发明内容
本发明的目的是提供一种用GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱溯源进口梅洛葡萄酒产地的方法,可作为进口梅洛葡萄酒品质监管的指标之一,本发明通过比较世界上主 要生产梅洛葡萄酒地产区的葡萄酒样品,利用HPLC-MS建立进口葡萄酒中乙酸乙酯提取物的特征指纹图谱,利用GC-MS法建立进口葡萄酒二氯甲烷提取物的特征指纹图谱。建立的两种特征指纹图谱与葡萄酒指纹图谱库中的指纹图谱进行比较能够对进口梅洛葡萄酒的产地进行溯源。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
所述的进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物GC-MS标准指图谱,其共有峰30个,图谱总长度为39min,具体如下:
1号峰异丁醇,平均保留时间6.294min;
2号峰异戊醇,平均保留时间9.552min;
3号峰3-羟基-2-丁酮,平均保留时间11.616min;
4号峰乳酸乙酯,平均保留时间13.563min;
5号峰正己醇,平均保留时间13.984min;
6号峰1,3-二叔丁基苯,平均保留时间16.076min;
7号峰2-辛醇,平均保留时间16.198min;
8号峰辛酸乙酯,平均保留时间16.201min;
9号峰乙酸,平均保留时间16.75min;
10号峰2,3-丁二醇,D,L,平均保留时间19.103min;
11号峰异丁酸,平均保留时间19.537min;
12号峰2,3-丁二醇,Meso,平均保留时间19.829min;
13号峰丙二醇,平均保留时间20.094min;
14号峰4-羟基丁酸乙酰酯,平均保留时间20.594min;
15号峰异戊酸,平均保留时间21.404min;
16号峰丁二酸二乙酯,平均保留时间21.512min;
17号峰十七烷,平均保留时间21.512min;
18号峰3-甲硫基丙醇,平均保留时间22.204min;
19号峰新葵酸,平均保留时间23.569min;
20号峰己醇,平均保留时间24.115min;
21号峰苯甲醇,平均保留时间24.555min;
22号峰苯乙醇,平均保留时间25.068min;
23号峰3-羟基己酸乙酯,平均保留时间26.768min;
24号峰辛酸,平均保留时间26.946min;
25号峰4-氧代-1,7庚二酸单乙酯,平均保留时间27.813min;
26号峰N-乙酰甘氨酸,平均保留时间28.199min;
27号峰四氢-5-氧代-2-呋喃羧酸,平均保留时间28.252min;
28号峰2,4-二叔丁基苯酚,平均保留时间29.815min;
29号峰4-甲硫基丁醇,平均保留时间30.021min;
30号峰丁二酸单乙酯,平均保留时间30.68min;
31号峰对羟基苯乙醇,平均保留时间38.346min;
所述进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物GC-MS标准图谱的构建方法,按照下述步骤进行:
(1)供试品的制备(2)气相色谱-质谱分析;(3)建立指纹图谱。
其中所述供试品的制备过程如下:分别称取25g葡萄酒样品,于两个50ml具塞离心管中。各加入150μL 2-辛醇乙醇溶液(内标物,48μg/mL),然后分别用15mL的二氯甲烷,涡旋混合2min,振摇10min,以4000r/min离心2分钟,取有机层;重复提取两次,合并有机层,有机层用无水硫酸钠脱水,在45℃的水浴中氮吹至1mL。
其中所述的气相色谱-质谱分析,气相色谱条件:色谱柱:DB-WAX柱(30m×0.25mm×0.25μm),或相当者。进样口温度为240℃,分流模式,分流比为:40∶1。柱温升温程序:初始温度40℃(保持3min),以4℃/min的速度升至90℃(保持2分钟),以8℃/min的速率升至240℃(保持6分钟),总运行时间为39min。载气:高纯氦气(纯度>99.999%),恒流模式,流速为1ml/min。质谱条件:电子轰击离子源(EI);电子能量70eV;灯丝发射电流200μA离子源温度230℃;四级杆温度150℃;扫描质量范围:30~300amu;溶剂延迟时间为:1.5min。各组分经过NIST标准谱库相匹配NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配。
