CN103217487B - 一种利用双指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的分析方法 - Google Patents

一种利用双指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用双指纹图谱技术溯源进口梅洛葡萄酒产地的方法。方法中利用HPLC-MS建立进口梅洛葡萄酒中乙酸乙酯提取物的指纹图谱，利用GC-MS法建立进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的指纹图谱。结合两种指纹图谱技术利用中药指纹图谱评估软件进行数据处理能够对进口葡萄酒的产地进行溯源，并且其结果可以作为进口梅洛葡萄酒品质评定指标之一。本发明具有灵敏，准确，稳定，精密度高，重现性好等优点。

Description

一种利用双指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的分析方法
技术领域
本发明涉及一种葡萄酒HPLC-MS和GC-MS指纹图谱的分析方法，涉及的是一种对进口梅洛葡萄酒产地溯源和质量评定的方法，属于食品化学分析领域。 
背景技术
葡萄酒是世界性的酒精饮料，其历史可以追溯到7000多年前。葡萄酒在许多国家的经济中占有重要比例。葡萄酒由于含有水、糖、酒精、甘油、有机酸、酯类、多种矿物质等多达1000多种的有益物质而越来越被人们喜爱。葡萄酒的主产地主要分布于欧洲、美洲和澳大利亚等地，我国的主产区主要在山东烟台、河北昌黎、吉林四平、辽宁营口等地。近年来，受白酒涨价、年轻一代的饮食习惯改变等因素的影响，国内的葡萄酒的消费量急剧增加，从而也促进葡萄酒进口量显著增加近年来，进口葡萄酒在中国市场上迅速增长。我国巨大的市场潜力吸引了法国、德国、意大利、澳大利亚、智利、阿根廷等国家匍萄酒商纷纷进军中国，并在中国市场呈现出快速增长的势头，葡萄酒进口量以每年50％的速度增长。业内人士预计，到2020年时，中国葡萄酒的产销量将突破500万吨，中国将成为亚洲的葡萄酒中心。 
指纹图谱始于19世纪末20世纪初的犯罪学和法医学，是指物质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它是一种综合的，可量化的鉴定手段，具有“整体性”和“模糊性”的显著特点。目前已在环境保护、石油勘测、食品评价、中药质量控制和鉴定等领域得到广泛的应用。近年来，由于分析检测技术的快速发展和全社会对食品安全重视的加强，指纹图谱技术开始在食品领域中得到有效的应用。现今指纹图谱技术主要在转基因食品、酒类制品、果蔬产品、食用油和蓄产品中的应用较为广泛，其中尤以在酒类制品中应用的最为突出。 
葡萄酒由于多达1000中的有效成分，很难通过单一的检测方法进行产地溯源和质量评定。现今国内对葡萄酒指纹图谱的研究主要集中在葡萄酒香气成分上，但是单一的香气成分不足以对葡萄酒的品质进行全面的衡量，且产生的香气成分的特征指纹图谱差异性不强，无法有效的对葡萄酒产地和质量进行甄别。针对上述情况，本发明通过利用HPLC-MS法建立葡萄酒黄酮类物质成分的指纹图谱，利用GC-MS法建立进口葡萄酒香气成分的指纹图谱，通过两种指纹图谱对进口葡萄酒的产地进行溯源和品质评定。 
发明内容
本发明的目的是提供一种用GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的方法，可作为进口梅洛葡萄酒品质监管的指标之一，本发明通过比较世界上主 要生产梅洛葡萄酒地产区的葡萄酒样品，利用HPLC-MS建立进口葡萄酒中乙酸乙酯提取物的特征指纹图谱，利用GC-MS法建立进口葡萄酒二氯甲烷提取物的特征指纹图谱。建立的两种特征指纹图谱与葡萄酒指纹图谱库中的指纹图谱进行比较能够对进口梅洛葡萄酒的产地进行溯源。 
为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 
所述的进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物GC-MS标准指图谱，其共有峰30个，图谱总长度为39min，具体如下： 
1号峰异丁醇，平均保留时间6.294min； 
2号峰异戊醇，平均保留时间9.552min； 
3号峰3-羟基-2-丁酮，平均保留时间11.616min； 
4号峰乳酸乙酯，平均保留时间13.563min； 
5号峰正己醇，平均保留时间13.984min； 
6号峰1，3-二叔丁基苯，平均保留时间16.076min； 
7号峰2-辛醇，平均保留时间16.198min； 
8号峰辛酸乙酯，平均保留时间16.201min； 
9号峰乙酸，平均保留时间16.75min； 
10号峰2，3-丁二醇，D，L，平均保留时间19.103min； 
11号峰异丁酸，平均保留时间19.537min； 
12号峰2，3-丁二醇，Meso，平均保留时间19.829min； 
13号峰丙二醇，平均保留时间20.094min； 
14号峰4-羟基丁酸乙酰酯，平均保留时间20.594min； 
15号峰异戊酸，平均保留时间21.404min； 
16号峰丁二酸二乙酯，平均保留时间21.512min； 
