CN103215250A - 一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法 - Google Patents

Abstract

一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法,包括以下步骤：菌株活化培养、菌株菌丝固体培养、液体菌丝体培养、菌丝体酶解、原生质体亚硝基胍（NTG）诱变、原生质体再生培养、再生菌继代培养、发酵培养，过滤得到菌丝体，进一步冲洗菌丝，测定菌丝体虫草素含量，将产虫草素含量较高的菌株保藏、遗传稳定性测定等过程，提高蛹虫草虫草素含量。

Description

一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法

技术领域

本发明属于微生物菌种的诱变选育技术领域，特别涉及一种原生质体亚硝基胍诱变选育虫草素高产菌株的方法，依据此方法可以选育获得高产虫草素的菌株。

背景技术

[0002] 蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名蛹草、北冬虫夏草、北虫草，为子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、冬虫夏草属真菌，是蛹草拟青霉（Peacilomyces militaris）的有性型，其功效与冬虫夏草类似，在药化、药理和临床试验中证明与冬虫夏草十分相似，在功能食品、医药和生物学技术方面有很好的实用价值。蛹虫草作为新资源食品和中药新药（中药国药准字Z20030034/35）已获***和国家食品药品监督管理局批准进入市场，在日本、韩国等已将蛹虫草作为冬虫夏草的代用品应用于药品、保健食品的开发。蛹虫草中的药效成分主要有虫草素、腺苷、虫草酸、多糖等，同时含有多种人体必需氨基酸和微量元素。

虫草素（Cordycepin）即3’-脱氧腺苷，又称虫草菌素、蛹虫草菌素。它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，是蛹虫草以腺苷为直接前体合成的一种重要次生代谢产物。虫草素的分子式为C₁₀H_l3N₅O₃，分子量为251Da，熔点为230～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、***和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm。大量研究表明，虫草素具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗白血病、降血糖、降血脂等方面的作用，在治疗白血病方面已由FDA批准进入了临床研究。虫草素主要来源于蛹虫草子实体，但由于固体栽培蛹虫草周期长，子实体生长缓慢，产量低，虫草素含量更低，导致其生产成本过高，市场中只有少量的虫草素供应，市场价格昂贵。随着虫草素在医药保健领域的应用和有关产品的开发，市场需求量大增。故蛹虫草产量和虫草素的含量已经成为制约虫草素进一步研究和开发利用的瓶颈。目前蛹虫草已实现了大规模深层液体通气发酵，但因自然界原始菌株的虫草素产量往往不高，虫草素的单位产量仍然很低，这大大制约了其开发应用。故开展高产虫草素蛹虫草菌株的诱变，提高虫草素的含量有重要意义。

诱变育种现已成为提高蛹虫草虫草素含量的普遍应用的育种方法之一，常规诱变育种多采用物理诱变如紫外线等或化学诱变剂如硫酸二乙酯、氯化锂等对菌丝或孢子进行诱变处理，因这类诱变方法因孢子或菌丝对诱变剂敏感性差、单孢子分离困难、选育耗时长，难以获得理想的诱变效果。而原生质体作为诱变材料，具有较多优越性：一是去壁后的原生质体，诱变剂更容易进入，可以快速作用于细胞核DNA，诱变效果明显；二是原生质体彼此分离，更有利于同诱变剂接触；三是原生质体在释放过程中多为单核，克服了菌丝多核的缺点，诱变后不易发生分离现象。因此本发明采用亚硝基胍对制备的蛹虫草原生质进行高效诱变，取得了显著的效果。

发明内容

本发明针对蛹虫草常规育种中技术上的上述缺陷，提供一种设备简单、操作方便、成本低、诱变效率高的蛹虫草诱变方法，采用该方法诱变，可以提高蛹虫草的诱变效率并降低诱变成本。为实现上述目的，本发明所述的蛹虫草菌株诱变选育方法，包括以下步骤：

