CN103230617B - 一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料及其制备方法,其特点是应用超声波技术,以医用生物皮片为原料提取制备I型胶原。将六氟异丙醇与醋酸以不同体积比例混合,制备得到纺丝溶剂,然后将制得的I型胶原与一定质量比例的壳聚糖混合加入到纺丝溶剂中,室温下在超声波清洗器中搅拌至透明,配制成浓度为4%~10%的静电纺丝母液,将静电纺丝母液注入静电纺丝机中进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜。接着将胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜先后浸泡在天然生物大分子和中草药中,最后经冷冻干燥后,制得胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料。该材料具有良好的生物相容性、可生物降解性、粘附性等优良性能,能够快速止血、抗炎镇痛、促进伤口复合,能够用于创伤止血修复及一般性民用止血急救。
Description
技术领域
本发明涉及了一种具有良好的生物相容性、可生物降解性、粘附性等优良性能,能够快速止血、抗炎镇痛、促进伤口复合的止血剂。
背景技术
出血给人类生命造成极大的危险,寻求快速有效的止血剂一直是国内外研究的热点。在各类外科手术或创伤治疗中,创面出血及与外界隔离避免感染,对患者的伤口愈合影响很大。在战争中,据统计在伤后48小时内死因中,出血是主要的原因,占所有外伤事故的80%。创伤失血过多会使得伤员疼痛、休克、昏迷甚至死亡,因此止血材料需要快速有效止血,还得具有抗炎镇痛、促进伤口复合等的效果。
传统的止血材料主要是急救包、四头带、止血带和绷带等,这类材料不易携带和消毒保存,止血几乎靠机械作用效果不好。近年来,人们研制出一类生物可吸收止血材料,其中胶原基止血材料受到人们的广泛关注,胶原既具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒性、弱抗原性,又能激活细胞特性基团的表达,维持细胞正常的特性表达,有利于细胞的黏附、生长、增殖、分化,其止血性能也较为突出,已有大量的文献报道。
但卫华等人主持承担“十五”国家高技术研究发展计划(863计划)项目,研发出综合性能优良的“医用生物皮片”,已实现产业化。这种“医用生物皮片”具有良好的生物相容性,其止血性能良好。梁佩红等采用猪筋腱胶原与壳聚糖按一定比例聚合,戊二醛交联,冷冻干燥制成复合海绵。研究表明其止血时间为2分钟,可促进伤口愈合[(梁佩红,叶春婷,李斯明,等.复合Ι型胶原海绵创伤止血的动物实验研究[J].创伤外科杂志,2002,4(5):274-275)]。但上述材料或者同类胶原基产品如果不使用戊二醛进行交联,力学性能无法达到要求,交联后,又材料的生物相容性又会出现问题;使用胶原纯度不够或者免疫端肽没有很好的除去,造成有一定的免疫原性,从而导致伤者不适,而且该类产品不能减轻伤者的痛苦,已经难以满足人们对此类产品的要求。为了解决上述材料功能单一的问题,可以将材料与一些具备消炎镇痛的中药进行复合,很多学者已经做过这一类地研究。朱楚洪等将胶原、壳聚糖及大黄中有效成分大黄酚进行了有机复合,制备得到了一种具有快速止血、消炎镇痛等多功能性的新型敷料[(朱楚洪,蒋波,曾文,李立,糜建红.一种新型多功能止血敷料.申请公布号:CN 102258802A)]。由此可见,以往的止血材料,尚存在止血时间长、止血效果差等弊端,甚至个别止血材料还有一定的免疫原性。
综上所述,现有技术存在以下不足:
1.现有的胶原基止血剂力学性能不足,粘附性较差,给手术操作造成不必要的麻烦;
2.现有的胶原基止血剂止血性能一般,功能单一,已经不能满足市场的要求;
3.现有的胶原基止血剂单体材料中I型胶原纯度不够,还会存在一定的免疫原性,应用于临床可能会对患者造成不可估计的伤害。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供了一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料。材料在超声波的作用下,采用医用生物皮片为原料提取I型胶原,得到的I型胶原纯度更高、提取率也更高,抗原性更低,后经静电纺丝、复合天然高分子与三七有效成分,制备得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料。使用该材料,可以实现快速、有效止血,还具备力学性能突出、粘附性良好、消炎镇痛、促进伤口愈合等优点。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的,即一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料,其能够快速、有效止血、消炎镇痛并且能够促进伤口愈合,其特征是,制备方法步骤如下:
(1) Ⅰ型胶原提取: 取一定量的医用生物皮片,将其剪成0.5cm×0.5cm的小块,用超纯水清洗3~5次,后浸泡在0.05mol/L Tris,1mol/L NaCl,pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液中,置于频率为20~40kHz的超声波清洗器内,作用2~4h;倒去缓冲液,用蒸馏水将皮块漂洗2~5次;加入30~50倍的0.5~1M的醋酸溶液,浸泡2~4h,4℃恒温条件下用匀浆机打碎、匀浆,然后转移至反应釜中,按皮重的2%加入相应质量的胃蛋白酶;在超声波条件下,4℃恒温缓慢搅拌酶解24~36h,每3~5h作用1~2h;反应完成后,停止搅拌,将反应液抽滤,调节滤液pH至7.0~7.5,加入最终浓度为1.5mol/L硫酸铵粉末 ,静置10~20h;将胶原溶液在10000~20000rpm下离心10~30min,除去上清液,将沉淀物溶解在0.1~0.5M醋酸溶液中,10000~20000rpm离心10~30min,除去上清液,反复溶解离心3~5次,最后以超纯水洗涤沉淀,离心,冷冻干燥,从而得到高纯度Ⅰ型胶原;
(2)静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜:将六氟异丙醇与醋酸以不同体积比例混合,六氟异丙醇含量体积百分比为90%~99%,将上述Ⅰ型胶原与一定比例的壳聚糖混合,室温下在超声波下搅拌至透明,配制成4%~10%的混合液,即为静电纺丝母液,其中壳聚糖含量质量百分比为10%~50%;将静电纺丝母液注入静电纺丝机中进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜;
(3)三七粉的有效成分三七素的提取:在超声波条件下,将三七粉浸渍在10~20倍的95%乙醇溶液中15~20h,再浸渍在5~10倍的95%乙醇溶液中5~10h,静置后合并两次醇提液,留作它用;将残渣晾干,加入10~15倍的水浸提15~20h;再用2~5倍水浸渍6~10h,离心分离得到滤液,将滤液浓缩,干燥制得粗三七素粉末;
(4)胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备:在超声波条件下,将上述制得的胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜浸泡于选自聚乙二醇、海藻酸盐、透明质酸、凝血酶、纤维蛋白、或硫酸软骨素中的一种或几种中;然后再浸渍于采用上述方法制备的粗三七素中;最后经冷冻干燥,剂量为 6~30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌,成型包装,即为成品。
在上述的制备方法中,步骤(1)中使用胃蛋白酶活力为3000u/g,Sigma 公司购买;步骤(2)中六氟异丙醇为分析纯,北京华威锐科公司购买;步骤(2)中不同脱乙酰度的壳聚糖是通过控制甲壳素的脱乙酰度来制备的;步骤(4)中浸泡液的浓度、浸泡时间视材料的不同而不同,如海藻酸钠为2%,浸泡时间为10~20h等,浸泡温度均为室温。
如权利要求1中所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料所具有的性能参数指标测定方法如下表:
如权利要求中所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的止血性能测定方法如下:
取内径为8mm的玻璃洁净试管,加入上述材料0.1g,再加入氯化钙0.1ml;摇均后向试管中加入血液0.5ml,轻摇、混均,立即记时,在37℃水浴箱内观察,每隔30s轻轻倾斜试管1次,观察有无凝血。从加入血液开始记时到倾斜试管血块凝固于管底不流动时为止,即凝血时间,重复六次。
本发明有以下优点:
(1) 复合材料的单体间性能互补与协同:将材料单体复合在一起,可以发挥材料单体本身的优势,复合材料又可以产生材料单体本身不具备或者比单体之前性能有所提升的综合性能。如将静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜与天然高分子材料、三七有效成分复合,复合材料具备着胶原本身的良好的生物相容性、良好的生物可降解性、促进伤口愈合等,既具有壳聚糖出色的止血性能、抗菌/抑菌性能,又兼有三七的止血、消炎止痛作用。复合后的材料力学性能、止血性能、愈合伤口的能力等方面都有所提高,成为一种综合性能优良的止血剂;
