CN109991198B - 可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测*** - Google Patents

Abstract

可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，属于分析检测技术领域。该检测***采用共聚焦型结构，包括激光光路、荧光收集光路和成像校准光路。由激光器、中性密度滤光片、激光滤光片、柱面透镜、二向色镜和物镜组成激光光路；物镜、二向色镜、荧光滤光片、透镜、狭缝和硅雪崩光电二极管构成荧光收集光路；发光二极管(LED)、滤光片、光阑、物镜、二向色镜、反射镜、透镜和摄像机组成成像校准光路。成像校准光路简化了毛细管、芯片在激光诱导荧光检测***应用中的聚焦步骤，实现检测窗口与激光光斑的可视化调节和实时在线显示。本检测***灵敏度高，稳定性良好，其对荧光素钠的检测可达到幺摩尔级。

Description

可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***。

背景技术

在20世纪70年代由Diebold和Zare首次提出激光诱导荧光检测 (LIF)与高效液相色谱相结合用于黄曲霉素B1、B2、G1和G2的分离分析。采用激光作为激发光源有其独特的优势，激光具有单色性好，聚光性强等特点，可将光束聚焦到一个非常小的区域，光子流量高，从而大大提高了检测灵敏度。目前，LIF检测器是灵敏度最高的检测器之一，它适用于微小体积样品检测，可与毛细管液相色谱、毛细管电泳、微流控芯片色谱分析等多种毛细管或微芯片分离技术联用。许多样品都能自发产生荧光或通过衍生产生荧光以达到荧光检测的目的，因此LIF检测器成为了分析化学、分子生物学和生物医学等领域的首选技术之一，在食品、药物、环境污染物、核酸、蛋白质、细胞等分析检测中有着广泛的应用。

LIF检测器主要由光源、光学***、检测池和光检测元件组成。为了达到高灵敏的检测，LIF检测***尽可能高效地激发荧光发射和收集荧光信号，并降低背景信号的干扰。检测池壁、荧光、洗脱液的瑞利散射和拉曼散射以及光学元件间的杂散光是影响检测灵敏度的主要因素。通常采用光谱、时间或空间分辨等过滤方式来降低背景杂散光的干扰。光谱过滤方式是将带通、光学滤光片相结合，以去除发射荧光波长范围以外的光。时间分辨是以脉冲激光为激发光源，通过时间分辨技术来消除瑞利散射和拉曼散射光的干扰。空间过滤方式是采用针孔、狭缝等以扣除检测区域以外的背景杂散光，同时提高检测的选择性，但该方法操作繁琐且适用性不强。

随着微纳尺度分析的发展，提高分析速率，减少固定相和流动相的消耗，降低样品进样量是微纳尺度分离分析技术亟待逐步解决的难题，因此促使了色谱、电泳等技术微型化发展。毛细管和芯片采用微径或纳径通道作为分离柱，通常结合激光诱导荧光检测***实现对物质的定量分离分析。细内径分离柱具有柱效高，样品体积消耗小，流速低等特点，在微纳分析领域的应用比较广泛，分离分析微量物质具有较大优势。毛细管和芯片与激光诱导荧光结合，需要实现聚焦等工作，通常是将含有荧光物质的溶液注入到通道内，流经检测窗口的荧光物质受到激光激发后发射出荧光，根据光检测元件输出的荧光信号大小来调节检测窗口与检测***的相对位置来进行光路校准。但是当通道尺寸缩小到纳米级时，如果无法观察到检测窗口的位置，就需要花费较长的时间来完成校准操作。并且，色谱分离多选用色谱柱作为分离介质，按照固定相形式不同将色谱柱分为填充柱、开管柱和整体柱，由于色谱柱有固定相填充或凃壁修饰等，造成聚焦时荧光试剂清洗困难等问题，影响样本的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，在提高仪器检测灵敏度、降低检测限的同时简化聚焦步骤，并通过成像校准光路实现检测窗口聚焦位置的可视化校准及实时在线显示。

