是物镜，6是毛细管中心，7是毛细管，8是通道，9是荧光，10是聚焦透镜，11是空间滤波小孔，12是荧光滤光片，13是光电检测器件。

具体实施方式

参照附图，以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。

图1是根据本发明所建立的一种用于圆形毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测的检测光路侧视图。激光1由激光器2发出，分别经过激光滤光片3的纯化，呈水平45度放置的二向色镜4的反射，以及物镜5的聚焦，从水平方向偏移毛细管中心6一定距离d的位置入射进入圆形毛细管7的通道8内激发产生荧光。圆形毛细管的内径范围为10–1000微米，外径范围为50–5000微米，毛细管横截面的形状为正圆形或者椭圆形。偏移距离d的绝对值大于0，小于毛细管（7）外径值的一半。作为优选，偏移距离d的绝对值大于10微米，小于毛细管7内径值的一半。激发产生的荧光9经物镜5的收集，分别经过二向色镜4，聚焦透镜10，空间滤波小孔11，荧光滤光片12，最后进入光电检测器件13检测信号。

图2是根据本发明的优选实施例1的装置在不同聚焦偏移距离的实验测试结果。实验中选用半导体泵浦激光器（473纳米）作为激发光源2，光电倍增管作为光电检测器件13。选用的毛细管7横截面为圆形，外径为360微米，内径为75微米。在不同的偏移距离d下，进样相同体积的100皮摩尔每升的荧光素钠样品，并测定信号对应的信噪比。可以看出，在0微米时，信噪比值最低，仅为9左右。而在偏移距离为±20微米时，检测***具有最高的信噪比值，为89~96，是0微米时的9至10倍，证明了偏移激光聚焦位置对于提高荧光检测灵敏度的重要性。

图3是根据本发明的优选实施例1的装置对不同浓度荧光素钠溶液的信号测定结果。选取的偏移距离为＋20微米，其他条件与图2相同。分别进样0.1皮摩尔每升，1皮摩尔每升，10皮摩尔每升，100皮摩尔每升的荧光素钠样品，每个浓度进样三次，得到的信号峰如图3所示。其中，最低的浓度0.1皮摩尔每升对应信号的三次平均信噪比为4.5，因此可计算出当前检测器的检测限为66飞摩尔每升。

图4是根据本发明的优选实施例1的装置用于毛细管电泳分离***的柱上检测信号图。使用长3厘米、内径75微米、外径360微米的圆形石英毛细管7作为电泳分离通道。实验中选用的样品为异硫氰酯荧光素（FITC）标记的四种氨基酸，浓度均为100皮摩尔每升。选取的偏移距离为＋20微米，其他条件与图2相同。四次连续的电泳分离图见图4所示，氨基酸混合物电泳分离峰高的相对标准偏差（RSD）分别为：6.6％（FITC-Arg），11.0％（FITC-Phe），9.3%（FITC-Gly）和6.6%（FITC-Glu），其实验结果重现性良好。

以上列举的仅是本发明的一个具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，其特征在于：激光(1)由激光器(2)发出，分别经过激光滤光片(3)的过滤，经过呈水平45度放置的二向色镜(4)的反射，以及物镜(5)的聚焦，从水平位置偏移毛细管中心(6)一定距离的位置入射进入圆形毛细管(7)的通道(8)内，激发通道(8)内的待测组分产生荧光(9)，定义激光(1)在毛细管(7)内的聚焦中心位置与毛细管的中心(6)的距离为偏移距离(d)，激发产生的荧光(9)经物镜(5)的收集，分别经过二向色镜(4)，聚焦透镜(10)，空间滤波小孔(11)，荧光滤光片(12)，最后进入光电检测器件(13)进行检测，所述的偏移距离(d)的绝对值大于10微米，小于毛细管(7)通道(8)内径值的一半。

2.根据权利要求1所述的适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，其特征在于，所述的物镜(5)的放大倍数为10×–100×。

3.根据权利要求2所述的适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测装置的检测方法，其特征在于，所述的物镜(5)的放大倍数为25×-60×。

4.根据权利要求1或3所述的适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，其特征在于，所述的空间滤波小孔(11)的孔径为50–1000微米，由所选的物镜(5)以及毛细管(7)内径确定。

5.根据权利要求4所述的适用于毛细管柱上检测的高灵敏激光诱导荧光检测装置的检测方法，其特征在于，所述的空间滤波小孔(11)的孔径为100–500微米。