(2) 工艺采用静电纺丝技术制备得到的胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜,在未添加交联剂的情况下增强了胶原的力学性能、止血性能等;
(3) 复合材料中I型胶原的提取是以医用生物皮片为原料,在超声波条件下,采用酸酶结合法提取得到的。所得胶原纯度、提取率更高,免疫原性更低;
(4) 在整个制备过程中均使用了超声波,充分发挥了超声波的空化效应、机械效应、热效应等作用,对材料的制备产生了极大的影响;
(5) 制备得到的胶原基微纳纤维复合膜材料综合性能优良,功能多样,携带、使用、保存都很方便。
附图说明
图1. 胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜的SEM扫描电镜照片。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是本实施例只用于本发明进行进一步说明,而不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
实施例1
(1)I型胶原提取:取10重量份的医用生物皮片,将其剪成0.5cm×0.5cm的小块,用超纯水清洗5次,后浸泡在0.05mol/L Tris,1mol/L NaCl,pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液中,置于频率为20kHz的超声波清洗器内,作用2h;倒去缓冲液,用蒸馏水将皮块漂洗两次;加入30倍的0.5M的醋酸溶液,浸泡2h,4℃恒温条件下用匀浆机打碎、匀浆,然后转移至反应釜中,加入0.2重量份的胃蛋白酶;在频率为30kHz的超声波条件下,4℃下缓慢搅拌条件下酶解36h,每3h作用1h;反应完成后,停止搅拌,将反应液抽滤,调节滤液pH至7.0,加入最终浓度为1.5mol/L硫酸铵粉末,静置10h;将胶原溶液在10000rpm下离心30min,除去上清液,将沉淀物溶解在0.5M醋酸溶液中,10000rpm离心30min,除去上清液,反复溶解离心5次,最后以超纯水洗涤沉淀,离心,冷冻干燥,从而得到高纯度I型胶原;
(2)静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜:将49体积份的六氟异丙醇与1体积份的醋酸混合,搅拌均匀;将4.5重量份的I型胶原和0.5重量份的脱乙酰度为80%的壳聚糖溶解在中,配制成10%的胶原/壳聚糖的混合溶液,室温下在频率为20kHz的超声波条件下搅拌至透明,制成静电纺丝母液;将静电纺丝母液注入静电纺丝机中,在电压18kv、纺丝速率0.03mm/min、接收距离10cm的条件下进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜;
(3)三七粉的有效成分三七素的提取:在频率为30kHz的超声波条件下,将10重量份的三七粉浸渍在200体积份的95%乙醇溶液中20h,再浸渍在100体积份的95%乙醇溶液中10h,静置后合并两次醇提液,留作它用;将残渣晾干,加入150体积份的超纯水浸提20h;再用50体积份的超纯水浸渍10h,离心分离得到滤液,将滤液浓缩,干燥制得粗三七素粉末;
(4)胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料:在频率为20kHz的超声波条件下,将上述制得的胶原基微纳纤维复合膜浸泡于2%海藻酸钠和0.1M氯化钙中;然后再浸渍于采用上述方法制备的粗三七素中8h;最后经冷冻干燥,剂量为 15KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌,成型包装,即为成品。
经上述方法制得的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的主要参数性能如下表:
实施例2
(1)I型胶原提取:取10重量份的医用生物皮片,将其剪成0.5cm×0.5cm的小块,用超纯水清洗5次,后浸泡在0.05mol/L Tris,1mol/L NaCl,pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液中,置于频率为30kHz的超声波清洗器内,作用2h;倒去缓冲液,用蒸馏水将皮块漂洗两次;加入40倍的0.5M的醋酸溶液,浸泡2h,4℃恒温条件下用匀浆机打碎、匀浆,然后转移至反应釜中,加入0.2重量份的胃蛋白酶,在频率为30kHz的超声波条件下, 4℃下缓慢搅拌酶解24h,每3h作用1h。反应完成后,停止搅拌,将反应液抽滤,调节滤液pH至7.5,加入最终浓度为1.5mol/L硫酸铵粉末,静置15h;将胶原溶液在20000rpm下离心10min,除去上清液,将沉淀物溶解在0.5M醋酸溶液中,20000rpm离心10min,除去上清液,反复溶解离心5次,最后以超纯水洗涤沉淀,离心,冷冻干燥,从而得到高纯度I型胶原;
