CN113897300B - 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的的动物双歧杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株动物双歧杆菌CCFM1160，此动物双歧杆菌CCFM1160能够缓解人细胞屏障损伤，具体体现在：(1)显著提高SDS诱导HaCaT细胞的存活率；(2)显著改善SDS诱导HaCaT细胞造成的屏障损伤；(3)显著促进细胞迁移的能力；(4)能够有效促进天然保湿因子和屏障完整性因子AQP‑3的表达，因此，动物双歧杆菌CCFM1160在制备预防或治疗皮肤屏障损伤的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌
技术领域
本发明涉及一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的的动物双歧杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
近年来，敏感性皮肤的发生率逐渐增高，严重影响人们的生活质量，越发受到人们的关注。根据研究表明，皮肤屏障功能异常是敏感性皮肤产生的主要原因。皮肤屏障功能异常很容易让皮肤受到刺激从而引发红肿、刺痛、瘙痒等症状，且症状经常反复发作，十分困扰患者的生活。
对于敏感性皮肤的定义目前并没有统一的说法，一般来说，敏感性皮肤比起正常皮肤更容易对外来刺激产生高度敏感性和高反应，面对外界的变化，皮肤耐受性差，因此可以将敏感性皮肤概括为是一种高度敏感的皮肤状态。但是敏感性皮肤的病因不明，通常都是以患者的主观感受为主，临床体征不明确，但总结来说，敏感性皮肤有三大特点：敏感性高、反应性高和耐受性差。
通常来说，引起敏感性皮肤的因素大致分为两类：内源性因素和外源性因素。内源性因素包括性别、年龄、种族皮肤疾病等。而外源性因素就比较多样了，比如环境因素，化学产品的使用和不健康的生活方式等。环境方面的因素包括污染过的空气，强烈的紫外线照射或长时间在太阳底下暴晒，这些都可能引起敏感性皮肤。另外，人们日常生活中使用的一些清新剂等里面含有的刺激性物质也可能引发敏感性皮肤。还有，生活中长期食用一些刺激类的食物也容易引发敏感性皮肤。
皮肤屏障损伤机制当前研究认为，敏感性皮肤的发生是由于内外因素的联合作用下，导致皮肤屏障功能受损，增加了感觉神经传入信号，从而增强了皮肤对于外界刺激的反应性。皮肤屏障功能出现损伤，破坏了皮肤表皮角质层结构的完整性，表皮细胞间脂质含量发生不平衡，角质层含水量也随之降低，从而加剧了皮肤对外界刺激的敏感度。另外，由于皮肤表面过低或过高的温度都会延迟皮肤屏障的修复速度，因此环境温度也是引发或加重敏感性皮肤的重要因素。
当前对于敏感性皮肤的治疗，除了用药、手术，皮肤屏障修复治疗成为新的研究方向，越来越多学者尝试从皮肤屏障病理、分子层面进行皮肤病出现、进展的研究。虽然关于治疗各类皮肤病的药物研究不少，但是由于药物的作用机制复杂会带来依赖性和副作用。
因此，仍需要开发一种天然无刺激的产品来增强皮肤屏障功能、提高皮肤的防御机能、减少敏感性皮肤疾患的发生、促进皮肤外用药物的疗效和护肤用品的功效。
发明内容
本发明的技术方案如下：
为解决上述问题，本发明提供了一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，所述动物双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61500，保藏日期为2021年2月4日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述动物双歧杆菌来源于人粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，命名为动物双歧杆菌GDMCC No.61500。
所述动物双歧杆菌CCFM1160的微生物形态学特征为：多形态杆菌，呈Y字形、V字形、弯曲状、刮勺状，其形态特征是有分叉的杆菌。菌落光滑，凸圆，边缘完整，乳脂呈白色，闪光并有柔软质地。
本发明还提供了一种组合物，其特征在于，所述组合物含有上述动物双歧杆菌的细胞、发酵上清液和胞内物中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述胞内物为上述动物双歧杆菌破碎后的上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞的制备方法为：将上述动物双歧杆菌CCFM1160 接种于增殖培养基中发酵，将得到的动物双歧杆菌发酵液，以8000-10000g，15～20min条件离心，收集动物双歧杆菌的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌的发酵上清液的制备方法为：将上述动物双歧杆菌CCFM1160接种于增殖培养基中发酵，将得到的动物双歧杆菌发酵液，以8000-10000g，15～20min条件离心，通过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌后，收集动物双歧杆菌的发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌的胞内物的制备方法为：将上述动物双歧杆菌CCFM1160接种于增殖培养基中发酵，将得到的动物双歧杆菌发酵液，以8000-10000 g，15～20min条件离心，添加适量PBS后，利用液氮反复研磨直至形成粉末状，添加适量 PBS后，以100～500W，5～15min超声，再以8000-10000g，15～20min条件离心，通过0.22-0.45 μm滤膜过滤除菌后，收集上清液得到动物双歧杆菌的胞内物。
