CN103237813A - 靶向破骨细胞相关蛋白涎免凝集素-15的抗体 - Google Patents

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Abstract

抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞的骨吸收的能够结合涎免凝集素-15的分离抗体，或其功能片段。抗体的重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述CDRH1包含与SEQIDNO:106具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH2包含与SEQIDNO:107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含与SEQIDNO:35、45、55、65或80中的一个具有至少80%序列同一性的序列。抗体的轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRL1包含与SEQIDNO:73或83具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含与SEQIDNO:108具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含与SEQIDNO:40、50、60、70、90、100或109中的一个具有至少80%序列同一性的序列。

Description

靶向破骨细胞相关蛋白涎免凝集素-15的抗体
[技术领域]
本发明涉及可用作用于异常骨代谢的治疗和/或预防剂的物质。本发明还涉及药物组合物例如抗体和编码该抗体的多核苷酸。此外，本发明涉及治疗和/或预防异常骨代谢的方法。
[背景技术]
已经知道骨是通过重复形成和吸收而不断重建以改变其自身形态并维持血钙水平的动态器官。健康的骨维持通过成骨细胞的骨形成和通过破骨细胞的骨吸收之间的平衡，并且骨量维持不变。相比之下，当骨形成和骨吸收之间的平衡丧失时，发生异常骨代谢例如骨质疏松症(Endocrinological Review (内分泌学综述), (1992) 13, 第66-80页; Principles of Bone Biology (骨生物学原理), Academic Press, New York, (1996) 第87-102页)。
作为调节骨代谢的因子，许多全身性激素和局部细胞因子已经被报道，并且这些因子彼此协作，以形成和维持骨(Endocrinological Review (内分泌学综述), (1992) 13, 第66-80页; Endocrinological Review (内分泌学综述), (1996) 17, 第308-332页)。作为由于老化引起的骨组织变化，骨质疏松症的发生广为人知，但其发生机制包括多种因子，例如性激素分泌的减少和激素受体异常、骨中细胞因子局部表达变化、老化基因的表达以及破骨细胞或成骨细胞分化失败或功能异常，因此很难将其视为一种简单的与年龄相关的生理现象。原发性骨质疏松症主要分为由于***分泌减少引起的绝经后骨质疏松症和由于老化引起的老年性骨质疏松症，但对骨形成和骨吸收调节机制的基础研究的进步是阐明其发生机制和开发用于其的治疗剂所必需的。
破骨细胞是造血干细胞衍生的多核细胞，并且通过在破骨细胞粘附的骨表面上释放氯离子和氢离子，破骨细胞酸化骨表面与破骨细胞之间的间隙，并且还分泌其为酸性蛋白酶的组织蛋白酶K等(American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324)。这引起磷酸钙的降解、酸性蛋白酶的激活和骨基质蛋白的降解，从而造成骨吸收。
已经发现破骨细胞前体细胞通过用RANKL (NF-κB配体的受体激活剂)刺激而分化成为破骨细胞，所述RANKL在存在于骨表面的成骨细胞/基质细胞的细胞膜上表达(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (美国国家科学院院刊), (1998) 95, 第3597-3602页; Cell, (1998) 93, 第165-176页)。已经揭示RANKL是由成骨细胞/基质细胞产生的膜蛋白。其表达受骨吸收因子调控，RANKL诱导破骨细胞前体细胞分化为多核的破骨细胞等(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (美国国家科学院院刊), (1998) 95, 第3597-3602页; Journal of Bone and Mineral Research (骨与矿物质研究杂志), (1998) 23, S222)。此外，已经发现无RANKL的基因敲除小鼠出现骨硬化症样疾病，因此，已经证实RANKL为生理学上的破骨细胞分化诱导因子(Nature, (1999) 397, 第315-323页)。
作为用于治疗骨代谢疾病或缩短治疗持续时间的药物，二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂例如***、SERM (选择性***受体调节剂)、依普黄酮(ipriflavone)、维生素K2(四烯甲萘醌)、PTH (甲状旁腺素)制剂、钙制剂等被使用。然而，这些药物并不总是呈现令人满意的治疗效果，需要开发具有更有效的治疗效果的药剂。
免疫细胞的细胞膜被多种聚糖(例如唾液酸，其被多种聚糖结合蛋白识别)的致密包被物覆盖。唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素(后文称为“涎免凝集素(siglec)”)为识别唾液酸化的聚糖并与其结合的I型膜蛋白家族。许多涎免凝集素在免疫细胞的细胞膜上表达，识别同样存在于免疫细胞的细胞膜上的唾液酸，并调节细胞相互作用或细胞功能，且被认为参与免疫反应(Nature Reviews Immunology, (2007) 7, 第255-266页)。然而，还有大量生理功能尚未阐明的涎免凝集素分子。涎免凝集素-15 (唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素15)为新近报道属于涎免凝集素的分子(Glycobiology, (2007) 17, 第838-846页)，并且与被称为“CD33抗原样3”、“CD33分子样3”、“CD33样3”或“CD33L3”的分子相同。从鱼到人该分子在进化上高度保守，并且已经发现其在人脾和***的树突细胞和/或巨噬细胞中强烈表达。此外，作为使用唾液酸探针的结合试验的结果，还已经发现人涎免凝集素-15与Neu5Acα2-6GalNAc结合，并且除Neu5Acα2-6GalNAc外小鼠涎免凝集素-15还与Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc结合(Glycobiology, (2007) 17, 第838-846页)。直到最近，涎免凝集素-15的生理作用还未揭示，然而，已经报道涎免凝集素-15的表达随着破骨细胞的分化和成熟而增加，并且破骨细胞的分化被通过RNA干扰造成的涎免凝集素-15的表达减少抑制(WO 2007/093042)。还已经报道涎免凝集素-15基因在巨细胞瘤中特异性表达，并且还已经发现当单核细胞衍生的细胞系分化为破骨细胞时涎免凝集素-15基因的表达水平上升(WO2009/048072)。已经公开了可抑制破骨细胞的分化的兔多克隆和大鼠单克隆抗小鼠涎免凝集素-15抗体(WO2009/048072)。可抑制破骨细胞分化的抗涎免凝集素-15的嵌合单克隆抗体也已经公开(US2010/0104575)。然而可给予人的人抗体尚未公开。
[本发明公开内容]
[本发明要解决的问题]
本发明的目的为提供抑制破骨细胞分化和成熟及其活性的物质，以及用于异常骨代谢的治疗和/或预防剂。
[用于解决该问题的方法]
本发明人进行研究以阐明破骨细胞分化、成熟和激活的机制，以便发现对异常骨代谢具有治疗和/或预防效果的物质。结果，他们发现涎免凝集素-15基因的表达随着破骨细胞的分化和成熟而增加，还发现破骨细胞分化被特异性结合涎免凝集素-15的抗体抑制，因此，本发明已经完成。在某些情况下，本发明抗体具有比本领域已知抗体更高的抗破骨细胞效价。
即，本发明包括下列方面。
根据本发明第一方面，提供能够结合涎免凝集素-15的抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞的骨吸收的分离抗体，或其功能片段，包含：(a) 包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链，所述CDRH1包含与SEQ ID NO: 71具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH2包含与SEQ ID NO: 72具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含与SEQ ID NO: 35、45、55或65中的一个具有至少80%序列同一性的序列；和(b) 包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，所述CDRL1包含与SEQ ID NO: 73具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含与SEQ ID NO: 74具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含与SEQ ID NO: 40、50、60或70中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
根据本发明第二方面，提供能够结合涎免凝集素-15的抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞的骨吸收的分离抗体，或其功能片段，包含：(a) 包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链，所述CDRH1包含与SEQ ID NO: 106具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH2包含与SEQ ID NO: 107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含与SEQ ID NO: 55、35、45、65或80中的一个具有至少80%序列同一性的序列；和(b) 包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，所述CDRL1包含与SEQ ID NO: 73或83具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含与SEQ ID NO: 108具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含与SEQ ID NO: 60、40、50、70、90、100或109中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
优选CDRH3包含与SEQ ID NO: 35具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含与SEQ ID NO: 40具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH3包含与SEQ ID NO: 45具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含与SEQ ID NO: 50具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH3包含与SEQ ID NO: 55具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含与SEQ ID NO: 60具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH3包含与SEQ ID NO: 65具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含与SEQ ID NO: 70具有至少80%序列同一性的序列。或者，CDRH3包含与SEQ ID NO: 80具有至少80%序列同一性的序列并且CDRL3包含与SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性，优选与SEQ ID NO: 90或100中的任一个具有至少80%序列同一性的序列。
方便地，CDRH1包含与SEQ ID NO: 33、43、53、63或78中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
优选地，CDRH2包含与SEQ ID NO: 34、44、54、64、79、94或104中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
有利地，CDRL1包含与SEQ ID NO: 38、48、58、68或88中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
方便地，CDRL2包含与SEQ ID NO: 39、49、59、69或89中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
优选地，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDHL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 33、34、35、38、39和40具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 43、44、45、48、49和50具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 53、54、55、58、59和60具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 63、64、65、68、69和70具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 78、79、80、88、89和90具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 93、94、95、98、99和100具有至少80%序列同一性的序列。
或者，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别包含与SEQ. ID NO: 103、104、105、88、89和90具有至少80%序列同一性的序列。
特别优选的是，抗体或功能片段包含与上述序列具有至少90%或95%序列同一性的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3序列。
优选地，抗体包含：
选自以下的重链可变区：
a1) 包含SEQ ID NO: 32的氨基酸残基20-136、SEQ ID NO: 42的氨基酸残基20-135、SEQ ID NO: 52的氨基酸残基20-137、SEQ ID NO: 62的氨基酸残基20-136、SEQ ID NO: 77的氨基酸残基20-138、SEQ ID NO: 92的氨基酸残基20-138或SEQ ID NO: 102的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a2) 与a1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