其中所述的指纹图谱建立,将不同产地的梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS图谱进行比对,提取共有峰,组成进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS指纹图谱。
所述的进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯萃取物标准图谱,其共有峰11个,图谱总长度60min,具体如下:
1号峰没食子酸,平均保留时间3.701min;
2号峰未知峰1,平均保留时间8.233min;
3号峰未知峰2,平均保留时间11.438min;
4号峰未知峰3,平均保留时间13.159min;
5号峰香草酸,平均保留时间16.607min;
6号峰咖啡酸,平均保留时间17.976min;
7号峰丁香酸,平均保留时间19.178min;
8号峰表儿茶酸,平均保留时间21.809min;
9号峰对香豆酸,平均保留时间23.838min;
10号峰水杨酸,平均保留时间25.024min;
11号峰未知峰4,平均保留时间30.122min;
12号峰香豆素,平均保留时间32.280min;
13号峰未知峰5,平均保留时间32.983min;
14号峰槲皮苷,平均保留时间35.330min;
15号峰未知峰6,平均保留时间36.255min;
16号峰杨梅酮,平均保留时间36.993min;
17号峰反式-白藜芦醇,平均保留时间38.906min;
18号峰未知峰7,平均保留时间52.554min;
所述进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯萃取物HPLC-MS标准图谱的构建方法,按照下述步骤进行:
(1)供试品的制备(2)液相色谱-质谱分析;(3)建立指纹图谱。
其中所述供试品的制备过程如下:称取30g(精确至0.01g)葡萄酒样品至50mL聚四氟乙烯离心管中,加入乙酸乙酯20mL,用垂直振荡器震荡提取10min,低温离心机4500r/min条件下离心10min,上清液转移至鸡心瓶中,下层溶液用乙酸乙酯再重复提取2次(每次20mL),合并所有提取液,在40℃下减压浓缩至近干,用3mL甲醇超声溶解残渣,涡旋,过0.22μm微孔滤膜,备用。
[0012]其中所述的液相色谱-质谱分析,色谱条件:色谱柱:MG II C18柱(150mm×2.0mm,5μm);柱温:35℃;进样量:10μL;流速:0.25mL/min;检测波长:0~34min 280nm,34~38.5min 254nm,38.5~60min 280nm;洗脱方式:梯度洗脱,流动相A:乙腈,流动相B:水(pH=3.0),0~30min,A为3%~20%;30~45min,A为20%~30%;45~55min,A为30%,55~60minA为30%~3%。质谱条件:喷雾电压(Ispray Voltage)5.0KV,金属毛细管温度300℃,鞘气流速(Sheath Gas Flow Rate)28arb,辅助流(Aux Gas Flow Rate)19arb,采用负离子模式,扫描范围:m/z50-1200,源内***电压(Source fragmentation):15V。
其中所述的指纹图谱建立,将不同产地的梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS图谱进行比对,提取共有峰,组成进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS指纹图谱。
本发明的优点如下:
1、葡萄酒香气成分和单体酚是评定葡萄酒品质优劣的重要指标,本发明利用GC-MS建 立进口梅洛葡萄酒香气成分的指纹图谱,利用HPLC-MS建立了进口梅洛葡萄酒单体酚的指纹图谱。
2、发明利用双指纹图谱对进口梅洛葡萄酒的产地进行溯源,结果可以作为评定进口梅洛葡萄酒的品质的指标。
3、发明具有灵敏,准确,稳定,精密度高,重现性好等优点。
具体实施方式
本发明所使用了Agilent 7693气质联用仪建立了进口梅洛葡萄酒的二氯甲烷提取物特征指纹图谱,使用Agilent 1200HPLC仪(含DAD检测器)与ThermoFisher Fleet离子阱质谱仪联用建立进口梅洛葡萄酒的乙酸乙酯提取物的特征指纹图谱。