(2) 静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜:将45体积份的六氟异丙醇与5体积份的醋酸混合,搅拌均匀;将2重量份的I型胶原和1重量份的脱乙酰度为80%的壳聚糖溶解在中,配制成6%的胶原/壳聚糖的混合溶液,室温下在频率为20kHz的超声波条件下搅拌至透明,制成静电纺丝母液;将静电纺丝母液注入静电纺丝机中,在电压20kv、纺丝速率0.01mm/min、接收距离5cm的条件下进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜;
(3)三七粉的有效成分三七素的提取:在频率为30kHz的超声波条件下,将10重量份的三七粉浸渍在150体积份的95%乙醇溶液中15h,再浸渍在100体积份的95%乙醇溶液中6h,静置后合并两次醇提液,留作它用;将残渣晾干,加入200体积份的超纯水浸提20h;再用150体积份的超纯水浸渍15h,离心分离得到滤液,将滤液浓缩,干燥制得粗三七素粉末;
(4)胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备:在频率为25kHz的超声波条件下,将上述制得的胶原基微纳纤维复合膜浸泡于2%海藻酸钠、4%聚乙二醇和0.1M氯化钙的混合液中8h;然后再浸渍于采用上述方法制备的粗三七素中6h;最后经冷冻干燥,剂量为 20KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌,成型包装,即为成品。
经上述方法制得的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的主要参数性能如下表:
实施例3
(1)I型胶原提取:取10重量份的医用生物皮片,将其剪成0.5cm×0.5cm的小块,用超纯水清洗5次,后浸泡在0.05mol/L Tris,1mol/L NaCl,pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液中,置于频率为30kHz的超声波清洗器内,作用2h;倾去缓冲液,用蒸馏水将皮块漂洗两次;加入50倍的0.5M的醋酸溶液,浸泡2h,4℃恒温条件下用匀浆机打碎、匀浆,然后转移至反应釜中,加入0.2重量份的胃蛋白酶;在频率为20kHz的超声波条件下,4℃下缓慢搅拌酶解36h,每3h作用1h;反应完成后,停止搅拌,将反应液抽滤,调节滤液pH至7.3,加入最终浓度为1.5mol/L硫酸铵粉末,静置20h。将胶原溶液在15000rpm下离心20min,除去上清液,将沉淀物溶解在0.5M醋酸溶液中,15000rpm离心20min,除去上清液,反复溶解离心5次,最后以超纯水洗涤沉淀,离心,冷冻干燥,从而得到高纯度I型胶原;
(2) 静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜:将48体积份的六氟异丙醇与2体积份的醋酸混合,搅拌均匀;将2.5重量份的I型胶原和0.5重量份的脱乙酰度为70%的壳聚糖溶解在中,配制成6%的胶原/壳聚糖的混合溶液,室温下在超声波条件下搅拌至透明,制成静电纺丝母液;将静电纺丝母液注入静电纺丝机中,在电压19kv、纺丝速率0.05mm/min、接收距离10cm的条件下进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜;
(3)三七粉的有效成分三七素的提取:在频率为25kHz的超声波条件下,将10重量份的三七粉浸渍在200体积份的95%乙醇溶液中15h,再浸渍在100体积份的95%乙醇溶液中10h,静置后合并两次醇提液,留作它用;将残渣晾干,加入150体积份的超纯水浸提15h;再用100体积份的超纯水浸渍10h,离心分离得到滤液,将滤液浓缩,干燥制得粗三七素粉末;
(4)胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备:在频率为25kHz的超声波条件下,将上述制得的胶原基微纳纤维复合膜浸泡于3%透明质酸和1%硫酸软骨素的40%乙醇混合溶液中8h;然后再浸渍于采用上述方法制备的粗三七素中8h;最后经冷冻干燥,剂量为 30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌,成型包装,即为成品。
经上述方法制得的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的主要参数性能如下表:
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Claims (8)