a3) 与a1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
a4) 在a1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
选自以下的轻链可变区：
b1) 包含SEQ ID NO: 37的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 47的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 57的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 67的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 87的氨基酸残基20-134或SEQ ID NO: 97的氨基酸残基20-133的氨基酸序列；
b2) 与b1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
b3) 与b1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
b4) 在b1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
特别优选的是，重链和轻链可变区与上述序列具有至少99%的序列同一性。
有利地，抗体包含：
选自以下的重链：
a1) 包含SEQ ID NO: 32、42、52、62、77、92或102中的一个的序列的氨基酸序列；
a2) 与a1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
a3) 与a1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
a4) 在a1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
选自以下的轻链：
b1) 包含SEQ ID NO: 37、47、57、67、87或97中的一个的序列的氨基酸序列；
b2) 与b1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
b3) 与b1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
b4) 在b1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
特别优选的是，重链和轻链与上述序列具有至少99%的序列同一性。
方便地，抗体包括由包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 62的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列组成的轻链。
或者，抗体包括由包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列组成的轻链。
方便地，本发明抗体的功能片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
优选地，抗体为scFv。
根据本发明第三方面，提供用于治疗和/或预防异常骨代谢的本发明第一或第二方面的分离抗体或其功能片段。
根据本发明第四方面，提供本发明第一或第二方面的分离抗体或其功能片段用于制造用于治疗或预防异常骨代谢的药物的用途。
根据本发明第五方面，提供治疗罹患异常骨代谢的患者的方法，其包括给予在治疗上有效量的本发明第一或第二方面的分离抗体或其功能片段。
根据本发明第六方面，提供包含至少一种本发明第一或第二方面的抗体或其功能片段的药物组合物。
方便地，药物组合物为用于异常骨代谢的治疗和/或预防剂。
根据本发明第七方面，提供用于治疗和/或预防异常骨代谢的药物组合物，其特征在于包含至少一种本发明第一或第二方面的抗体或抗体功能片段，和至少一种选自以下的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂例如***、SERM (选择性***受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺素)制剂、非甾体抗炎剂s、可溶性TNF受体制剂、抗TNF-α抗体或该抗体的功能片段、抗PTHrP (甲状旁腺素相关蛋白)抗体或该抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或该抗体的功能片段、抗RANKL抗体或该抗体的功能片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))。
优选地，异常骨代谢选自：骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌症骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、牙周炎引起的牙丧失、假关节周围的骨质溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)、肾性骨营养不良和成骨不全症。
有利地，异常骨代谢为骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏或伴随癌症骨转移的骨破坏。
方便地，骨质疏松症为绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、使用治疗剂例如类固醇或免疫抑制剂导致的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
根据本发明第八方面，提供多核苷酸，其包含：
a) 编码本发明第一或第二方面的抗体或其功能片段中的一种的核苷酸序列；或
b) 与由与a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列。
方便地，编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的核苷酸序列包含：
a) 分别为SEQ ID NO: 31的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 31的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 31的核苷酸352-375、SEQ ID NO: 36的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 36的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 36的核苷酸319-348；
b) 分别为SEQ ID NO: 41的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 41的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 41的核苷酸352-372、SEQ ID NO: 46的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 46的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 46的核苷酸319-348；
c) 分别为SEQ ID NO: 51的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 51的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 51的核苷酸352-378、SEQ ID NO: 56的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 56的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 56的核苷酸319-348；
d) 分别为SEQ ID NO: 61的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 61的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 61的核苷酸352-375、SEQ ID NO: 66的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 66的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 66的核苷酸319-348；
e) 分别为SEQ ID NO: 76的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 76的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 76的核苷酸352-381、SEQ ID NO: 86的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 86的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 86的核苷酸328-363；
f) 分别为SEQ ID NO: 91的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 91的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 91的核苷酸352-381、SEQ ID NO: 96的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 96的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 96的核苷酸328-360；或
g) 分别为SEQ ID NO: 101的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 101的核苷酸205-261、SEQ ID NO: 101的核苷酸358-387、SEQ ID NO: 86的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 86的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 86的核苷酸328-363。
优选地，多核苷酸包含：
选自以下的编码重链可变区的核苷酸序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 31的核苷酸58-408、SEQ ID NO: 41的核苷酸58-405、SEQ ID NO: 51的核苷酸58-411、SEQ ID NO: 61的核苷酸58-408、SEQ ID NO: 76的核苷酸58-414、SEQ ID NO: 91的核苷酸58-414或SEQ ID NO: 101的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2) 与由与a1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a3) 在a1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和
选自以下的编码轻链可变区的核苷酸序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 36的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 46的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 56的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 66的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 86的核苷酸58-402或SEQ ID NO: 96的核苷酸58-399的核苷酸序列；
b2) 与由与b1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3) 在b1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列。
有利地，多核苷酸包含：
选自以下的编码重链的核苷酸序列：
a1) 核苷酸序列：SEQ ID NO: 31、41、51、61、76、91或101中的一个的序列；
a2) 与由与a1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a3) 在a1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和
选自以下的编码轻链的核苷酸序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 36、46、56、66、86或96中的一个的序列的核苷酸序列；
b2) 与由与b1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3) 在b1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或添加的核苷酸序列。
根据本发明第九方面，提供包含至少一种本发明第八方面的多核苷酸的载体。
根据本发明第十方面，提供包含至少一种本发明第八方面的多核苷酸的转化细胞。
根据本发明第十一方面，提供包含至少一种本发明第九方面的载体的转化细胞。
根据本发明第十二方面，提供生产本发明第一或第二方面的抗体的方法，其包括培养本发明第十或第十一方面的转化细胞、收集培养物(culturing materials)和从所述培养物中纯化所述抗体的步骤。
在本说明书中，两序列之间的百分数“同一性”采用BLASTP算法2.2.2版 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller和David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs (空位BLAST和PSI-BLAST：新一代的蛋白数据库搜索程序)", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)使用默认参数确定。具体而言，可在因特网上使用URL www.ncbi.nlm.nih.gov/blast进入BLAST算法。
[本发明的优势]
根据本发明，可获得用于异常骨代谢的治疗和/或预防剂，其作用机制为抑制破骨细胞的分化和成熟及其活性。
[附图简述]
图1为显示测量抗体MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR09012、MOR08656、MOR08662和人IgG (阴性对照)与人涎免凝集素-15-Fc、小鼠涎免凝集素-15-Fc和人Fc结合的ELISA测定结果的图示。