（1）菌株活化培养 将实验室保藏的蛹虫草菌株转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养。

（2）菌株菌丝固体培养 从活化好的斜面试管上刮取培养好的菌丝体接种于蛹虫草固体琼脂平板培养基中培养菌丝。

（3）液体菌丝体培养 从培养好的菌丝固体培养基上取菌块接种到液体培养基中，进行恒温震荡培养。

（4）菌丝体酶解 所用的原生质体稳定剂为0.6 mol/L的MgS0₄·7H₂0和相同浓度的甘露醇溶液按照体积比1:1混合后的溶液；

菌丝酶裂解液配制方法为：分别称取蜗牛酶及纤维素酶，溶解于0.6mol/L的渗透压稳定剂中，使两种酶的浓度分别达到0.6%和1.2%(W/V)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，然后按照2:1的体积比混合备用；

培养好的菌丝体无菌滤纸过滤，并置于无菌离心管中，用以上渗透压稳定溶液洗涤3次，将多余的水分用无菌滤纸吸干；

菌丝的具体酶解方法为：按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1.5mL酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于26℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育2-4h。中间用移液枪轻轻吹打悬浮。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000-4000r/min离心5-8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。

（5）原生质体亚硝基胍（NTG）诱变 用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为2mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床上转速80r/min 26℃处理10-60min后，将处理液3000-4000r/min离心5-10min，弃去上清，用pH6.5、0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应。

（6）原生质体再生培养 诱变后的原生质体进行系列梯度稀释，吸取200μL/皿涂布于再生固体培养基平板上进行再生培养。培养条件为：23-26℃避光恒温培养6～8d。原生质体再生培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5g，KH₂P0₄ 2g，MgS0₄·7H₂0 1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

（7）再生菌继代培养 将原生质体再生培养基上生长较快的菌落接到菌丝固体平板培养基上，进行传代培养；菌丝固体平板培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 2g，MgS0₄·7H₂O 1g，琼脂粉15g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

（8）发酵培养 获得的第三代诱变菌株接种到种子液培养基中，菌种培养条件为：250mL三角瓶中装培养基30mL，23-26℃ 160r/min震荡培养2-3d。种子培养基配方：葡萄糖40g、蛋白胨8g、(NH₄)₂S0₄ 6g、K₂HP0₄ 0.8g、KH₂P0₄ 1.6g、MgS0₄·7H₂0 0.5g、ZnS0₄·7H₂0 0.04g、FeS0₄·7H₂0 0.03g、酵母粉4g，加水定容至lL，pH 6.8，121℃灭菌20min。种子培养好后，按照6%的接种量接种种子液到发酵培养基中（100ml/1000ml三角瓶），23-26℃ 160r/min震荡培养4-6d。

（9）过滤得到菌丝体，进一步冲洗菌丝，测定菌丝体虫草素含量，将产虫草素含量较高的菌株保藏。

（10）遗传稳定性测定 将保藏的虫草素高产突变菌株连续传代15代，每代培养6d，每代进行液体发酵，收集发酵液并对发酵原液进行预处理，分离菌丝体和发酵液，检测菌丝体中及发酵液上清中虫草素含量，考察突变菌株的遗传稳定性。挑选遗传稳定性的菌株，转接斜面保藏。

(11) 本发明培养蛹虫草菌株的培养基，其特征在于是由以下药物按重量份数比制成液体发酵培养基：可溶性淀粉20g、葡萄糖20g、蔗糖10g、大豆蛋白胨15、硫酸铵8g、酵母提取物6g、KH₂P04 0.8g、MgS0₄·7H₂0 0.75g、ZnS0₄·7H₂0 0.08 g、FeS0₄·7H₂0 0.04g、VB1 0.18g，加水定容至1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。

本发明所述的蛹虫草诱变高产虫草素技术与现有技术相比，有如下优点：

1）本发明采用亚硝基胍诱变蛹虫草原生质体产生高产虫草素的诱变菌株，诱变仪器设备简单、可操作性强，亚硝基胍对原生质体诱变效果显著；

2）经过诱变后，获得的高产菌株蛹虫草虫草素含量大幅度提高；诱变菌株菌丝体及发酵液中虫草素含量与原始出发菌株相比均有显著提高，其中，菌丝体中虫草素含量为22mg/g，是原始出发菌株的3.2倍；发酵液上清中虫草素含量为1561mg/L，为出发原始菌株的4.3倍；