本发明所使用的进口梅洛葡萄酒由中山市天龙贸易有限公司、中山市中山市辉达经贸有限公司和中山市粤粮商贸有限公司提供。
下面结合实施例和附图对本发明的具体实施作进一步说明,但本发明的实施不限于此。
实施例1法国进口梅洛葡萄酒双指纹图谱的建立方法
法国进口梅洛葡萄酒GC-MS指纹图谱的建立
1、供试品的制备
分别称取25g葡萄酒样品,于两个50ml具塞离心管中。各加入150μL2-辛醇乙醇溶液(内标物,48μL/mL),然后分别用15mL的二氯甲烷,涡旋混合2min,垂直振摇10min,以4000r/min离心2分钟,取有机层;重复提取两次,合并有机层,有机层用无水硫酸钠脱水,在45℃的水浴中氮吹至1mL。
气相色谱条件:色谱柱:DB-WAX柱(30m×0.25mm×0.25μm),或相当者。进样口温度为240℃,分流模式,分流比为:40∶1。柱温升温程序:初始温度40℃(保持3min),以4℃/min的速度升至90℃(保持2分钟),以8℃/min的速率升至240℃(保持6分钟),总运行时间为39min。载气:高纯氦气(纯度>99.999%),恒流模式,流速为1ml/min。
质谱条件:电子轰击离子源(EI);电子能量70eV;灯丝发射电流200μA离子源温度230℃;四级杆温度150℃;扫描质量范围:30~300amu;溶剂延迟时间为:1.5min。各组分经过NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配。
将不同产区梅洛葡萄酒GC-MS图谱进行比对,提取共有峰,组成进口梅洛葡萄酒二氯甲烷提取物的GC-MS指纹图谱(见图1)。
法国进口梅洛葡萄酒HPLC-MS指纹图谱的建立
供试品的制备
称取30g(精确至0.01g)葡萄酒样品至50mL聚四氟乙烯离心管中,加入乙酸乙酯20mL,用垂直振荡器震荡提取10min,低温离心机4500r/min条件下离心10min,上清液转移至鸡心瓶中,下层溶液用乙酸乙酯再重复提取2次(每次20mL),合并所有提取液,在40℃下减压浓缩至近干,用3mL甲醇超声溶解残渣,涡旋,过0.22μm微孔滤膜,备用。
色谱条件:色谱柱:MG II C18柱(150mm×2.0mm,5μm);柱温:35℃;进样量:10μL;流速:0.25mL/min;检测波长:0~34min 280nm,34~38.5min 254nm,38.5~60min280nm;洗脱方式:梯度洗脱,流动相A:乙腈,流动相B:水(pH=3.0),0~30min,A为3%~20%;30~45min,A为20%~30%;45~55min,A为30%,55~60minA为30%~3%。
质谱条件:喷雾电压(Ispray Voltage)5.0KV,金属毛细管温度300℃,鞘气流速(SheathGas Flow Rate)28arb,辅助流(Aux Gas Flow Rate)19arb,采用负离子模式,扫描范围:m/z50-1200,源内***电压(Source fragmentation):15V。
将不同产区梅洛葡萄酒HPLC-MS图谱进行比对,提取共有峰,组成进口梅洛葡萄酒乙酸乙酯提取物的HPLC-MS指纹图谱(见图2)。
进口梅洛葡萄酒产地溯源
建立的GC-MS特征指纹图谱和HPLC-MS特征指纹图谱,通过中药指纹图谱评估软件与指纹图谱库中的样品进行对比,先根据GC-MS特征指纹图谱评估,再根据HPLC-MS特征指纹图谱进行评估,最终确定法国进口梅洛葡萄酒的产地。
实施例2检测10批次不同产地的进口梅洛葡萄酒的双指纹图谱
取10批次的进口梅洛葡萄酒样品,按实施例1的方法进行检测,得到10批次样品的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱,部分图谱见图3-10所示,通过10批次GC-MS指 纹图谱和HPLC-MS指纹图谱的比较,提取共有峰,确定其特征共有峰。
本发明的原理是根据进口梅洛葡萄酒二氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物,建立起进口梅洛葡萄酒的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱,从色谱的整体面貌特征上溯源进口梅洛葡萄酒的产地和评定其品质。
依据国家药品监督管理局对建立指纹图谱的要求,经分析表明所得的进口梅洛葡萄酒的GC-MS指纹图谱和HPLC-MS指纹图谱的差异较小,达到了建立指纹图谱的技术要求。