图2为显示在抗体MOR09281存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图3为显示在抗体MOR09012 (MOR09892的亲本抗体)存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图4为显示在抗体MOR09892存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图5为显示在抗体MOR08656 (MOR09898的亲本抗体)存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图6为显示在抗体MOR08662 (MOR10110的亲本抗体)存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图7为显示在抗体MOR09898存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图8为显示在抗体MOR10110存在时形成的小鼠破骨细胞的TRAP活性的图示。
图9为显示从板(plate)释放胶原片段(其被在抗体MOR09281存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图10为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR08656 (MOR09898的亲本抗体)存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图11为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR09898存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图12为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR09012 (MOR09892的亲本抗体)和MOR09892存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图13为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR08662 (MOR10110的亲本抗体)和MOR10110存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图14为编码抗体MOR08656的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 1)。
图15为抗体MOR08656的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
图16为编码抗体MOR08656的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 6)。
图17为抗体MOR08656的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)。
图18为编码抗体MOR08662的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 11)。
图19为抗体MOR08662的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。
图20为编码抗体MOR08662的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 16)。
图21为抗体MOR08662的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)。
图22为编码抗体MOR09012的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 21)。
图23为抗体MOR09012的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)。
图24为编码抗体MOR09012的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 26)。
图25为抗体MOR09012的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27)。
图26为编码抗体MOR09281的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 31)。
图27为抗体MOR09281的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)。
图28为编码抗体MOR09281的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 36)。
图29为抗体MOR09281的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 37)。
图30为编码抗体MOR09892的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 41)。
图31为抗体MOR09892的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)。
图32为编码抗体MOR09892的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 46)。
图33为抗体MOR09892的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 47)。
图34为编码抗体MOR09898的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 51)。
图35为抗体MOR09898的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。
图36为编码抗体MOR09898的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 56)。
图37为抗体MOR09898的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 57)。
图38为编码抗体MOR10110的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 61)。
图39为抗体MOR10110的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 62)。
图40为编码抗体MOR10110的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 66)。
图41为抗体MOR10110的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 67)。
图42为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR09268存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图43为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR12574存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图44为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR13154存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图45为显示从板释放胶原片段(其被在抗体MOR13156存在时培养的人破骨细胞前体细胞降解)的图示。
图46为编码抗体MOR09268和MOR12574的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 76)。
图47为抗体MOR09268和MOR12574的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 77)。
图48为编码抗体MOR09268的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 81)。
图49为抗体MOR09268的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 82)。
图50为编码抗体MOR12574和MOR13156的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 86)。
图51为抗体MOR12574和MOR13156的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)。
图52为编码抗体MOR13154的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 91)。
图53为抗体MOR13154的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 92)。
图54为编码抗体MOR13154的轻链的DNA序列(SEQ ID NO: 96)。
图55为抗体MOR13154的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 97)。
图56为编码抗体MOR13156的重链的DNA序列(SEQ ID NO: 101)。
图57为抗体MOR13156的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 102)。
[用于实施本发明的最佳方式]
本文使用的术语“基因”不仅包括DNA，还包括mRNA、cDNA和cRNA。
本文使用的术语“多核苷酸”以与核酸相同的含义使用，并且亦包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
本文使用的术语“多肽”和“蛋白”无区别使用。
本文使用的术语“RNA级分”指包含RNA的级分。
本文使用的术语“细胞”亦包括动物个体中的细胞和培养的细胞。
本文使用的术语“涎免凝集素-15”以与涎免凝集素-15蛋白相同的含义使用。
本文使用的术语“破骨细胞形成”以与“破骨细胞分化”或“破骨细胞成熟”相同的含义使用。
本文使用的术语“抗体的功能片段”指具有抗原结合活性的部分抗体片段，并且包括Fab、F(ab’)2、scFv等。该术语还包括Fab’，其为通过在还原条件下处理F(ab’)2获得的抗体可变区的单价片段。然而，该术语不限于这些分子，只要该片段具有针对抗原的结合亲和力即可。另外，这些功能片段不仅包括通过用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子获得的片段，还包括在适当的宿主细胞中使用遗传修饰的抗体基因生产的蛋白。
已经知道抗体的重链或轻链具有三个互补决定区(CDR)。互补决定区也称为高变结构域，这些区域在重链或轻链可变区的一级结构中为高变的。这些高变结构域在抗体的重链或轻链多肽中作为三个散开的部分存在。在本说明书中，按照从重链多肽的氨基末端(N-末端)开始的顺序，重链的CDR被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。按照从轻链多肽的氨基末端开始的顺序，轻链的CDR被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。在抗体的三级结构中这6个CDR紧密相邻并且决定与抗原的结合特异性。
本文使用的短语“在严格条件下进行杂交”指杂交在以下条件下或在与其相当的条件下进行：在这样的条件下，可通过使用DNA固定于其上的滤膜(filter)在市购的杂交溶液例如ExpressHyb杂交溶液(Clontech, Inc.生产)中于68℃进行杂交或在0.7-1.0 M NaCl存在时于68℃进行杂交，接着使用0.1-2 x SSC溶液(1 x SSC由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成)在68℃进行洗涤而实现鉴定。
当涉及关于涎免凝集素-15的抗体而使用术语“能够结合”时，其意指抗体在生理条件下能够优先结合涎免凝集素15。在一些实施方案中，其与术语“对……特异”同义。因此在一些实施方案中，抗体对涎免凝集素-15具有比对其它相关多肽更大的亲和力，例如1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍的更大的亲和力。
本文使用的术语“数个”在一些实施方案中意指2-4的数值。
1. 涎免凝集素-15
若涎免凝集素-15作为免疫原使用，可从人、非人哺乳动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛或猴)或鸡的单核细胞或骨髓细胞直接纯化和使用，或可制备并且可使用上述细胞的细胞膜级分。此外，涎免凝集素-15可通过其体外合成获得或通过其经由基因工程在宿主细胞中的生产获得。在这样的基因工程中，更具体地，将涎免凝集素-15 cDNA整合到能够表达涎免凝集素-15 cDNA的载体中，并且在包含酶、底物以及转录和翻译所需的能量物质的溶液中合成涎免凝集素-15，或转化另一种原核或真核宿主细胞以表达涎免凝集素-15，借此获得蛋白。
人涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已经以登记号NM_213602在GenBank中登记。小鼠涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已经以登记号XM_884636在GenBank中登记。
2. 抗涎免凝集素-15抗体
抗体的一般结构在本领域为已知的，在此处将仅简要概述。免疫球蛋白单体包括通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。每条重链与一条轻链配对，其通过二硫键直接与该轻链键合。每条重链包括恒定区(取决于抗体的同种型而不同)和可变区。可变区包含三个高变区(或互补决定区)，其被命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且被支撑在框架区内。每条轻链包括恒定区和可变区，其中可变区包含被框架区以与重链可变区类似的方式支撑的三个高变区(命名为CDRL1、CDRL2和CDRL3)。
每对重链和轻链的高变区互相协作以提供能够结合靶抗原的抗原结合位点。一对重链和轻链的结合特异性由重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列确定。因此一旦确定产生特定的结合特异性的一组CDR序列(即，重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列)，原则上可将该组CDR序列***到与任何抗体恒定区连接的任何其它抗体构架区内的适当位点，以提供具有相同抗原结合特异性的不同抗体。
在优选实施方案中，提供抗体MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR12574、MOR13154和MOR13156，其氨基酸序列的详情在表4-7和10-12中阐述。然而，本发明不限于这些优选抗体。
一般而言，在本发明抗涎免凝集素-15抗体中，重链和轻链的CDR1和CDR2序列与SEQ ID NO: 71-74中所示共有序列一致。或者，重链的CDR1和CDR2序列的序列可与SEQ ID NO: 106和107中所示共有序列一致；轻链的CDR2序列的序列可与SEQ ID NO: 108一致且轻链的CDR1序列的序列可与SEQ ID NO: 73或83一致。