17号峰十七烷，平均保留时间21.512min； 
18号峰3-甲硫基丙醇，平均保留时间22.204min； 
19号峰新葵酸，平均保留时间23.569min； 
20号峰己醇，平均保留时间24.115min； 
21号峰苯甲醇，平均保留时间24.555min； 
22号峰苯乙醇，平均保留时间25.068min； 
23号峰3-羟基己酸乙酯，平均保留时间26.768min； 
24号峰辛酸，平均保留时间26.946min； 
25号峰4-氧代-1，7庚二酸单乙酯，平均保留时间27.813min； 
26号峰N-乙酰甘氨酸，平均保留时间28.199min； 
27号峰四氢-5-氧代-2-呋喃羧酸，平均保留时间28.252min； 
28号峰2，4-二叔丁基苯酚，平均保留时间29.815min； 
29号峰4-甲硫基丁醇，平均保留时间30.021min； 
30号峰丁二酸单乙酯，平均保留时间30.68min； 
31号峰对羟基苯乙醇，平均保留时间38.346min； 
所述进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物GC-MS标准图谱的构建方法，按照下述步骤进行： 
(1)供试品的制备(2)气相色谱-质谱分析；(3)建立指纹图谱。 
其中所述供试品的制备过程如下：分别称取25g葡萄酒样品，于两个50ml具塞离心管中。各加入150μL 2-辛醇乙醇溶液(内标物，48μg/mL)，然后分别用15mL的二氯甲烷，涡旋混合2min，振摇10min，以4000r/min离心2分钟，取有机层；重复提取两次，合并有机层，有机层用无水硫酸钠脱水，在45℃的水浴中氮吹至1mL。 
其中所述的气相色谱-质谱分析，气相色谱条件：色谱柱：DB-WAX柱(30m×0.25mm×0.25μm)，或相当者。进样口温度为240℃，分流模式，分流比为：40∶1。柱温升温程序：初始温度40℃(保持3min)，以4℃/min的速度升至90℃(保持2分钟)，以8℃/min的速率升至240℃(保持6分钟)，总运行时间为39min。载气：高纯氦气(纯度＞99.999％)，恒流模式，流速为1ml/min。质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV；灯丝发射电流200μA离子源温度230℃；四级杆温度150℃；扫描质量范围：30～300amu；溶剂延迟时间为：1.5min。各组分经过NIST标准谱库相匹配NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配。 
其中所述的指纹图谱建立，将不同产地的梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS图谱进行比对，提取共有峰，组成进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS指纹图谱。 
所述的进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯萃取物标准图谱，其共有峰11个，图谱总长度60min，具体如下： 
1号峰没食子酸，平均保留时间3.701min； 
2号峰未知峰1，平均保留时间8.233min； 
3号峰未知峰2，平均保留时间11.438min； 
4号峰未知峰3，平均保留时间13.159min； 
5号峰香草酸，平均保留时间16.607min； 
6号峰咖啡酸，平均保留时间17.976min； 
7号峰丁香酸，平均保留时间19.178min； 
8号峰表儿茶酸，平均保留时间21.809min； 
9号峰对香豆酸，平均保留时间23.838min； 
10号峰水杨酸，平均保留时间25.024min； 
11号峰未知峰4，平均保留时间30.122min； 
12号峰香豆素，平均保留时间32.280min； 
13号峰未知峰5，平均保留时间32.983min； 
14号峰槲皮苷，平均保留时间35.330min； 
15号峰未知峰6，平均保留时间36.255min； 
16号峰杨梅酮，平均保留时间36.993min； 
17号峰反式-白藜芦醇，平均保留时间38.906min； 
18号峰未知峰7，平均保留时间52.554min； 
所述进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯萃取物HPLC-MS标准图谱的构建方法，按照下述步骤进行： 
(1)供试品的制备(2)液相色谱-质谱分析；(3)建立指纹图谱。 
其中所述供试品的制备过程如下：称取30g(精确至0.01g)葡萄酒样品至50mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸乙酯20mL，用垂直振荡器震荡提取10min，低温离心机4500r/min条件下离心10min，上清液转移至鸡心瓶中，下层溶液用乙酸乙酯再重复提取2次(每次20mL)，合并所有提取液，在40℃下减压浓缩至近干，用3mL甲醇超声溶解残渣，涡旋，过0.22μm微孔滤膜，备用。 