所述可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，采用共聚焦型结构，由激光光路、荧光收集光路和成像校准光路三个光路构成。发光二极管(LED)(13)、滤光片(14)、光阑(15)、物镜(5)、第一二向色镜(6)、第二二向色镜(7)、反射镜(16)在同一纵轴上；光泵半导体激光器(1)、中性密度滤光片(2)、激光滤光片(3)、柱透镜(4)和第一二向色镜(6)依次光路连接且同在第一横轴上，与物镜(5)一起构成激光光路；硅雪崩光电二极管(11)、狭缝空间滤光片(10)、透镜(9)、带通滤光片(8)与第二二向色镜(7)依次光路连接且同在第二横轴上，与物镜(5)和第一二向色镜(6)共同构成荧光收集光路；摄像机(18)、透镜(17)、反射镜(16)依次光路连接且同在第三横轴上，与LED(13)、滤光片(14)、光阑(15)、物镜(5)、第一二向色镜(6)、第二二向色镜(7)共同构成成像校准光路；

所述激光光路由光泵半导体激光器(1)作为激光光源，从激光器(1)发出的激光光束依次经过中性密度滤光片(2)、激光滤光片 (3)、柱面透镜(4)等光学元件，通过第一二向色镜(6)反射后由物镜(5)聚焦，在检测窗口位置激发含荧光的样品产生荧光信号；其中中性密度滤光片(2)将激光强度衰减，与激光器波长相匹配的激光滤光片(3)对激光光束进行纯化，柱面透镜(4)沿一维方向将激光光束由圆形光斑整形成线型光斑；

所述荧光收集光路是先经物镜(5)收集荧光信号，穿过第一二向色镜(6)后被第二二向色镜(7)反射，然后经与检测物质发射波长相匹配的带通滤光片(8)滤除发射荧光以外的杂散光后通过透镜 (9)聚焦，再经狭缝空间滤光片(10)进一步滤除杂散光后进入硅雪崩光电二极管(11)进行检测，硅雪崩光电二极管(11)模块与数据采集卡相连，进行数据存储。

所述成像校准光路采用LED(13)作为光源，在检测窗口上方照射，经滤光片(14)过滤，由光阑(15)调节光强后经物镜(5) 收集，相继穿过两个二向色镜后经反射镜(16)反射，再通过透镜(17) 聚焦后到达摄像机(18)进行实时图像采集与显示。

所述一种可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，其特征在于：使用两片长波通二向色镜，二向色镜对短于截止波长的光具有高的反射率，对大于截止波长的光具有高的透射率，因而可以实现光谱分光。以λ1表示激光波长，λ2表示荧光波长，λ3表示LED光波长，λ3＞λ2＞λ1。第一二向色镜(6)的截止波长大于激光波长λ1，激发光被此二向色镜反射，发射的荧光λ2和LED光λ3则透过，由此来消除激发光对荧光检测的干扰。第二二向色镜(7)的截止波长大于荧光波长λ2，同时反射荧光λ2，透过LED光λ3，起到分离荧光和LED光的作用,实时成像过程中LED光不影响激光入射和荧光收集。

所述成像校准光路的通过三维平移台x-y-z轴来调节检测窗口与物镜或激光的相对的位置并通过软件显示，根据软件中实时显示的位置信息和光强分布曲线图谱来聚焦。将毛细管或芯片的分离柱通道径向(横截面方向)与物镜(或激光)相对位置的调节方向定义为x轴，分离柱轴向与物镜间的调节方向定义为y轴，分离柱与物镜间距离的调节方向定义为z轴。在分离柱通道中注入溶液进行成像校准，y轴位置可直接观察来进行调节。在调节x和z轴时，当激光聚焦至通道内时，可在图像上观察到通道内出现一光斑(20)，在软件中对毛细管或芯片通道上光斑所在的位置划垂线(21)，根据垂线上的光强分布得到一条曲线(VLP)，当激光光束准直入射通道中心位置时，光斑亮度最大，VLP中相应位置的谱峰高度达到最大值。当激光光束与通道横截面间的位置发生偏移时，光斑亮度减弱或消失，对应VLP中的谱峰高度降低或消失。

可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***的优点是获得了更高的检测灵敏度和更低检测限，简化了毛细管和芯片聚焦步骤，实现检测窗口聚焦位置的可视化校准及实时在线显示。