轻链的CDR3序列的序列可与SEQ ID NO: 109中所示共有序列一致。特别优选地是，抗体具有与SEQ ID NO: 109的共有序列一致的轻链CDR3序列并且重链的CDR3序列具有SEQ ID NO: 80的序列。
来自本发明一些优选抗体(MOR09281、MOR09892、MOR09898和MOR10110)的具体CDR1、CDR2和CDR3序列在表8中示出。来自本发明其它优选抗体(MOR12574、MOR13154和MOR13156)的具体CDR1、CDR2和CDR3序列在表13中示出。因此提供包含具有来自这些优选抗体的序列的CDR1-3的抗体。然而，由于本发明优选抗体序列之间有高水平的序列同一性，提供具有来自不同优选抗体的CDR序列的抗体也在本发明范围内。例如，可提供抗体，其包含具有MOR09281的CDR1、MOR09892的CDR2和MOR09898的CDR3序列的重链和具有MOR10110的CDR1、MOR09281的CDR2和MOR09892的CDR3序列的轻链。
还应理解的是，在本发明一些实施方案中，CDR1-3的氨基酸序列与表8和13中提供的那些序列不同，但仍保留与其至少80% (或，在一些实施方案中，至少90%或95%)的序列同一性。在一些实施方案中，一种抗体的CDR中一个位点的氨基酸残基与另一抗体的相同CDR中的相应位点的氨基酸残基交换。例如，可提供包含这样的重链的抗体：其中CDR1序列包含氨基酸序列NYAMS (SEQ ID NO. 75)，即MOR09281的重链的CDR1序列，其第3位的氨基酸被MOR09892的重链的CDR1的第3位氨基酸取代。在其它实施方案中，CDR中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。在同一家族氨基酸内的取代的意义上，取代可为“保守的”。天然存在的氨基酸可被分为下列四个家族，保守取代将在这些家族内发生。
1) 具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
2) 具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸。
3) 具有不带电的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。
4) 具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
在又另外的实施方案中，一个或多个氨基酸残基被添加到抗体的一个或多个CDR中或从一个或多个CDR中缺失。这样的添加或缺失在CDR的N或C末端或在CDR内的位点发生。
通过氨基酸的添加、缺失或取代来改变抗体CDR的氨基酸序列，可获得不同的效果，例如增加对靶抗原的结合亲和力或减少聚集。
应理解的是，包含这样变化的CDR序列的本发明抗体仍结合涎免凝集素-15并抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞骨吸收。这可通过本文实施例5和6公开的结合测定和生物学活性测定来测试。
抗体的恒定区也可与针对抗体MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR12574、MOR13154和MOR13156所明确公开的那些恒定区不同。例如，可提供具有任何同种型(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的Fc区域的抗体。
优选地是，抗体为人抗体。
抗体、其制造和用途是众所周知的，并公开于例如Harlow, E.和Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual ( 抗体：实验室手册 ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999。
可使用本领域已知的标准方法产生抗体。抗体的实例包括(但不限于)单克隆抗体、单链抗体和抗体的功能片段。
抗体的“功能片段”包括能够结合靶抗原的任何抗体片段，因此包括Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段和Fv片段。
抗体可在一系列宿主，例如山羊、兔子、大鼠、小鼠、人等中生产。可通过注射具有免疫原性的靶抗原(在本发明中为涎免凝集素-15)或其片段或寡肽对其进行免疫。根据宿主种类，可使用不同的佐剂增强免疫反应。这样的佐剂包括，但不限于，弗氏佐剂(Freund's)、矿物凝胶例如氢氧化铝、和表面活性物质例如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔 血蓝蛋白和二硝基苯酚。在用于人的佐剂中，BCG (卡介苗(Bacille Calmette-Guerin))和短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)为特别有用的。
抗涎免凝集素-15的单克隆抗体可使用提供抗体分子生产(通过培养的连续细胞系)的任何技术制备。这些包括，但不限于，杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(Koehler等，1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor等, 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote等, 1983, PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole等, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ( 单克隆抗体与癌症治疗 ), Alan R. Liss Inc., New York, 第77-96页)。
或者，可使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体(ScFv)包括由连接肽(通常约5-25个氨基酸长)连接的重链可变区和轻链可变区。scFv可使用重组技术，例如通过在宿主生物例如大肠杆菌(E.coli)中表达编码scFv的载体合成。
抗体还可通过在淋巴细胞群体中体内诱导生产或通过筛选重组免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂组而生产(Orlandi等, 1989, PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter, G.等, 1991, Nature, 349: 293-299)。
还可产生抗原结合片段，例如可通过胃蛋白酶消化抗体分子生产的F(ab')2片段和可通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库以允许快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse等, 1989, Science, 256: 1275-1281)。
多种免疫测定可用于筛查以鉴定具有所需特异性的抗体。用于使用具有确定的特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争结合或免疫放射测定的很多实验方案为本领域所熟知。这样的免疫测定通常涉及测量涎免凝集素-15或其任何片段或寡肽与其特异性抗体之间的复合体形成。可使用利用对两个互不干扰的涎免凝集素-15表位特异的单克隆抗体的双位点的、基于单克隆的免疫测定，但亦可使用竞争结合测定(Maddox等, 1983, J. Exp. Med., 158: 1211-1216)。
3. 包含抗涎免凝集素-15抗体的药物
上述条目“2. 抗涎免凝集素-15抗体”中所述的抗涎免凝集素-15抗体中和涎免凝集素-15的生物学活性。所述中和涎免凝集素-15的生物学活性的抗体抑制体内涎免凝集素-15的生物学活性(即，破骨细胞的分化和/或成熟)，因此可用作由破骨细胞异常分化和/或成熟导致的异常骨代谢的治疗和/或预防剂。异常骨代谢可为以净骨丢失(骨质减少或骨质溶解)为特征的任何病症。一般而言，抗涎免凝集素-15抗体的治疗和/或预防作用在需要抑制骨吸收的情况下应用。可用抗涎免凝集素-15抗体治疗和/或预防的异常骨代谢的实例包括骨质疏松症(绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由于使用治疗剂例如类固醇或免疫抑制剂而引起的继发性骨质疏松症或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症)、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌症骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、牙周炎引起的牙丧失、假关节周围的骨质溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、佩吉特氏骨病、肾性骨营养不良和成骨不全症。然而，异常骨代谢不限于这些实例，只要其为伴随由破骨细胞导致的净骨丢失的疾病即可。
抗涎免凝集素-15抗体中和涎免凝集素-15生物学活性的体外活性可通过例如抑制过表达涎免凝集素-15的细胞分化为破骨细胞的活性来测定。例如，将不同浓度的抗涎免凝集素-15抗体加入小鼠单核细胞衍生细胞系RAW 264.7细胞或Raw 264细胞，可测定通过用RANKL或TNF-α刺激而抑制分化为破骨细胞的活性。在另一实施例中，将不同浓度的抗涎免凝集素-15抗体加入骨髓来源的原代培养细胞中，可测定通过用RANKL、TNF-α或活性维生素D3刺激而抑制分化为破骨细胞的活性。在另一实施例中，将不同浓度的抗涎免凝集素-15抗体加入正常的人破骨细胞前体细胞(正常的人天然破骨细胞前体细胞，可自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110获得)，可测定通过用RANKL或M-CSF刺激而抑制分化为破骨细胞的活性。对破骨细胞分化的此种抑制作用可通过使用破骨细胞的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性的抑制作为指标进行测定。在另一实施例中，对破骨细胞分化的抑制作用还可通过使用对TRAP阳性多核破骨细胞形成的抑制即对破骨细胞的细胞融合的抑制作为指标进行测定。在另一实施例中，在使用股骨和/或胫骨来源的细胞的坑测定(pit assay)实验中(Takada等, Bone and Mineral (骨和矿物质), (1992) 17, 347-359)，抑制破骨细胞骨吸收的体外活性可通过将不同浓度的抗涎免凝集素-15抗体加入股骨和/或胫骨来源的细胞中并观察牙质片(dentine slice)上的坑形成来测定。作为用于测定抑制破骨细胞骨吸收的体外活性的***，还可使用用缀合铕的人胶原包被的板。抗涎免凝集素-15抗体对实验动物中异常骨代谢的体内治疗或预防作用可通过给予骨质疏松症模型动物或过表达涎免凝集素-15的转基因动物抗涎免凝集素-15抗体并测量破骨细胞的变化来确认。
上述中和涎免凝集素-15生物学活性的抗体可用作药物，特别是用作用于治疗或预防异常骨代谢例如骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏或伴随癌症骨转移的骨破坏的药物组合物，或用作用于这类疾病的免疫诊断的抗体。
在类风湿性关节炎(RA)的治疗中，主要问题为伴随该疾病发生的骨丢失。已经报道在这样的伴随RA的骨丢失中，破骨细胞发挥主要作用。认为在RA中对破骨细胞诱导(分化和成熟)和激活以及导致骨破坏最重要的细胞因子为RANKL和TNF-α (Romas E.等, Bone 30, 第340-346页, 2002)。RANKL的诱饵受体(decoy receptor) OCIF/OPG可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成但不抑制TNF-α诱导的破骨细胞形成。另一方面，本发明的抗涎免凝集素-15抗体有效抑制由RANKL和TNF-α诱导的破骨细胞形成。因此，预期本发明的抗涎免凝集素-15抗体可比RANKL阻滞物(OCIF/OPG、抗RANKL抗体等)更有力地抑制在RA等中由TNF-α诱导的骨丢失和骨破坏。
作为一个实施例，对于异常骨代谢的治疗或预防，抗涎免凝集素-15抗体单独给予或与至少一种其它用于骨相关疾病的治疗剂一起给予。作为另一个实施例，抗涎免凝集素-15抗体可与在治疗上有效量的用于异常骨代谢的治疗剂一起给予。抗涎免凝集素-15抗体和治疗剂可同时、分别或序贯给予。可与抗涎免凝集素-15抗体一起给予的治疗剂的实例包括，但不限于，二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂例如***、SERM (选择性***受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺素)制剂、非甾体抗炎剂、可溶性TNF受体制剂、抗TNF-α抗体或该抗体的功能片段、抗PTHrP (甲状旁腺素相关蛋白)抗体或该抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或该抗体的功能片段、抗RANKL抗体或该抗体的功能片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。在另一个实施例中，治疗剂为另一种不同的本发明的抗涎免凝集素-15抗体。也就是说，给予两种不同的本发明的抗涎免凝集素-15抗体。根据异常骨代谢的状态或预期的治疗和/或预防程度，可给予两种或三种或更多类型的治疗剂，并且这些治疗剂可通过将其封装入同一制剂中一起提供。这些治疗剂和抗涎免凝集素-15抗体可通过将其封装入同一制剂中一起提供。此外，这些治疗剂可通过将其封装为用于治疗和/或预防的药盒一起提供。此外，这些治疗剂和抗涎免凝集素-15抗体可分别提供。在基因治疗中给药的情况下，用于骨疾病的蛋白质性治疗剂的基因和抗涎免凝集素-15抗体的基因可***同一启动子区域或不同启动子区域的下游，且可引入同一载体或不同载体中。