其中所述的液相色谱-质谱分析，色谱条件：色谱柱：MG II C18柱(150mm×2.0mm，5μm)；柱温：35℃；进样量：10μL；流速：0.25mL/min；检测波长：0～34min 280nm，34～38.5min 254nm，38.5～60min 280nm；洗脱方式：梯度洗脱，流动相A：乙腈，流动相B：水(pH＝3.0)，0～30min，A为3％～20％；30～45min，A为20％～30％；45～55min，A为30％，55～60minA为30％～3％。质谱条件：喷雾电压(Ispray Voltage)5.0KV，金属毛细管温度300℃，鞘气流速(Sheath Gas Flow Rate)28arb，辅助流(Aux Gas Flow Rate)19arb，采用负离子模式，扫描范围：m/z50-1200，源内***电压(Source fragmentation)：15V。 
其中所述的指纹图谱建立，将不同产地的梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS图谱进行比对，提取共有峰，组成进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS指纹图谱。 
本发明的优点如下： 
1、葡萄酒香气成分和单体酚是评定葡萄酒品质优劣的重要指标，本发明利用GC-MS建 立进口梅洛葡萄酒香气成分的指纹图谱，利用HPLC-MS建立了进口梅洛葡萄酒单体酚的指纹图谱。 
2、发明利用双指纹图谱对进口梅洛葡萄酒的产地进行溯源，结果可以作为评定进口梅洛葡萄酒的品质的指标。 
3、发明具有灵敏，准确，稳定，精密度高，重现性好等优点。 
附图说明：
图1为法国1号梅洛葡萄酒样品GC-MS色谱图； 
图2为法国1号梅洛葡萄酒样品HPLC-MS色谱图； 
图3为美国1号梅洛葡萄酒样品GC-MS色谱图； 
图4为美国1号梅洛葡萄酒样品HPLC-MS色谱图； 
图5为澳大利亚1号梅洛葡萄酒样品GC-MS色谱图； 
图6为澳大利亚1号梅洛葡萄酒样品HPLC-MS色谱图； 
图7为智利1号梅洛葡萄酒样品GC-MS色谱图； 
图8为智利1号梅洛葡萄酒样品HPLC-MS色谱图； 
图9为南非1号梅洛葡萄酒样品GC-MS色谱图； 
图10为南非1号梅洛葡萄酒样品HPLC-MS色谱图。 
具体实施方式
本发明所使用了Agilent 7693气质联用仪建立了进口梅洛葡萄酒的二氯甲烷提取物特征指纹图谱，使用Agilent 1200HPLC仪(含DAD检测器)与ThermoFisher Fleet离子阱质谱仪联用建立进口梅洛葡萄酒的乙酸乙酯提取物的特征指纹图谱。 
本发明所使用的进口梅洛葡萄酒由中山市天龙贸易有限公司、中山市中山市辉达经贸有限公司和中山市粤粮商贸有限公司提供。 
下面结合实施例和附图对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施不限于此。 
实施例1法国进口梅洛葡萄酒双指纹图谱的建立方法 
法国进口梅洛葡萄酒GC-MS指纹图谱的建立 
1、供试品的制备 
分别称取25g葡萄酒样品，于两个50ml具塞离心管中。各加入150μL2-辛醇乙醇溶液(内标物，48μL/mL)，然后分别用15mL的二氯甲烷，涡旋混合2min，垂直振摇10min，以4000r/min离心2分钟，取有机层；重复提取两次，合并有机层，有机层用无水硫酸钠脱水，在45℃的水浴中氮吹至1mL。 
气相色谱条件：色谱柱：DB-WAX柱(30m×0.25mm×0.25μm)，或相当者。进样口温度为240℃，分流模式，分流比为：40∶1。柱温升温程序：初始温度40℃(保持3min)，以4℃/min的速度升至90℃(保持2分钟)，以8℃/min的速率升至240℃(保持6分钟)，总运行时间为39min。载气：高纯氦气(纯度＞99.999％)，恒流模式，流速为1ml/min。 
质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV；灯丝发射电流200μA离子源温度230℃；四级杆温度150℃；扫描质量范围：30～300amu；溶剂延迟时间为：1.5min。各组分经过NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配。 
将不同产区梅洛葡萄酒GC-MS图谱进行比对，提取共有峰，组成进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS指纹图谱(见图1)。 
法国进口梅洛葡萄酒HPLC-MS指纹图谱的建立 
供试品的制备 
称取30g(精确至0.01g)葡萄酒样品至50mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸乙酯20mL，用垂直振荡器震荡提取10min，低温离心机4500r/min条件下离心10min，上清液转移至鸡心瓶中，下层溶液用乙酸乙酯再重复提取2次(每次20mL)，合并所有提取液，在40℃下减压浓缩至近干，用3mL甲醇超声溶解残渣，涡旋，过0.22μm微孔滤膜，备用。 