3）诱变获得的高产菌株经过15次以上的连续传代培养，每代液体发酵培养，均测定有虫草素含量。诱变菌株性状稳定，活性成分产量不退化，具较好的遗传稳定性；

4）本发明获得的诱变菌株可以以廉价的农副产品作为培养基，能够大幅度降低培养基成本；液体发酵时间周期缩短，发酵条件更易于发酵控制，解决了固体发酵培养劳动强度大、发酵周期长的缺点，具备优异的工业化生产前景。

具体实施方式

实施例 1 ：蛹虫草突变株的诱变和选育方法

（1）菌株活化培养 将实验室保藏的蛹虫草菌株转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，23-26℃恒温静置培养4～5d。按照如上方法菌株活化2次；PDA固体斜面培养基同菌丝固体平板培养基，其配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 2g，MgS0₄·7H₂O 1g，琼脂粉15g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

（2）菌株菌丝体制备 从活化好的斜面试管上刮取培养好的菌丝体接种于蛹虫草菌丝固体平板培养基中，23-26℃恒温静置培养6～8d；菌丝培养好后，用于接种液体培养基。

（3）液体菌丝体培养 从培养好的菌丝固体平板培养基上取菌丝块接种到装有30 mL菌丝培养基的250mL锥形瓶中，23-26℃，160 r/min进行恒温震荡培养2-3d。菌丝液体培养基配方：葡萄糖30g、蛋白胨8g、(NH₄)₂S0₄ 6g、KH₂P0₄ 1.6g、MgS0₄·7H₂0 0.5g、FeS0₄·7H₂0 0.03g、酵母粉4g，加水定容至lL，pH 6.8，121℃灭菌20min。

(4) 原生质体制备 将MgS0₄·7H₂0、甘露醇溶解于双蒸水中配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用。配制裂解酶液：分别称取蜗牛酶及纤维素酶，溶解于0.6mol/L的渗透压稳定剂中，使两种酶的浓度分别达到0.6%和1.2%(W/V)，0.22nm微孔滤膜过滤除菌，然后按照2:1的体积比混合备用。培养好的菌丝体无菌滤纸过滤，并置于无菌离心管中，用以上渗透压稳定溶液洗涤3次，将多余的水分用无菌滤纸吸干。按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1.5mL酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于26℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育2-4h。中间用移液枪轻轻吹打悬浮。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000-4000r/min离心5-8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。

（5）原生质体诱变 原生质体亚硝基胍NTG诱变 用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为2 mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速80r/min，26℃处理10-60min后，将处理液3000-4000r/min离心5-10min，弃去上清，用pH6.5，0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应。

（6）原生质体再生培养 诱变后的原生质体进行系列梯度稀释。吸取200μL/皿涂布于再生固体培养基平板上进行再生培养。原生质体再生培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5g，KH₂P0₄ 2g，MgS0₄·7H₂0 1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；培养条件为：23-26℃避光恒温培养6-8d。将在原生质体再生培养基上生长较快的菌落接到菌丝固体平板培养基上，23-26℃恒温培养4-6d，得到第一代诱变菌株；再将第一代诱变菌株接到以上培养基中，按照第一代培养的方法培养得到第二代诱变菌株；继续转接得到第三代诱变菌株。

（7）发酵培养 获得的第三代诱变菌株接种到液体发酵培养基中（30mL／250mL三角瓶)，23-26℃ 160r/min震荡培养2-3d，然后按照6%的接种量接种种子液到发酵培养基中（100ml/1000ml三角瓶）（发酵培养基的配方为：液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20g、葡萄糖20g、蔗糖10g、大豆蛋白胨15、硫酸铵8g、酵母提取物6g、KH₂P04 0.8g、MgS0₄·7H₂0 0.75g、ZnS0₄·7H₂0 0.08 g、FeS0₄·7H₂0 0.04g、VB1 0.18g，加水定容至1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。），23-26℃ 160r/min震荡培养4-6d。过滤得到菌丝体，进一步冲洗菌丝，测定菌丝体虫草素含量，将产虫草素含量较高的菌株保藏。