通过将用于骨疾病的治疗剂与抗涎免凝集素-15抗体或其片段缀合，可生产如M. C. Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress (靶向药物缀合物：原理和进展)”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216中所述的靶向药物缀合物。为达到该目的，除抗体分子外，可应用任何抗体片段，只要其未完全丧失识别破骨细胞的能力即可，其实例包括片段例如Fab、F(ab’)2和Fv。在本发明中，抗体和片段可以以相同的方式使用。抗涎免凝集素-15抗体或其片段与用于骨疾病的治疗剂形成的缀合物可为以下文献中所述多种形式中的任何一种：M. C. Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress (靶向药物缀合物：原理和进展)”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson “Bioconjugate Techniques (生物缀合技术)” Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具抗癌活性的多聚体缀合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123等。即，可例示其中抗涎免凝集素-15抗体与用于骨疾病的治疗剂直接或通过间隔子(spacer)例如寡肽而彼此化学缀合的缀合物形式和通过适当的药物载体形成的缀合物。药物载体的实例包括脂质体和水溶性多聚体。通过这样的药物载体形成的缀合物的更具体的实例包括其中抗体与用于骨疾病的治疗剂掺入到脂质体中且脂质体与抗体彼此缀合的缀合物形式，和其中用于骨疾病的治疗剂与水溶性多聚体(具有约1000-100000的分子量的化合物)直接或通过间隔子例如寡肽而化学缀合且抗体与水溶性多聚体缀合的缀合物形式。抗体(或其片段)与用于骨疾病的治疗剂或药物载体例如脂质体或水溶性多聚体的缀合可通过本领域技术人员已知的方法例如G. T. Hermanson “Bioconjugate Techniques (生物缀合技术)” Academic Press, California (1996), Putnam和J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具抗癌活性的多聚体缀合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123中所述的方法实现。用于骨疾病的治疗剂掺入到脂质体中可通过本领域技术人员已知的方法例如D. D. Lasic “Liposomes: From Physics to Applications (脂质体：从物理学到应用)” Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993)等中所述的方法实现。用于骨疾病的治疗剂与水溶性多聚体相缀合可通过本领域技术人员已知的方法例如D. Putnam和J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具抗癌活性的多聚体缀合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123中所述的方法实现。除上述方法外，抗体(或其片段)与用于骨疾病的蛋白质性治疗剂(或其片段)的缀合物可用本领域技术人员已知的方法通过基因工程生产。
本发明还提供包含在治疗上和/或在预防上有效量的抗涎免凝集素-15抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含在治疗上和/或在预防上有效量的抗涎免凝集素-15抗体、至少一种在治疗上和/或在预防上有效量的用于骨疾病的治疗剂和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。用于骨疾病的治疗剂的实例包括，但不限于，二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂例如***、SERM (选择性***受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺素)制剂、非甾体抗炎剂、可溶性TNF受体制剂、抗TNF-α抗体或该抗体的功能片段、抗PTHrP (甲状旁腺素相关蛋白)抗体或该抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或该抗体的功能片段、抗RANKL抗体或该抗体的功能片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。在另一个实施例中，治疗剂为另一种不同的本发明的抗涎免凝集素-15抗体。即药物组合物包含两种不同的本发明的抗涎免凝集素-15抗体。
就剂量和浓度而言，本发明药物组合物可接受的制剂中使用的物质优选对给予该药物组合物的人是无毒的。
本发明药物组合物可包含用于药学用途的能够改变或维持药物组合物或其组分的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、颜色、无菌条件、稳定性、溶解度、释放速率、吸收速率或通透性的物质。用于药学用途的物质的实例包括，但不限于：氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂例如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲液、碳酸氢盐和Tris-HCl溶液；填充剂例如甘露醇和甘氨酸；螯合剂例如乙二胺四乙酸盐(EDTA)；络合剂例如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；膨胀剂(expander)例如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物例如单糖和二糖；着色剂；调味剂；稀释剂；乳化剂；亲水多聚体例如聚乙烯基吡咯烷；防腐剂例如低分子量多肽、形成碱的反荷离子(base forming counter ion)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸盐、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸和过氧化氢；溶剂例如甘油、丙二醇、聚乙二醇；糖醇例如甘露醇和山梨醇；悬浮剂；表面活性剂例如脱水山梨醇酯、聚山梨酯包括聚山梨酯20和聚山梨酯80、Triton、氨基丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂例如蔗糖和山梨醇；弹性增强剂例如氯化钠、氯化钾和甘露醇和山梨醇；运输剂(transport agent)；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂。用于药学用途的这些物质的添加量优选为抗涎免凝集素-15抗体重量的0.01-100倍，特别优选0.1-10倍。本领域技术人员可根据应用的疾病、应用的给予途径等适当确定制剂中药物组合物的优选剂型。
药物组合物中的赋形剂或载体可为液体或固体形式。适当的赋形剂或载体可为注射用水、生理盐水、人造脑脊液或其它通常用于胃肠外给予的物质。另外，中性生理盐水或包含血清白蛋白的生理盐水也可用作载体。药物组合物可包含pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或pH 4.0-5.5的醋酸盐缓冲液(可添加山梨醇或其他化合物)。本发明的药物组合物的实例包括包含抗涎免凝集素-15抗体的药物组合物和包含抗涎免凝集素-15抗体和至少一种用于骨疾病的治疗剂的药物组合物。本发明药物组合物以冻干产品或液体的形式制备为具有所选组成和所需纯度的药剂。还可使用适当的赋形剂例如蔗糖使包含抗涎免凝集素-15抗体的药物组合物和包含抗涎免凝集素-15和至少一种用于异常骨代谢的治疗剂的药物组合物形成冻干产品。
本发明的药物组合物可制备为用于胃肠外给予或用于通过口服给予胃肠吸收。可根据给予方法确定制剂的组成和浓度。至这样的程度：本发明的药物组合物所包含的抗涎免凝集素-15抗体对涎免凝集素-15的亲和力较高，即，由于对涎免凝集素-15的解离常数(Kd值)较低，抗涎免凝集素-15抗体可在较低剂量显示其对人的药物功效，因此，也可基于该结果确定本发明的药物组合物用于人的剂量。对于剂量，在将人抗涎免凝集素-15抗体给予人的情况下，该抗体可以以每1-180天一次约0.1-100 mg/kg的剂量给予。
本发明的药物组合物的剂型的实例包括注射剂、浸剂、栓剂、透鼻剂、舌下剂和经皮吸收剂。
4. 本发明其它产品
还提供包含编码在上述条目“2. 抗涎免凝集素-15抗体”中所述的抗涎免凝集素-15抗体的序列的多核苷酸。编码优选抗体(MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR12574、MOR13154和MOR13156)的核苷酸序列的详情在表4-7和10-12中提供。然而，应理解的是本发明多核苷酸不限于表4-7和10-12中所示的多核苷酸。具体而言，如上述条目2中所说明的，本发明的抗涎免凝集素-15抗体包括包含来自不同优选抗体的CDR的抗体，且还包括包含含有一个或多个氨基酸添加、缺失或取代的CDR的抗体。本发明的多核苷酸包括编码这样的抗体的多核苷酸。此外，由于核酸密码的简并性，除表4-7和10-12所示的核苷酸序列外的核苷酸序列也编码相同的氨基酸序列。
还提供多核苷酸，其包含与由与编码上述条目2中所述抗体中的一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列。在这点上，短语“杂交在严格条件下进行”如上所定义。
多核苷酸可还包含其它核苷酸序列，例如启动子和/或其它表达调控序列、编码多腺苷酸化尾巴的序列、最小非翻译区域和Kozak共有序列。
在一些实施方案中，提供包含这样的多核苷酸的载体。示例性载体包括质粒、粘粒和病毒载体，包括噬菌体。除多核苷酸本身外，这些载体还可包含序列例如复制起点、遗传标记、抗生素抗性基因、cos位点、克隆位点和靶序列。在许多实施方案中，载体包含足够的元件以在宿主细胞中复制并在宿主细胞中表达编码抗涎免凝集素-15抗体的多核苷酸序列。
因此在另外的实施方案中，提供包含上述多核苷酸(例如掺入到细胞的基因组中)或包含上述载体的转化细胞。合适的宿主细胞包括细菌细胞例如大肠杆菌和真核细胞例如酵母细胞或人细胞系。这样的转化细胞可用于通过培养细胞、表达编码抗体的核苷酸序列然后从培养基中纯化抗体来合成本发明的涎免凝集素-15抗体。
[实施例]
后文中，将参考实施例更具体地描述本发明，然而，本发明并不限于此。注意在下列的实施例中关于基因操纵的各个操作按照"Molecular Cloning (分子克隆)" (Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T.著, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年出版)中所述的方法进行，或在使用可市售获得的试剂或试剂盒情况下，按照其中附带的方案进行。
实施例1
细胞培养和瞬时转染
人胚肾(HEK) 293FreeStyleTM细胞在Freestyle 293培养基(Invitrogen)中培养。对于细胞淘选，根据供应商的说明书使用293fectin (Invitrogen)用质粒DNA例如质粒pcDNA3.1 (+)/人涎免凝集素-15 (编码人涎免凝集素-15，登记号，Q6ZMC9)、质粒pcDNA3.1 (+)/小鼠涎免凝集素-15 (编码小鼠涎免凝集素-15，登记号，NP_001094508)或pcDNA3.1(+)转染HEK 293FreeStyleTM细胞。培养2天后收集转染的HEK 293FreeStyleTM细胞用于进一步的细胞淘选。
重组人涎免凝集素-15-Fc和小鼠涎免凝集素-15-Fc制剂
可溶性人涎免凝集素-15/phIgFc的表达载体通过Gateway技术(Invitrogen)构建。通过PCR扩增编码人涎免凝集素-15胞外结构域(登记号，Q6ZMC9，1-260)的DNA片段以将入门克隆(entry clone)构建到pDNOR221 (Invitrogen)中。然后，在该入门克隆与包含编码人Fc序列的目的载体之间进行LR反应。所构建的质粒中的人涎免凝集素-15-Fc的DNA序列通过DNA序列分析确认。人涎免凝集素-15-Fc在含有可溶性人涎免凝集素-15/phIgFc表达载体的HEK 293FreeStyleTM中瞬时表达。将表达可溶性人涎免凝集素-15-Fc的HEK 293FreeStyleTM细胞的1.5 L培养液通过Sterivex-GV滤器(Millipore)过滤，然后将滤液上样到预先用Dulbecco’s PBS (D-PBS, Invitrogen, Inc.生产)平衡好的HiTrap蛋白A柱(Amersham Biosciences)。用0.1 M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱人涎免凝集素-15-Fc并用1 M Tris中和。将2.5 ml等分部分的人涎免凝集素-15-Fc流分上样到预先用包含50 mM盐酸精氨酸的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0, A-PBS)平衡的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences)，接着用A-PBS洗脱，借此获得其溶剂被A-PBS替换的3.5 ml样品。通过上述程序制备的样品在-80℃冷藏保存直至使用。
可溶性小鼠涎免凝集素-15/phIgFc的表达载体通过Gateway技术(Invitrogen)构建。通过PCR扩增编码小鼠涎免凝集素-15胞外结构域(登记号，NP_001094508，1-258)的DNA片段以将入门克隆构建到pDNOR221 (Invitrogen)中。然后，在该入门克隆与包含编码人Fc序列的目的载体之间进行LR反应。在所构建的质粒中小鼠涎免凝集素-15-Fc的DNA序列通过DNA序列分析确认。小鼠涎免凝集素-15-Fc在含有可溶性小鼠涎免凝集素-15/phIgFc的表达载体的HEK 293FreeStyleTM中瞬时表达。将表达小鼠涎免凝集素-15-Fc的HEK 293FreeStyleTM细胞的1.8 L培养液通过Sterivex-GV滤器(Millipore)过滤，然后将滤液上样到预先用Dulbecco’s PBS (D-PBS，, Invitrogen)平衡的HiTrap蛋白A柱(Amersham Biosciences)。用0.1 M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱小鼠涎免凝集素-15-Fc并用1 M Tris中和。使用离心膜浓缩器Amicon Ultra-15 (Millipore)将收集的小鼠涎免凝集素-15-Fc流分浓缩至2.5 ml。用含有0.01% Tween-20的感染用Otsuka生理盐水(Otsuka Pharmaceutical)更换缓冲液。样品在-80℃冷藏保存直至使用。
抗体从HuCAL GOLD文库的产生
A. 噬菌体展示文库
对于抗人涎免凝集素-15的治疗性抗体的产生，用MorphoSys HuCAL GOLD噬菌体展示文库进行筛选。HuCAL GOLD®为基于HuCAL®概念的Fab文库(Knappik等 (J. Mol. Biol., 296, 57-86,. 2000); Krebs等, J. Immunol. Methods, 254, 67-84, 2001; Rothe等, J. Mol. Biol., 376(4):1182-200, 2008)，其中所有六个CDR为多样化的，且其使用CysDisplayTM技术将Fab片段与噬菌体表面连接(WO 01/05950)。
B.对HuCAL GOLD®的淘选
如下分离MOR09012、MOR08656和MOR08662。为了筛选，用转染质粒pcDNA3.1 (+)/人涎免凝集素-15或质粒pcDNA3.1 (+)/小鼠涎免凝集素-15的HEK 293FreeStyleTM细胞使用293 fectin (Invitrogen)对HuCAL GOLD®抗体文库进行全细胞淘选，随后进行pH洗脱和涎免凝集素-15阴性HEK 293FreeStyleTM细胞的吸附后步骤，以耗尽无关的抗体-噬菌体。最后，用剩余的抗体噬菌体感染大肠杆菌细胞，然后将该细胞平铺于琼脂板上并孵育过夜。第二天，将细菌克隆从平板刮下，拯救噬菌体并扩增。在96-孔Maxi-sorp板(Nunc, clear)上使用由山羊抗人Fc抗体捕获的重组人涎免凝集素-15-Fc (Jackson Immuno Research, cat. No. 109-005-098)对HuCAL GOLD®抗体文库进行捕获淘选。为了除去人Fc和山羊IgG结合剂，将人IgG(Jackson Immuno Research, cat No. 009-000-003)和山羊IgG(Jackson Immuno Research, cat No. 005-000-003)加入到选定的溶液中。用Tween-20/ PBS和PBS洗涤后，洗脱所结合的噬菌体。用洗脱的噬菌体感染对数中期的大肠杆菌细胞并铺于添加葡萄糖和氯霉素的LB-琼脂板(LB-CG)上。过夜孵育后，将克隆刮下，保持在含有15%甘油的LB-CG中。