1.一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
(1)Ⅰ型胶原提取:取一定量的医用生物皮片,将其剪成0.5cm×0.5cm的小块,用超纯水清洗3~5次,后浸泡在0.05mol/L Tris,1mol/L NaCl,pH为7.5的Tris-NaCl缓冲溶液中,置于频率为20~40kHz的超声波清洗器内,作用2~4h;倒去缓冲液,用蒸馏水将皮块漂洗2~5次;加入30~50倍的0.5~1M的醋酸溶液,浸泡2~4h,4℃恒温条件下用匀浆机打碎、匀浆,然后转移至反应釜中,按皮重的2%加入相应质量的胃蛋白酶;在超声波条件下,4℃恒温缓慢搅拌酶解24~36h,每3~5h作用1~2h;反应完成后,停止搅拌,将反应液抽滤,调节滤液pH至7.0~7.5,加入最终浓度为1.5mol/L硫酸铵粉末,静置10~20h;将胶原溶液在10000~20000rpm下离心10~30min,除去上清液,将沉淀物溶解在0.1~0.5M醋酸溶液中,10000~20000rpm离心10~30min,除去上清液,反复溶解离心3~5次,最后以超纯水洗涤沉淀,离心,冷冻干燥,从而得到高纯度Ⅰ型胶原;
(2)静电纺丝制备胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜:将六氟异丙醇与醋酸以不同体积比例混合,六氟异丙醇含量体积百分比为90%~99%,将上述Ⅰ型胶原与一定比例的壳聚糖混合,室温下在超声波下搅拌至透明,配制成4%~10%的混合液,即为静电纺丝母液,其中壳聚糖含量质量百分比为10%~50%;将静电纺丝母液注入静电纺丝机中进行静电纺丝,得到胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜;
(3)三七粉的有效成分三七素的提取:在超声波条件下,将三七粉浸渍在10~20倍的95%乙醇溶液中15~20h,再浸渍在5~10倍的95%乙醇溶液中5~10h,静置后合并两次醇提液,留作它用;将残渣晾干,加入10~15倍的水浸提15~20h;再用2~5倍水浸渍6~10h,离心分离得到滤液,将滤液浓缩,干燥制得粗三七素粉末;
(4)胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备:在超声波条件下,将上述制得的胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜浸泡于选自聚乙二醇、海藻酸盐、透明质酸、凝血酶、纤维蛋白、或硫酸软骨素中的一种或几种中;然后再浸渍于采用上述方法制备的粗三七素中;最后经冷冻干燥,剂量为6~30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌,成型包装,即为成品。
2.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述实施的超声波频率均为20~40kHz,功率为50~120w。
3.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的Ⅰ型胶原纯度≥95%,分子量在30万左右。
4.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的静电纺丝条件为:电压15~25kv、溶液流量为0.01~0.3mm/min、接收距离为5~25cm;静电纺丝母液的表观粘度为10~120mPa.s,测定温度为20℃,转速为32r/min。
5.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合膜在制得后,浸泡在磷酸盐缓冲液中2天,除去残留在膜中的六氟异丙醇,期间隔4h换一次缓冲液。
6.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的壳聚糖脱乙酰度为60%~80%。
7.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的Ⅰ型胶原提取是以医用生物皮片为原料,在超声波的条件下,采用酸酶结合法提取Ⅰ型胶原的,这样得到的Ⅰ型胶原更纯净,提取率更高。
8.权利要求1所述的胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料的制备方法,其特征在于,所述的复合止血膜材料具备如下理化性能:
(1)氯化钠含量:≤3%(m/m);
(2)重金属含量:≤10μg/g(m/m);
(3)羟脯氨酸含量:不小于总蛋白含量的8%(m/m);
(4)细胞毒性:细胞毒性反应不大于1级。
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