附图说明

图1是可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***的结构示意图。

图2是采用柱面透镜对激光光束整形前后对比图。

图3毛细管可视化实时成像聚焦结果图；

(a)是定义x-y-z轴示意图；

(b)是毛细管聚焦可视化实时成像图示；

(c)是毛细管聚焦的光强分布曲线谱图；

(d)是毛细管聚焦x轴校准实时成像图和光强分布曲线谱图；(ⅰ是激光光束准直入射毛细管通道中心位置时的成像；ⅱ是对应于ⅰ的光强分布曲线；ⅲ是激光光束与毛细管横截面间的位置发生偏移时的成像；ⅳ是对应于ⅲ的光强分布曲线)；

(e)是毛细管聚焦z轴校准实时成像图和光强分布曲线谱图。

图4芯片可视化实时成像聚焦结果图；

(a)是芯片聚焦的x轴校准实时成像图和光强分布曲线谱图；

(b)是芯片聚焦的z轴校准实时成像图和光强分布曲线谱图。

图5是毛细管色谱检测荧光素实验结果图。

图中，1.激发波长为488nm的光泵半导体激光器，2.中性密度滤光片，3.中心波长为488nm的激光滤光片，4.柱透镜，5.物镜，6.第一二向色镜(截止波长为488nm的二向色镜)，7.第二二向色镜 (截止波长为600nm的二向色镜)，8.中心波长为535nm的带通滤光片，9.透镜，10.狭缝空间滤光片，11.硅雪崩光电二极管，12.数据采集卡，13.发光二极管(LED)，14.滤光片，15.光阑，16.反射镜，17.透镜，18.摄像机，19.计算机，20.光斑，21.垂线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明，但本发明并限于以下实施例。

实施例1

如图1所示，是可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***的结构示意图，LED灯(13)、滤光片(14)、光阑(15)、物镜(5)、截止波长为488nm的第一二向色镜(6)、截止波长为600nm的第二二向色镜(7)、反射镜(16)在同一纵轴上。激发波长为488nm的光泵半导体激光器(1)、中性密度滤光片(2)、中心波长为488nm 的激光滤光片、柱透镜(4)和截止波长为488nm的第一二向色镜(6) 在同一横轴，激发波长为488nm的光泵半导体激光器(1)发出的激光光束通过中性密度滤光片(2)衰减和中心波长为488nm的激光滤光片(3)纯化，再经过柱透镜(4)沿一维方向整形成线型光斑，通过截止波长为488nm的第一二向色镜(6)反射由物镜(5)聚焦，在检测窗口位置激发含荧光的样品产生荧光信号。

硅雪崩光电二极管(11)、狭缝空间滤光片(10)、柱透镜(9)、中心波长为535nm的带通滤光片(8)与截止波长为600nm的第二二向色镜(7)在同一横轴，产生的荧光信号先经物镜(5)收集，穿过截止波长为488nm的第一二向色镜(6)后被截止波长为600nm 的第二二向色镜(7)反射，然后经中心波长为535nm的带通滤光片 (8)滤除杂散光通过透镜(9)聚焦，再经狭缝(10)进一步滤除杂散光后进入硅雪崩光电二极管(11)进行检测，硅雪崩光电二极管模块与数据采集卡(12)相连，进行数据存储。

反射镜(16)、透镜(17)、摄像机(18)在同一横轴上，LED(13) 在检测窗口上方照射，经滤光片(14)过滤，由光阑(15)调节光强后经物镜(5)收集，相继穿过两个二向色镜后经反射镜(16)反射，再通过透镜(17)聚焦后到达摄像机(18)，摄像机与ThorCam软件连接进行实时图像采集与显示。

如图2所示，是采用柱面透镜对激光光束整形前后对比图。

采用平凸圆形柱面透镜(4)对激光光束进行聚焦，图2中的(a) 和(b)分别为激光光束经平凸圆形柱面透镜聚焦前和聚焦后的放大图像，光斑形状为圆形(图2(a))的入射激光光束沿一维方向聚焦后变换整形为线型光斑(图2(b))激光光束。聚焦后的线型光斑宽度比圆形光斑直径缩小了近3.4倍，单位面积内拥有更高的光子流量。线型光斑激光光束经物镜聚焦入射到毛细管通道内，对通道内的片层区域进行检测，提高了该检测***的空间分辨能力，也更有利于对微纳通道上微小区域的分析检测。