将MOR09281如下分离。为获得亲和力改善的Fab，对自固相Fc捕获和差异全细胞淘选(differential whole cell pannings)得到的噬菌体针对LCDR3多样化进行筛选，随后进行另外的筛选循环。将所有淘选策略的输出在初级ELISA中对重组人涎免凝集素15-hFc进行筛查。阳性克隆经受二级ELISA和FACS筛查。将所选克隆合并并纯化。
C. HuCAL GOLD® Fab抗体在大肠杆菌中的微表达
由pMORPH®x23_Fab编码的Fab片段在大肠杆菌中的微表达(micro expression)在圆底96孔培养板(Corning)中进行。将大肠杆菌克隆接种到培养基中。孵育培养板直至培养物变得轻微浑浊。然后，加入额外的培养基。培养板进一步孵育过夜。第二天，向培养板的各孔中加入包含2.5 mg/ml溶菌酶(Roche)的BEL缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物(Roche, cat No. 11873580001))并摇动培养板。大肠杆菌裂解后，加入脱脂牛奶/TBS (Takara Bio)溶液，并进一步摇动培养板。制备的大肠杆菌裂解物用于人涎免凝集素-15结合剂的ELISA筛查。
D. 涎免凝集素-15结合剂的ELISA筛查
96-孔MaxiSorpTM微量滴定板(Nunc)的各孔用1.25 μg/ml山羊抗人Fc抗体(Jackson Immuno Research, cat No. 109-005-098)包被过夜。第二天，用PBS洗涤后微量滴定板用脱脂牛奶/PBS封闭。用PBS洗涤后，向微量滴定板中加入1μg/ml重组人涎免凝集素-15-Fc。各孔用Tween-20/Tris缓冲盐水(Takara Bio, (TBST))洗涤三次，然后加入如上所述的大肠杆菌裂解物。轻轻摇动板，然后用TBST洗涤。然后，用TBST稀释碱性磷酸酶缀合的抗人Fab (Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-097)并加入板中。轻轻摇动板，然后用TBST洗涤。通过Attophos Substrate Set (Roche)检测结合，用板读数器(分子器件, SpectraMax M5)测量荧光(激发：440 nm；发射：550 nm)。
[实施例2]
HuCAL® IgG2的构建、表达和纯化
A. IgG2的转变
为了表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从pMORPHx®9 Fab表达载体亚克隆至用于IgG2的适当pMOPRH®2_h_Ig载体。使用限制酶MfeI和BlpI将VH结构域片段亚克隆至pMORPH®2_h_IgG2中，使用EcoRV和BsiWI将VL结构域片段亚克隆至pMORPH®2_h_Igκ中，使用EcoRV和HpaI将VL结构域片段亚克隆至pMORPH®2_h_Igλ2中。连接、转化和制备DNA后，所得IgG表达质粒通过限制性分析和测序表征。
B. 人IgG2的瞬时表达和纯化。
用等量的IgG重链和轻链表达载体(pMORPH®2)转染真核HKB11细胞。通常在转染后3-7天收集细胞培养上清液。无菌过滤后，对该溶液进行标准蛋白A亲和色谱(MabSelect SURE, GE Healthcare)。如果没有另外说明，将缓冲液更换成1× Dulbecco’s PBS (pH 7.2, Invitrogen)或柠檬酸盐缓冲液(100 mM柠檬酸盐，150 mM NaCl, pH 5.0)，且样品进行无菌过滤(0.2 µm孔径)。通过UV-分光光度法测定蛋白浓度。在变性、还原和非还原条件下用SDS-PAGE或通过使用Agilent BioAnalyzer分析IgG的纯度，而在天然状态下通过HP-SEC分析IgG的纯度。
[实施例3]
筛查和抗体表征
A. 涎免凝集素-15-FC的捕获ELISA
384-孔MaxiSorpTM 微量滴定板的各孔用山羊抗人IgG (Dianova, Cat#109-005-098, 在PBS中1:1,000稀释)包被。第二天，洗涤各孔然后在微量滴定板摇床上用MPBST封闭。各孔用PBST洗涤，然后加入重组人或小鼠涎免凝集素15-人Fc融合蛋白。孵育后，加入预封闭的BEL提取物(其制备参考实施例1C)或纯化的Fab/IgG。将板在微量滴定板摇床上孵育，然后用PBST洗涤。
为了检测与所捕获的Fab结合的抗原，用PBST洗涤板，并加入抗Fab-AP (Dianova, Cat#109-055-097, 在PBS中1:5000稀释)。
孵育后，用TBST洗涤板，加入Attophos (AttoPhos Substrate Set, Roche #11681982001, 在TBS中1:10稀释)，并在TECAN微量滴定板读数器(发射: 535nm; 激发: 430nm)上测量荧光。
B. FACS分析
用Versene (Invitrogen #15040066)分离HEK293T细胞，洗涤并重悬在FACS缓冲液(PBS / 3% FCS)中。洗涤非粘附的HEK293 FreeStyleTM细胞并重悬在FACS缓冲液中。将1x105-1x106个细胞/孔转移至圆底96孔板中，300x g沉淀5分钟，并重悬于稀释的BEL提取物(见实施例1C)或纯化的抗体。将细胞-抗体混合物在4℃孵育1 h。通过300x g离心5分钟并随后悬浮于FACS缓冲液来洗涤细胞两次(在该项目的过程中，洗涤步骤的数目增加至5次以防止抗体与未转染的细胞结合)。将细胞重悬于检测抗体溶液(在FACS缓冲液中1:100稀释)。4℃孵育1 h后，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于FACS缓冲液并通过FACS Array装置分析。通过FlowJo软件分析数据。MOR03207 (抗溶菌酶)抗体用作阴性对照。用山羊抗人PE (Jackson ImmunoResearch #109-116-097)检测人抗体。
[实施例4]
候选抗体的亲和力成熟
A. 亲和力成熟文库的产生
为了增加所选抗体片段的亲和力和生物学活性，通过使用三核苷酸定向诱变的盒式诱变并行优化CDR3L和CDRH2区域(Virnekas 等 1994)，而构架区保持不变。在用于亲和力成熟的克隆之前，将所有的亲本Fab片段从相应的表达载体(pMORPH®x9_FH)通过XbaI/EcoRI转移至CysDisplay®载体pMORPH®25_LHC中。CDRL3或CDRH2多样化后，将所得的七个不同文库的连接混合物电穿孔到4 ml大肠杆菌细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，获得约107-108个独立克隆/文库。该文库大小确保涵盖了理论上的多样性。文库的扩增如前文所述进行(Rauchenberger 等 2003)。为了质量控制，随机挑选单一的克隆并测序。
B. 固相Fc捕获淘选
将从如上所述亲和力成熟文库拯救的1 x 1012个噬菌体通过如下文所述的固相FC捕获淘选引入筛选中。
将MaxiSorpTM板(F96 MaxiSorpTM, Nunc #442402)上适当数目的孔用330 µl Fcγ 片段特异的抗人IgG(在PBS中10 µg/ml; Jackson Immuno Research, Cat#109-005-098)包被过夜。第二天，包被的各孔用PBS洗涤，并在微量滴定板摇床上用MPBST封闭。随后，各孔用PBS洗涤并用330 μl抗原溶液孵育。噬菌体于包含奶粉、Tween20和0.1 mg/ml山羊γ球蛋白(Jackson Immuno Research, Cat#009-000-002)的PBS溶液中在旋转器上室温预封闭2 h。为筛选过程，从MaxiSorpTM板除去抗原溶液，并用PBS洗涤孔。向相应的各孔中加入预封闭的噬菌体，并将板在微量滴定板摇床上孵育。孵育后，除去噬菌体溶液，用PBST和PBS洗涤各孔多次。最后一次洗涤步骤后除去PBS，然后继续洗脱。通过Tris/HCl中的DTT (pH 8.0)和室温10分钟的孵育期，洗脱特异性结合的噬菌体。洗出液用于感染对数期的大肠杆菌TG1 F+培养物。将感染的大肠杆菌铺板在添加氯霉素和葡萄糖的LB琼脂板上，并孵育。第二天，将细菌克隆刮下并重悬于YT培养基中。
在CDRL3成熟淘选和CDRH2成熟淘选中应用筛选循环。在各个筛选循环中通过降低抗原的浓度和增加洗涤步骤的次数和强度来增加淘选的严格性。
C. 差异全细胞淘选
差异全细胞成熟淘选(Differential whole cell maturation pannings)基本上如下文所述进行。
通过对重组抗原的固相Fc捕获淘选(见实施例4B)和对转染细胞的全细胞淘选的交替来设计差异全细胞淘选(dWCP)，如下文所述的。
使用瞬时转染人涎免凝集素-15的HEK293 FreeStyleTM细胞进行全细胞淘选(WCP)。将表达涎免凝集素-15的细胞洗涤、重悬并预封闭。将从各个成熟文库拯救的约1 x 1012个噬菌体预封闭。封闭后，将1x106个表达涎免凝集素-15的细胞沉淀，重悬于预封闭的噬菌体溶液中并孵育。在随后的筛选循环中，细胞数目减少至5 x 105。通过洗涤步骤除去非特异性噬菌体，其中增加在淘选过程中洗涤的严格性。对于洗涤，细胞通过离心沉淀、重悬并在旋转器上孵育。洗涤后，从细胞洗脱特异性结合的噬菌体。离心后，将上清液从细胞沉淀中除去，用2 M Tris碱(未缓冲的)中和其pH。用所选噬菌体对大肠杆菌TG1 F+的感染按照对固相淘选(见实施例4B)所述进行。筛选循环按照Fc捕获淘选或按照全细胞淘选进行。
D. 亲本抗体
MOR09012、MOR08656和MOR08662分别为MOR09892、MOR09898或MOR10110的亲本抗体。选择MOR09281作为候选物，用于无亲和力成熟步骤的进一步分析。
关于抗体的氨基酸序列、编码该抗体的核酸序列及其结构的信息在表1-7中概述。
表 1 – MOR08656
表 2 – MOR08662
Figure 625541DEST_PATH_IMAGE003
表 3 – MOR09012
Figure 405279DEST_PATH_IMAGE004
表 4 – MOR09281
Figure 800488DEST_PATH_IMAGE005
表 5 – MOR09892
Figure 552543DEST_PATH_IMAGE006
表 6 – MOR09898
Figure 375006DEST_PATH_IMAGE007
表 7 – MOR10110
*核苷酸或氨基酸残基的范围。
各个抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列在表8中示出。
表 8
Figure 778622DEST_PATH_IMAGE009
Figure 447501DEST_PATH_IMAGE010
抗体MOR09281、MOR09892、MOR09898和MOR10110的CDR1和CDR2的氨基酸序列与下述共有序列一致。
重链CDR1共有序列为
X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 71)
其中X1为N或S，X2为W或A和X3为S、H、T或N。
重链CDR2共有序列为
X4ISYSX5SX6TYYADSVKG (SEQ ID NO: 72)
其中X4为L、Y或F，X5为S或G和X6为T或N。
轻链CDR1共有序列为
SGDX7LX8X9X10YX11X12 (SEQ ID NO: 73)
其中X7为N或A，X8为G，P或R，X9为S或N，X10为Y、R或K，X11为A或V和X12为Y、H或S。
轻链CDR2共有序列为
X13X14NX15RPS (SEQ ID NO: 74)
其中X13为G或D，X14为T或D和X15为N、D或K。
[实施例5]
结合活性分析
A. 通过ELISA的结合活性分析
将0.1 mL 1 μg/ml的重组人涎免凝集素-15-Fc、小鼠涎免凝集素-15-Fc或人Fc (Jackson Immuno Research, #009-000-008)加入96孔Immobilizer氨基板(Nunc)的孔中，并将板保持在4℃过夜。第二天，用0.05% Tween-20/PBS (PBST)洗涤后，将板用5% BSA/PBS室温封闭1.5小时。用PBST洗涤后，向板中加入0.1 mL 1 μg/ml 的抗涎免凝集素-15抗体(MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR09012、MOR08656、MOR08662)和人IgG (Jackson Immuno Research, Cat. No. 009-000-003作为阴性对照)，并将板保持在室温1小时。用PBST洗涤后，向板中加入0.1 mL用PBST稀释5000倍的过氧化物酶缀合的抗人Fab抗体 (Jackson Immuno Research, Cat. No. 112-035-097)，并将板保持在室温1.5小时。用PBST洗涤后，使用ELISA POD ABTS试剂盒(Nacalai Tesque, Cat. No. 02893-60)检测结合。反应时间为4分钟。用板读数器(分子器件, SpectraMax M5)测量450 nm和650 nm处的吸光度。图1显示ELISA结果。发现MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR09012、MOR08656和MOR08662与重组人涎免凝集素-15-Fc和小鼠涎免凝集素-15-Fc二者结合，但不与人Fc结合。
[实施例6]
生物学测定
A. 小鼠破骨细胞形成测定
A-1. 小鼠骨髓非粘附性细胞的制备
将股骨和胫骨从5-8周龄的雄性ddY小鼠切除，并去除软组织。股骨或胫骨的两端均切掉，并使用具有23-号(gauge)注射针的注射器注射D-PBS以推出骨髓细胞。在室温下以1,000 rpm进行离心达5分钟，并且去除上清液。向细胞沉淀中加入1 ml溶血缓冲液(红血细胞裂解缓冲液，Sigma Co., Ltd.制造)使其悬浮，所得混悬液室温放置5分钟。向其中加入20 ml包含10%胎牛血清(FBS)的MEM-α培养基(Invitrogen, Inc.制造)，并将混悬液于室温下1,000 rpm离心5分钟，去除上清液。向细胞沉淀中加入10 ml包含5 ng/ml M-CSF (R&D systems, Inc.制造)和10% FBS的MEM-α培养基使其悬浮。然后，使所得混悬液通过细胞渗滤器(cell strainer) (40 μm Nylon, BD Falcon制造)以去除聚集物。将所得细胞转移至75 cm2-T型烧瓶 (用于粘附细胞)，并在CO2培养箱中培养过夜。过夜培养后，回收不与T型烧瓶粘附的细胞，并用作小鼠骨髓非粘附性细胞。
A-2. 抗涎免凝集素-15抗体对自小鼠骨髓非粘附细胞的破骨细胞分化(用RANKL刺激)的作用