色谱条件：色谱柱：MG II C18柱(150mm×2.0mm，5μm)；柱温：35℃；进样量：10μL；流速：0.25mL/min；检测波长：0～34min 280nm，34～38.5min 254nm，38.5～60min280nm；洗脱方式：梯度洗脱，流动相A：乙腈，流动相B：水(pH＝3.0)，0～30min，A为3％～20％；30～45min，A为20％～30％；45～55min，A为30％，55～60minA为30％～3％。 
质谱条件：喷雾电压(Ispray Voltage)5.0KV，金属毛细管温度300℃，鞘气流速(SheathGas Flow Rate)28arb，辅助流(Aux Gas Flow Rate)19arb，采用负离子模式，扫描范围：m/z50-1200，源内***电压(Source fragmentation)：15V。 
将不同产区梅洛葡萄酒HPLC-MS图谱进行比对，提取共有峰，组成进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS指纹图谱(见图2)。 
进口梅洛葡萄酒产地溯源 
建立的GC-MS特征指纹图谱和HPLC-MS特征指纹图谱，通过中药指纹图谱评估软件与指纹图谱库中的样品进行对比，先根据GC-MS特征指纹图谱评估，再根据HPLC-MS特征指纹图谱进行评估，最终确定法国进口梅洛葡萄酒的产地。 
实施例2检测10批次不同产地的进口梅洛葡萄酒的双指纹图谱 
取10批次的进口梅洛葡萄酒样品，按实施例1的方法进行检测，得到10批次样品的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱，部分图谱见图3-10所示，通过10批次GC-MS指 纹图谱和HPLC-MS指纹图谱的比较，提取共有峰，确定其特征共有峰。 
本发明的原理是根据进口梅洛葡萄酒二氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物，建立起进口梅洛葡萄酒的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上溯源进口梅洛葡萄酒的产地和评定其品质。 
依据国家药品监督管理局对建立指纹图谱的要求，经分析表明所得的进口梅洛葡萄酒的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱的差异较小，达到了建立指纹图谱的技术要求。 

Claims (2)

1.一种利用双指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的方法，其特征是：
(1)、将进口梅洛melot葡萄酒样品经过液-液萃取，二氯甲烷萃取物经过GC-MS分析，得到GC-MS特征指纹图谱，其生成GC-MS特征图谱的仪器条件是：色谱柱：DB-WAX柱30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度为240℃；分流模式，分流比为：40∶1；柱温升温程序：初始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至90℃，保持2分钟，以8℃/min的速率升至240℃，保持6分钟，总运行时间为39min；载气：纯度＞99.999％高纯氦气；恒流模式，流速为1ml/min；质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70eV；灯丝发射电流200μA离子源温度230℃；四级杆温度150℃；扫描质量范围：30～300amu；溶剂延迟时间为：1.5min；各组分经过NIST标准谱库相匹配NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配；
(2)、将进口梅洛melot葡萄酒样品经过萃取，乙酸乙酯萃取物经过HPLC-DAD-MS分析得到HPLC-MS特征指纹图谱；其生成HPLC-DAD-MS特征图谱的仪器条件是：色谱条件：色谱柱：MG II C18柱150mm×2.0mm，5μm；柱温：35℃；进样量：10μL；流速：0.25mL/min；检测波长：0～34min280nm，34～38.5min254nm，38.5～60min280nm；洗脱方式：梯度洗脱，流动相A：乙腈，流动相B：pH＝3.0水，0～30min，A为3％～20％；30～45min，A为20％～30％；45～55min，A为30％，55～60minA为30％～3％；质谱条件：喷雾电压5.0KV，金属毛细管温度300℃，鞘气流速28arb，辅助流19arb，采用负离子模式，扫描范围：m/z50-1200，源内***电压：15V；
(3)、将(1)和(2)中得到的进口梅洛melot葡萄酒样品双指纹图谱与谱库中双指纹图谱进行比较最终溯源葡萄酒的产地。
2.根据权利要求1所述的利用双指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的方法，其特征是：对进口梅洛葡萄酒产地的溯源评估是通过对进口梅洛葡萄酒GC-MS特征图谱进行产地聚类分析，粗筛出可能的产地，再对进口梅洛葡萄酒HPLC-DAD-MS特征指纹图谱进行聚类分析，最终确定进口梅洛葡萄酒产地。
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