实施例 2 活性成分的提取及含量的测定

发酵获得的菌丝体冷冻干燥，粉碎过60目筛，制备供试样品。称取蛹虫草菌丝体干粉0.1g，加入5mL蒸馏水，超声破碎20min，80℃水浴浸提3h，8000g/min离心10min，取上清测定菌丝体虫草素含量。发酵液中的虫草素含量测定方法：样品适当稀释，0.45 m微孔过滤后HPLC测定。

采用HPLC法测定蛹虫草菌丝体中虫草素含量，使用日本岛津公司的高效液相色谱仪，大连依利特的Hypersil C18分析柱，5μm，4.6mm×250mm，Sigma公司的虫草素标准品。上机条件：流动相0.01mol/L的KH₂PO₄:甲醇 =90:10，检测波长：258nm；流速：0.8 mL/min 柱温：40℃，进样量20μl，虫草素对照品浓度：4 mg/L；

样品浓度=（样品峰面积/标准品峰面积）×标准品浓度×稀释倍数

实施例 3 遗传稳定性考察

遗传稳定性测定 将保藏的虫草素高产突变菌株连续传代12代，每代培养6d，每代进行液体发酵，收集发酵液并对发酵原液进行预处理，过滤分离菌丝球，收集菌丝体和发酵液上清，分别检测发酵液上清及菌丝体中虫草素的含量，考察突变菌株的遗传稳定性。实验证明，诱变后菌株的正突变率为7-16%。其中活性成分整体产量较高的诱变突变菌株经过多次发酵并发酵验证，菌丝体虫草素均与传代一次的发酵水平相同，菌丝体中虫草素含量为22mg/g，是原始出发菌株的3.2倍；发酵液上清中虫草素含量为1561mg/L，为出发原始菌株的4.3倍。将该遗传稳定性的菌株，转接斜面保藏。

实施例 4 蛹虫草诱变突变菌株发酵培养基及发酵条件

诱变筛选后得到的菌株试管斜面活化2次后，刮取菌丝转接到菌丝固体平板培养基上，23-26℃培养6-8d。菌丝固体平板培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 2g，MgS0₄·7H₂O 1g，琼脂粉15g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；菌丝培养好后，再次取菌丝转接到发酵种子液培养基中，250ml三角瓶装液量30ml，23-26℃、160r/min摇床震荡培养2-3d。发酵培养基(种子培养基)：葡萄糖40g、蛋白胨8g、(NH₄)₂S0₄ 6g、K₂HP0₄ 0.8g、KH₂P0₄ 1.6g、MgS0₄·7H₂0 0.5g、ZnS0₄·7H₂0 0.04g、FeS0₄·7H₂0 0.03g、酵母粉4g，加水定容至lL，pH 6.8，121℃灭菌20min。发酵种子液培养好后，按照6%的接种量，将种子液接到液体发酵培养基中，1000ml三角瓶装液量200ml，23-26℃、160r/min摇床震荡培养4-6d。液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20g、葡萄糖20g、蔗糖10g、大豆蛋白胨15、硫酸铵8g、酵母提取物6g、KH₂P04 0.8g、MgS0₄·7H₂0 0.75g、ZnS0₄·7H₂0 0.08 g、FeS0₄·7H₂0 0.04g、VB1 0.18g，加水定容至1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。

Claims (2)

1.一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法，包括以下步骤：（1）菌株活化培养；（2）菌株菌丝固体培养；（3）液体菌丝体培养；（4）菌丝体酶解；（5）原生质体亚硝基胍（NTG）诱变；（6）原生质体再生培养；（7）再生菌继代培养；（8）发酵培养；（9）过滤得到菌丝体；（10）遗传稳定性测定；

其特征在于：

（1）菌株活化培养 将实验室保藏的蛹虫草菌株转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，23-26℃恒温静置培养4～5d；按照如上方法菌株活化2次；PDA固体斜面培养基同菌丝固体平板培养基，其配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 2g，MgS0₄·7H₂O 1g，琼脂粉15g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；

（2）菌株菌丝固体培养 从活化好的斜面试管上刮取培养好的菌丝体接种于蛹虫草菌丝固体平板培养基中，23-26℃恒温静置培养6～8d；菌丝培养好后，用于接种液体培养基；