通过使用小鼠骨髓非粘附性细胞的破骨细胞分化测定对实施例1和4中产生的抗涎免凝集素-15抗体的作用进行评估。通过上文实施例6A-1中提及的方法制备的小鼠骨髓非粘附性细胞在包含10% FBS和10 ng/ml的M-CSF的α-MEM培养基中以1.5 x 105个细胞/ml制备，所得细胞制备物以200 μl的量接种于96孔板的各个孔中，并将细胞在CO2培养箱中培养2天。除去96孔板中的旧培养基，每孔加入100 μl包含10% FBS、20 ng/ml人RANKL (RANKL, Peprotech, Inc.制造)和10 ng/ml M-CSF的MEM-α培养基。向细胞培养基中加入浓度为3-100 ng/ml的各抗涎免凝集素-15抗体(MOR09281、MOR09012、MOR09892、MOR08656、MOR09898、MOR08662和MOR10110)，并将细胞在CO2培养箱中额外培养3天。培养完成后，通过下列程序测量形成的破骨细胞的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性。通过吸出除去96孔板各孔的培养基，每孔加入50 μl包含1% Triton X-100的50 mM的柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.1)。然后，在板摇床上摇动板5分钟以裂解细胞。每孔加入50 μl底物溶液(包含5 mg/ml 磷酸对硝基苯酯和0.46%酒石酸钠的50 mM的柠檬酸钠缓冲液(pH 6.1))，并室温孵育板10分钟。孵育后，向96孔板的每孔中加入50 μl 1 N的氢氧化钠溶液以终止酶促反应。酶促反应终止后，测量各孔在405 nm的吸光度作为TRAP活性的指标。结果在图2-8中显示。对于MOR09012 (MOR09892的亲本抗体)、MOR08656 (MOR09898的亲本抗体)和MOR08662 (MOR10110的亲本抗体)，未观察到对TRAP活性的显著抑制。另一方面，对于MOR09281、MOR09892、MOR09898和MOR10110，在13 ng/ml或更高浓度观察到剂量依赖形式的对TRAP活性的显著抑制。上述结果显示抗涎免凝集素-15抗体(MOR09281、MOR09892、MOR09898和MOR10110)对破骨细胞形成(破骨细胞分化和成熟)具有有效的抑制作用。此外，还显示亲本抗体(MOR09012、MOR08656和MOR08662)的亲和力成熟产生对破骨细胞形成具有更高抑制活性的抗体(分别为MOR09892、MOR09898和MOR10110)。
B. 人破骨细胞的OsteoLyse 测定
B) 添加人抗人涎免凝集素-15单克隆抗体对正常人破骨细胞前体细胞的骨吸收活性的作用(使用胶原包被的板评估)
已经知道破骨细胞释放蛋白酶例如组织蛋白酶K并降解I型胶原(其为骨组织的组成组分)。OsteoLyse测定试剂盒(Lonza, Inc.制造, Cat. No. PA-1500)提供经铕缀合的人胶原包被的96孔板(96孔OsteoLyse细胞培养板)，并且当在该板中培养破骨细胞时可通过测量上清液中释放的荧光性胶原片段的量来体外评估破骨细胞的骨吸收活性。
根据细胞附带的方案将正常人破骨细胞前体细胞(正常人天然破骨细胞前体细胞，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110)按1 x 104个细胞/孔接种于96孔OsteoLyse细胞培养板中。使用添加有OPGM补充套组(supplement set) (破骨细胞 SingleQuotTM 试剂盒, 购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501)的用于破骨细胞前体细胞的极限必需培养基(OPBM，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201)作为培养基，其含有胎牛血清(终浓度: 10%)、人RANKL (终浓度: 10或20 ng/ml)、人M-CSF (终浓度: 33 ng/ml)等。向所得培养物的上清液中加入实施例1-4中制备的人抗人涎免凝集素-15单克隆抗体(MOR09281、09012、09892、08656、09898、08662和10110)，使得终浓度为4、20、100或500 ng/ml，并且细胞在CO2培养箱中培养4-5天。收集培养物上清液的10 μl等分部分，向其中加入200 μl OsteoLyse测定试剂盒中包含的荧光基团释放试剂，并使用时间分辨荧光荧光计(ALVO MX, Perkin Elmer Inc. 制造, 激发：340 nm和发射：615 nm)测量荧光强度(RFU)，以此测定培养物上清液中释放的游离荧光性胶原片段的量。结果在图9-13中显示。结果，通过添加RANKL而增加的荧光性胶原片段的量被抗涎免凝集素-15抗体在4 ng/ml - 500 ng/ml的范围内以浓度依赖的方式减少。关键的发现为亲和力提高的抗体(MOR09892、09898和10110)以比各自的亲本抗体(MOR09012、08656和08662)更低的浓度抑制骨吸收活性。这些结果提示抗体结合亲和力的改进也导致生物活性的改善。
[实施例7]
另外的抗体的制备及测定
A. 抗体的制备
以与实施例1中获得MOR09281相同的方式制备MOR09268，并根据实施例2将其转化为IgG2。MOR09268为MOR12574、MOR13154和MOR13156的亲本抗体。根据实施例4中所述的方案进行亲和力成熟以产生这三种抗体。
关于抗体的氨基酸序列、编码其的核酸序列及其结构的信息在表9-12中概述。
表 9 – MOR09268
Figure 440865DEST_PATH_IMAGE011
表 10 – MOR12574
Figure 195194DEST_PATH_IMAGE012
表 11 – MOR13154
Figure 869889DEST_PATH_IMAGE013
表 12 – MOR13156
Figure 393274DEST_PATH_IMAGE014
*核苷酸或氨基酸残基的范围
注意：抗体MOR09268和MOR12574的重链是相同的。抗体MOR12574和MOR13156的轻链是相同的。
各个抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列在表13中示出。
表 13
Figure 823119DEST_PATH_IMAGE015
Figure 2427DEST_PATH_IMAGE016
抗体MOR09281、MOR09892、MOR09898、MOR10110、MOR09268、MOR12574、MOR13154和MOR13156的重链的CDR1和CDR2以及轻链的CDR2的氨基酸序列与下述共有序列一致。
重链CDR1共有序列为
X16YX17MX18 (SEQ ID NO: 106)
其中X16为N、S或T，X17为W或A和X18为S、H、T或N。重链CDR2共有序列为
X19IX20X21X22X23X24X25X26X27TX28YAX29X30VKG (SEQ ID NO: 107)
其中X19为L、Y、F、N或T，X20为S、A、F或E，X21为Y、G或I，X22为K或无氨基酸，X23为E或无氨基酸，X24为S或A，X25为S或G，X26为S或Y，X27为T、N、V、S或A，X28为Y或N，X29为D或A和X30为S或G。
轻链CDR2共有序列为
X31X32X33X34RPS (SEQ ID NO: 108)
其中X31为G、D或Y，X32为T、D或V，X33为N或T和X34为N、D或K。
抗体MOR12574、MOR13154和MOR13156均具有如下相同的轻链CDR1序列：
TGTSSDVGDYNYVS (SEQ ID NO: 83)
抗体MOR12574、MOR13154和MOR13156均具有如下相同的轻链CDR2序列：
YVTNRPS (SEQ ID NO: 89)
抗体MOR12574、MOR13154和MOR13156均具有如下相同的重链CDR3序列：
RGPGMGNMDI (SEQ ID NO: 80)
抗体MOR12574、MOR13154和MOR13156的轻链CDR3的氨基酸序列与下列共有序列一致。
QSYAX35X36X37X38X39X40X41V (SEQ ID NO: 109)
其中X35为P或G，X36为L或A，X37为S或P，X38为S或F，X39为S或N，X40为H或无氨基酸和X41为I或L。
B. 人破骨细胞的OsteoLyse测定
人抗人涎免凝集素-15单克隆抗体对正常人破骨细胞前体细胞的骨吸收活性的作用(使用胶原包被的板评估)
根据细胞附带的方案将正常人破骨细胞前体细胞(正常人天然破骨细胞前体细胞，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) 按1 x 104个细胞/孔接种在96孔OsteoLyse细胞培养板 (Lonza, Inc., Cat. No. PA-1500)中。使用添加有OPGM补充套组(破骨细胞 SingleQuotTM 试剂盒, 购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501)的用于破骨细胞前体细胞的极限必需培养基(OPBM，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201)作为培养基，其含有胎牛血清(终浓度: 10%)、人RANKL (终浓度: 10或20 ng/ml)、人M-CSF (终浓度: 33 ng/ml)等。向所得培养物上清液中加入MOR09268，使得终浓度为3或30 µg/ml，并且细胞在CO2培养箱中培养6天。同样将MOR12574、MOR13154或MOR13156加入到培养物上清液中，使得终浓度为4、20、100或500 ng/ml，并且细胞在CO2培养箱中培养5天。收集培养物上清液的10 μl等分部分，并向其中加入200 μl OsteoLyse测定试剂盒中包含的荧光基团释放试剂。使用时间分辨荧光荧光计(ALVO MX, Perkin Elmer Inc. 制造, 激发：340 nm和发射：615 nm)测量荧光强度(RFU)，以此测定培养物上清液中释放的游离荧光性胶原片段的量。MOR09268、MOR12574、MOR13154和MOR13156的结果分别在图42、43、44和45中显示。如图42-45所示，通过添加RANKL而增加的荧光性胶原片段的数目被抗涎免凝集素-15抗体以浓度依赖的方式减少。
[实施例8]
使用卵巢切除的大鼠评估抗涎免凝集素-15单克隆抗体的生物学活性。
A. 动物实验方案
自12周龄的雌性F344大鼠(获自Charles River Laboratories Japan, Inc.)切除双侧卵巢，并将大鼠分为两组：溶媒给予组；和抗涎免凝集素-15单克隆抗体给予组。另外，准备一组作为假手术组。在抗体给予组中，从手术第二天按1 mg/kg的剂量腹膜内给予实施例2或7中的抗涎免凝集素-15单克隆抗体，每周3次，重复4周。在溶媒给予组和假手术组中，腹膜内给予包含0.01% Tween 20的PBS作为溶媒。在初次给予后第4周，禁食条件下收集尿液24小时，并将尿液样品于-80℃储存直至测量。尿液收集完成后，对大鼠实施安乐死，并将腰椎从各大鼠中切除。
B. 腰椎骨密度的测量
去除经切除腰椎上粘附的软组织，取出第4-6块腰椎骨。取出的腰椎骨通过在乙醇中摇动脱脂和脱水，然后空气干燥，并使用骨密度计(DCS-600EX, Aloka Co., Ltd. 制造)测量骨密度。与假手术组相比，将在卵巢切除组中观察到腰椎骨密度的显著降低，然而，在抗体给予组中，由于卵巢切除造成的骨密度降低将被显著抑制。
C. 尿脱氧吡啶啉***的测量
多种I型胶原交联的代谢产物明显地反映骨代谢周转(turnover)，特别是骨吸收。尤其是，脱氧吡啶啉主要定位于骨胶原，因此，认为其作为骨吸收指标具有高的可靠性。
将冷藏保存的尿样品融化，通过离心操作沉淀不溶解物质，借此获得上清液。此上清液中包含的脱氧吡啶啉的量使用Osteolinks “DPD” (DS Pharma Biomedical Co., Ltd. 制造)测量。此外，通过使用Creatinine Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 制造)，还测量上清液中肌酸酐的含量，并计算经肌苷酸校正的脱氧吡啶啉的量。与假手术组(sham group)相比，卵巢切除组的尿脱氧吡啶啉***显著增加，因此，将表明在卵巢切除的大鼠中，破骨细胞的骨吸收增加。另一方面，在抗体给予组中，卵巢切除造成的脱氧吡啶啉***的增加将受到抑制。从该结果将还可确认在动物模型中与涎免凝集素-15特异性结合的单克隆抗体抑制破骨细胞的骨吸收，并且其将有力地表明由于对骨吸收的抑制作用，卵巢切除大鼠中腰椎骨密度的降低受到抑制。
[工业适用性]
本发明的抗涎免凝集素-15抗体具有抑制破骨细胞分化或骨吸收活性的能力，并且包含抗涎免凝集素-15抗体的药物组合物可为用于异常骨代谢疾病的治疗或预防剂。
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Claims (34)

1. 抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞的骨吸收的能够结合涎免凝集素-15的分离抗体，或其功能片段，包含：(a) 包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链，所述CDRH1包含与SEQ ID NO: 106具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH2包含与SEQ ID NO: 107具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRH3包含与SEQ ID NO: 80、55、65、35或45中的一个具有至少80%序列同一性的序列；和(b) 包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，所述CDRL1包含与SEQ ID NO: 83或73具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL2包含与SEQ ID NO: 108具有至少80%序列同一性的序列，所述CDRL3包含与SEQ ID NO: 90、60、100、70、40、50或109中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
2. 权利要求1的分离抗体或其功能片段，其中所述CDRH1包含与SEQ ID NO: 78、53、63、33或43中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
3. 权利要求1或2的分离抗体或其功能片段，其中所述CDRH2包含与SEQ ID NO: 104、54、94、64、34、44或79中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
4. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述CDRL1包含与SEQ ID NO: 88、58、68、38或48中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
5. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述CDRL2包含与SEQ ID NO: 89、59、69、39或49中的一个具有至少80%序列同一性的序列。
6. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体中的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列包含：
a) 分别为SEQ ID NO: 103、104、105、88、89和90，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
b) 分别为SEQ ID NO: 53、54、55、58、59和60，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
c) 分别为SEQ ID NO: 93、94、95、98、99和100，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
d) 分别为SEQ ID NO: 63、64、65、68、69和70，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
e) 分别为SEQ ID NO: 33、34、35、38、39和40，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