如图3所示，是毛细管可视化实时成像聚焦结果图，采用 ThorCam软件进行图像采集。

毛细管检测窗口固定在x-y-z三维平移台上，将毛细管径向(横截面方向)与物镜(或激光)相对位置的调节方向定义为x轴，毛细管轴向与物镜间的调节方向定义为y轴，毛细管与物镜间距离的调节方向定义为z轴(见图3(a))。在此对450nm半径毛细管(管内注有溶液)进行成像校准操作，y轴位置可直接观察来进行调节。在调节x轴时，当激光聚焦至毛细管通道内时，可在图像上观察到毛细管通道内出现一光斑(20)，在软件中对毛细管上光斑所在的位置划垂线(21)如图3(b)所示，根据垂线上的光强分布得到一条曲线(VLP)，如图3(c)所示。当激光光束准直入射毛细管通道中心位置时，光斑亮度最大，VLP中相应位置的谱峰高度达到最大值。当激光光束与毛细管横截面间的位置发生偏移时，光斑亮度减弱或消失(图3(d) 中的iii)，对应VLP中的谱峰高度降低或消失(图3(d)中的iv)。基于此来对x轴进行调节，使激光光束准直入射至毛细管通道中心，达到最优位置。在调节z轴时，当毛细管与物镜间的距离处于最佳位置时，毛细管内壁变得透明，定义此时为0nm(图3(e)0nm)，对应的VLP接近一条平滑直线。当距离减小或远离时，毛细管会呈现出不同的像，(图3(e))+10nm和-10nm图像分别为距离增大和减少10nm时所对应的毛细管图像，相应的VLP也出现了波动。通过此方法来对z轴位置进行校准。

如图4所示，是芯片可视化实时成像聚焦结果图，采用ThorCam 软件进行图像采集。

芯片固定在x-y-z三维平移台上，将通道径向(横截面方向)与物镜(或激光)相对位置的调节方向定义为x轴，通道轴向与物镜间的调节方向定义为y轴，芯片与物镜间距离的调节方向定义为z轴。在此对通道尺寸为5μm的芯片进行成像校准操作，与毛细管校准操作类似，y轴位置可直接观察来进行调节。在调节x轴和z轴时，随着通道与物镜相对位置和距离远近变化光斑亮度和VLP谱峰均发生变化。当调节x轴时，激光光束准直入射芯片通道中心位置时，光斑亮度最大，VLP中相应位置的谱峰高度达到最大值。当激光光束与通道位置发生偏移，光斑亮度减弱或消失，对应VLP中的谱峰高度降低或消失(图4(a))。在调节z轴时，当芯片与物镜间的距离发生变化时，VLP谱峰也出现相应的波动(图4(b))，以此来聚焦芯片通道。

检测窗口与LIF检测***的可视化校准为微纳尺度通道的柱上检测带来了极大的便利，可以避免使用荧光试剂进行聚焦的繁琐，对于凃壁修饰的分离柱(如窄径多孔层开管柱)也免去了荧光聚焦所导致的清洗困难问题。

如图5所示，是毛细管色谱检测荧光素实验结果图。

样品：浓度为10pmol/L荧光素钠溶液；色谱柱：内径为1μm，外径为360μm的石英毛细管，总长度34cm，有效长度29cm；缓冲溶液：10mmol/L的Tris-EDTA溶液，pH 8.0；进样条件：100psi， 10s；驱动压力：1000psi；图3为本测试条件下10pmol/L的荧光素钠溶液进样分离所得到的色谱图。色谱信号峰的平均信噪比约为3，***对荧光素钠的检测限为10pmol/L。根据进样时间、流速和浓度，本检测***对荧光素钠可达到幺摩尔级的检测。

Claims (4)