（3）液体菌丝体培养 从培养好的菌丝固体平板培养基上取菌丝块接种到装有30 mL菌丝培养基的250mL锥形瓶中，23-26℃，160 r/min进行恒温震荡培养2-3d；

菌丝液体培养基配方：葡萄糖30g、蛋白胨8g、(NH₄)₂S0₄ 6g、KH₂P0₄ 1.6g、MgS0₄·7H₂0 0.5g、FeS0₄·7H₂0 0.03g、酵母粉4g，加水定容至lL，pH 6.8，121℃灭菌20min；

(4) 菌丝体酶解 a.原生质体制备：将MgS0₄·7H₂0、甘露醇溶解于双蒸水中配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用；

b．配制裂解酶液：分别称取蜗牛酶及纤维素酶，溶解于0.6mol/L的渗透压稳定剂中，使两种酶的浓度分别达到0.6%和1.2%(W/V)，0.22nm微孔滤膜过滤除菌，然后按照2:1的体积比混合备用；培养好的菌丝体无菌滤纸过滤，并置于无菌离心管中，用以上渗透压稳定溶液洗涤3次，将多余的水分用无菌滤纸吸干，按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1.5mL酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于26℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育2-4h，中间用移液枪轻轻吹打悬浮；酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000-4000r/min离心5-8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用；

（5）原生质体亚硝基胍NTG诱变 用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为2 mg/mL；取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速80r/min，26℃处理10-60min后，将处理液3000-4000r/min离心5-10min，弃去上清，用pH6.5，0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应；

（6-7）原生质体再生培养及再生菌继代培养 诱变后的原生质体进行系列梯度稀释，吸取200μL/皿涂布于再生固体培养基平板上进行再生培养；

原生质体再生培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5g，KH₂P0₄ 2g，MgS0₄·7H₂0 1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；培养条件为：23-26℃避光恒温培养6-8d；将在原生质体再生培养基上生长较快的菌落接到菌丝固体平板培养基上，23-26℃恒温培养4-6d，得到第一代诱变菌株；再将第一代诱变菌株接到以上培养基中，按照第一代培养的方法培养得到第二代诱变菌株；继续转接得到第三代诱变菌株；

（8）发酵培养 获得的第三代诱变菌株接种到液体发酵培养基中（30mL／250mL三角瓶)，23-26℃ 160r/min震荡培养2-3d，然后按照6%的接种量接种种子液到发酵培养基中（100ml/1000ml三角瓶）（液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20g、葡萄糖20g、蔗糖10g、大豆蛋白胨15、硫酸铵8g、酵母提取物6g、KH₂P04 0.8g、MgS0₄·7H₂0 0.75g、ZnS0₄·7H₂0 0.08 g、FeS0₄·7H₂0 0.04g、VB1 0.18g，加水定容至1L，pH 6.8，121℃灭菌20min），23-26℃ 160r/min震荡培养4-6d；

（9）过滤得到菌丝体，进一步冲洗菌丝，测定菌丝体虫草素含量，将产虫草素含量较高的菌株保藏；

（10）遗传稳定性测定 发酵获得的菌丝体冷冻干燥，粉碎过60目筛，制备供试样品；称取蛹虫草菌丝体干粉0.1g，加入5mL蒸馏水，超声破碎20min，80℃水浴浸提3h，8000g/min离心10min，取上清测定菌丝体虫草素含量。

2.2.根据权利要求1所述的一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法，其特征在于：所述的发酵液中的虫草素含量测定方法：样品适当稀释，0.45 m微孔过滤后HPLC测定；

采用HPLC法测定蛹虫草菌丝体中虫草素含量，使用日本岛津公司的高效液相色谱仪，大连依利特的Hypersil C18分析柱，5μm，4.6mm×250mm，Sigma公司的虫草素标准品；上机条件：流动相0.01mol/L的KH₂PO₄:甲醇 =90:10，检测波长：258nm；流速：0.8 mL/min 柱温：40℃，进样量20μl，虫草素对照品浓度：4 mg/L；

样品浓度=（样品峰面积/标准品峰面积）×标准品浓度×稀释倍数。