f) 分别为SEQ ID NO: 43、44、45、48、49和50，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列；
g) 分别为SEQ ID NO: 78、79、80、88、89和90，或与其具有至少80%、90%或95%序列同一性的序列。
7. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含：
选自以下的重链可变区：
a1) 包含SEQ ID NO: 102的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 52的氨基酸残基20-137、SEQ ID NO: 92的氨基酸残基20-138、SEQ ID NO: 62的氨基酸残基20-136、SEQ ID NO: 32的氨基酸残基20-136、SEQ ID NO: 42的氨基酸残基20-135或SEQ ID NO: 77的氨基酸残基20-138的氨基酸序列；
a2) 与a1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
a3) 与a1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
a4) 在a1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
选自以下的轻链可变区：
b1) 包含SEQ ID NO: 87的氨基酸残基20-134、SEQ ID NO: 57的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 97的氨基酸残基20-133、SEQ ID NO: 67的氨基酸残基20-129、SEQ ID NO: 37的氨基酸残基20-129或SEQ ID NO: 47的氨基酸残基20-129的氨基酸序列；
b2) 与b1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
b3) 与b1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
b4) 在b1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
8. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含：
选自以下的重链：
a1) 包含SEQ ID NO: 102、52、92、62、32、42或77中的一个的序列的氨基酸序列；
a2) 与a1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
a3) 与a1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
a4) 在a1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列；和
选自以下的轻链：
b1) 包含SEQ ID NO: 87、57、97、67、37或47中的一个的序列的氨基酸序列；
b2) 与b1)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
b3) 与b1)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；和
b4) 在b1)的氨基酸序列中包括一个或数个氨基酸残基添加、缺失或取代的氨基酸序列。
9. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列组成的轻链。
10. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成的轻链。
11. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列组成的轻链。
12. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 62的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列组成的轻链。
13. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列组成的轻链。
14. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成的轻链。
15. 权利要求1-8中任一项的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体包含由包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列组成的重链和由包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列组成的轻链。
16. 前述权利要求中任一项的抗体的功能片段，其选自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
17. 权利要求1-7中任一项的抗体，其特征在于为scFv。
18. 前述权利要求中任一项的分离抗体或其功能片段，其用于治疗和/或预防异常骨代谢。
19. 权利要求1-17中任一项的分离抗体或其功能片段在制造用于治疗或预防异常骨代谢的药物中的用途。
20. 治疗罹患异常骨代谢的患者的方法，所述方法包括给予在治疗上有效量的权利要求1-17中任一项的分离抗体或其功能片段。
21. 包含至少一种权利要求1-17的抗体或其功能片段的药物组合物。
22. 权利要求21的药物组合物，其特征在于为用于异常骨代谢的治疗和/或预防剂。
23. 用于治疗和/或预防异常骨代谢的药物组合物，特征在于包含至少一种权利要求1-17的抗体或所述抗体的功能片段和至少一种选自以下的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂例如***、SERM (选择性***受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺素)制剂、非甾体抗炎剂、可溶性TNF受体制剂、抗TNF-α抗体或该抗体的功能片段、抗PTHrP (甲状旁腺素相关蛋白)抗体或该抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或该抗体的功能片段、抗RANKL抗体或该抗体的功能片段和OCIF(破骨细胞生成抑制因子)。
24. 权利要求18的抗体或功能片段、权利要求19的用途、权利要求20的方法或权利要求22或23的药物组合物，其中所述异常骨代谢选自：骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌症骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、牙周炎引起的牙丧失、假关节周围的骨质溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、佩吉特氏骨病、肾性骨营养不良和成骨不全症。
25. 权利要求24的抗体、功能片段、用途、方法或药物组合物，其特征在于异常骨代谢为骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏或伴随癌症骨转移的骨破坏。
26. 权利要求25的抗体、功能片段、用途、方法或药物组合物，其特征在于所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用治疗剂例如类固醇或免疫抑制剂引起的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
27. 多核苷酸，其包含：
a) 编码权利要求1-17的抗体或其功能片段中的一种的核苷酸序列；或
b) 与由与a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列。
28. 权利要求27的多核苷酸，其中编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列的核苷酸序列包含：
a) 分别为SEQ ID NO: 101的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 101的核苷酸205-261、SEQ ID NO: 101的核苷酸358-387、SEQ ID NO: 86的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 86的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 86的核苷酸328-363；
b) 分别为SEQ ID NO: 51的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 51的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 51的核苷酸352-378、SEQ ID NO: 56的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 56的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 56的核苷酸319-348；
c) 分别为SEQ ID NO: 91的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 91的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 91的核苷酸352-381、SEQ ID NO: 96的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 96的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 96的核苷酸328-360；
d) 分别为SEQ ID NO: 61的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 61的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 61的核苷酸352-375、SEQ ID NO: 66的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 66的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 66的核苷酸319-348；
e) 分别为SEQ ID NO: 31的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 31的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 31的核苷酸352-375、SEQ ID NO: 36的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 36的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 36的核苷酸319-348；
f) 分别为SEQ ID NO: 41的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 41的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 41的核苷酸352-372、SEQ ID NO: 46的核苷酸124-156、SEQ ID NO: 46的核苷酸202-222和SEQ ID NO: 46的核苷酸319-348；或
g) 分别为SEQ ID NO: 76的核苷酸148-162、SEQ ID NO: 76的核苷酸205-255、SEQ ID NO: 76的核苷酸352-381、SEQ ID NO: 86的核苷酸124-165、SEQ ID NO: 86的核苷酸211-231和SEQ ID NO: 86的核苷酸328-363。
29. 权利要求27的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
选自以下的编码重链可变区的核苷酸序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 101的核苷酸58-420、SEQ ID NO: 51的核苷酸58-411、SEQ ID NO: 91的核苷酸58-414、SEQ ID NO: 61的核苷酸58-408、SEQ ID NO: 31的核苷酸58-408、SEQ ID NO: 41的核苷酸58-405或SEQ ID NO: 76的核苷酸58-414的核苷酸序列；
a2) 与由与a1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a3) 在a1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和
选自以下的编码轻链可变区的核苷酸序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 86的核苷酸58-402、SEQ ID NO: 56的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 96的核苷酸58-399、SEQ ID NO: 66的核苷酸58-387、SEQ ID NO: 36的核苷酸58-387或SEQ ID NO: 46的核苷酸58-387的核苷酸序列；
b2) 与由与b1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3) 在b1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列。
30. 权利要求29的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
选自以下的编码重链的核苷酸序列：
a1) 核苷酸序列：SEQ ID NO: 101、51、91、61、31、41或76中的一个的序列；
a2) 与由与a1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a3) 在a1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或取代的核苷酸序列；和
选自以下的编码轻链的核苷酸序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 86、56、96、66、36或46中的一个的序列的核苷酸序列；
b2) 与由与b1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b3) 在b1)的核苷酸序列中包括一个或数个核苷酸添加、缺失或添加的核苷酸序列。
31. 包含至少一种权利要求27-30中任一项的多核苷酸的载体。
32. 包含至少一种权利要求27-30中任一项的多核苷酸的转化细胞。
33. 包含至少一种权利要求31的载体的转化细胞。
34. 生产权利要求1-17的抗体的方法，所述方法包括培养权利要求32或33的转化细胞、收集培养物和从所述培养物中纯化所述抗体的步骤。
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