1.一种可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，其特征在于，能实现毛细管或芯片检测窗口聚焦位置的可视化校准及实时在线显示；所述可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***采用共聚焦型结构，由激光光路、荧光收集光路和成像校准光路三个光路构成；发光二极管LED(13)、滤光片(14)、光阑(15)、物镜(5)、第一二向色镜(6)、第二二向色镜(7)、反射镜(16)在同一纵轴上；光泵半导体激光器(1)、中性密度滤光片(2)、激光滤光片(3)、柱透镜(4)和第一二向色镜(6)依次光路连接且同在第一横轴上，与物镜(5)一起构成激光光路；硅雪崩光电二极管(11)、狭缝空间滤光片(10)、透镜(9)、带通滤光片(8)与第二二向色镜(7)依次光路连接且同在第二横轴上，与物镜(5)和第一二向色镜(6)共同构成荧光收集光路；摄像机(18)、透镜(17)、反射镜(16)依次光路连接且同在第三横轴上，与LED(13)、滤光片(14)、光阑(15)、物镜(5)、第一二向色镜(6)、第二二向色镜(7)共同构成成像校准光路；所述激光光路由光泵半导体激光器(1)作为激光光源，从激光器(1)发出的激光光束依次经过中性密度滤光片(2)、激光滤光片(3)、柱面透镜(4)光学元件，通过第一二向色镜(6)反射后由物镜(5)聚焦，在检测窗口位置激发含荧光的样品产生荧光信号；其中中性密度滤光片(2)将激光强度衰减，与激光器波长相匹配的激光滤光片(3)对激光光束进行纯化，柱面透镜(4)沿一维方向将激光光束由圆形光斑整形成线型光斑；

所述成像校准光路通过三维平移台x-y-z轴来调节检测窗口与物镜或激光的相对的位置并通过软件显示，根据软件中实时显示的位置信息和光强分布曲线图谱来聚焦，将毛细管或芯片通道径向即横截面方向与物镜或激光相对位置的调节方向定义为x轴，通道轴向与物镜间的调节方向定义为y轴，毛细管或芯片与物镜间距离的调节方向定义为z轴；在通道中注入溶液进行成像校准，y轴位置可直接观察来进行调节；在调节x和z轴时，当激光聚焦至通道内时，可在图像上观察到通道内出现一光斑(20)，在软件中对毛细管或芯片通道上光斑所在的位置划垂线(21)，根据垂线上的光强分布得到一条曲线VLP，当激光光束准直入射通道中心位置时，光斑亮度最大，VLP中相应位置的谱峰高度达到最大值；当激光光束与通道横截面间的位置发生偏移时，光斑亮度减弱或消失，对应VLP中的谱峰高度降低或消失。

2.按照权利要求1所述的一种可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，其特征在于，所述荧光收集光路是先经物镜(5)收集荧光信号，穿过第一二向色镜(6)后被第二二向色镜(7)反射，然后经与检测物质发射波长相匹配的带通滤光片(8)滤除发射荧光以外的杂散光后通过透镜(9)聚焦，再经狭缝空间滤光片(10)进一步滤除杂散光后进入硅雪崩光电二极管(11)进行检测，硅雪崩光电二极管(11)模块与数据采集卡相连，进行数据存储。

3.按照权利要求1所述的一种可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，其特征在于，所述成像校准光路采用LED(13)作为光源，在检测窗口上方照射，经滤光片(14)过滤，由光阑(15)调节光强后经物镜(5)收集，相继穿过两个二向色镜后经反射镜(16)反射，再通过透镜(17)聚焦后到达摄像机(18)进行实时图像采集与显示。

4.按照权利要求1所述的一种可视化实时成像聚焦的激光诱导荧光检测***，其特征在于，以λ1表示激光波长，λ2表示荧光波长，λ3表示LED光波长，λ3＞λ2＞λ1，第一二向色镜(6)的截止波长大于激光波长λ1，激发光被此二向色镜反射，发射的荧光λ2和LED光λ3则透过，由此来消除激发光对荧光检测的干扰；第二二向色镜(7)的截止波长大于荧光波长λ2，同时反射荧光λ2，透过LED光λ3，起到分离荧光和LED光的作用,实时成像过程中LED光不影响激光入射和荧光收集。

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