在一种实施方式中，所述发酵液的的活菌数达到4～6×109cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述增殖培养基中碳源为10～40g/L葡萄糖，氮源为5～25 g/L酵母浸粉、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，无机盐为0.1～0.5g/L硫酸镁，0.1～0.5g/L硫酸锰，微量元素为1～5g/L无水乙酸钠，1～5g/L柠檬酸氢二铵，1～5g/L磷酸二氢钾，0.25～0.75g L- 半胱氨酸盐酸盐和吐温80 0.5～1.5mL/L。
本发明还提供所述动物双歧杆菌CCFM1160在预防或治疗皮肤屏障损伤方面的应用。
本发明还提供所述组合物在在预防或治疗皮肤屏障损伤方方面的应用。
有益效果：
本发明提供了一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，此动物双歧杆菌CCFM1160能够缓解缓解皮肤细胞屏障损伤，具体体现在：
(1)显著提高SDS诱导HaCaT细胞的存活率；
(2)显著改善SDS诱导HaCaT细胞造成的屏障损伤；
(3)显著促进细胞迁移的能力；
(4)能够有效促进天然保湿因子和屏障完整性因子AQP-3的表达，
可见，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)在制备预防或治疗皮肤屏障损伤的产品中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，已于2021年2月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61500，保藏地址为广州市先烈中路100 号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别改善SDS诱导的HaCaT细胞存活率的效果对比。
图2：不同组别对HaCaT细胞形态影响对比。
图3：不同组别促进细胞迁移能力的效果对比。
图4：不同组别AQP-3的基因表达量。
具体实施方式
皮肤覆盖于人体表面，是人体最大的器官之一。皮肤由表皮和真皮两部分组成，其中表皮的关键功能是在生物体和外界之间形成屏障，对人体有重要的保护作用。皮肤角质形成细胞(keratinocytes,KCs)是表皮的主要组成部分，而人永生化皮质形成细胞(HaCaT细胞) 属于成人表皮细胞自发转化而来的细胞系，它与人体正常的角质形成细胞有相同的增殖、分化特性和遗传稳定性，常被用于生物医学领域，作为体外研究的细胞系，比如皮肤修复愈合、防晒和抗衰老等研究。并且，角质形成细胞是研究皮肤氧化损伤重要组成部分。因此，下述实施例中使用经SDS诱导处理的人永生化皮质形成细胞作为屏障损伤细胞模型进行细胞实验。
下述实例中涉及的人永生化皮质形成细胞(HaCaT细胞)购自中国典型培养物保藏中心；下述实例中涉及的DMEM培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；下述实例中涉及的胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的MTT购自北京索莱宝科技有限公司；下述实例中涉及的RNA试剂盒(货号：DP419)购自上海天根生物技术有限公司；PCR试剂盒(货号：q711-02)购自诺唯赞生物技术有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H20 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80：1ml/L，pH 7.0。
动物双歧杆菌1号发酵培养基配方：葡萄糖：20g；酵母浸粉：10g；Na2HPO4：3.5g；MgSO4-7H2O：0.25g；MnSO4-H2O：0.1g；柠檬酸氢二铵：2g；KH2PO4：3.5g；L-半胱氨酸盐酸盐：0.5g；吐温80：1mL；pH调至6.8。
动物双歧杆菌2号发酵培养基配方：葡萄糖：20g；胰酪蛋白胨(胰蛋白胨)：15g；Na2HPO4： 3g；MgSO4-7H2O：0.25g；MnSO4-H2O：0.1g；柠檬酸氢二铵：2g；KH2PO4：3g；L-半胱氨酸盐酸盐：0.5g；吐温80：1mL；pH调至6.8。
下述实施例中涉及的动物双歧杆菌培养发酵液和胞内物的制备方法如下：
1.菌株的活化与培养
所有容器和工具灭菌。取菌种保藏管震荡均匀后用无菌接种环蘸取少量菌液在MRS固体培养基划线纯化。静置一段时间后，将平板倒置于37℃厌氧培养箱中48h。培养结束后挑取单菌落接种于5mL的MRS液体培养基中，静置于37℃恒温培养箱中培养12-18h。即得菌株的种子液。连续活化两代，接种量为2％。将上述种子液以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，置于恒温37℃培养箱中培养12-18h。重复操作1次(注：双歧杆菌放入厌氧坏境中培养)。
MRS培养基可以替换为动物双歧杆菌1号发酵培养基或动物双歧杆菌2号发酵培养基，培养条件与方法相同。
2.外用益生菌样品的制备
(1)益生菌发酵上清液：取培养好的益生菌8000r离心15min取上清；调节pH至 7.2～7.4；0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装后于-20℃冰箱保存。
(2)益生菌胞内物：取10mL培养好的益生菌离心收集菌泥，添加1mL PBS溶液溶解；加液氮研磨破碎，收集菌泥悬液；添加1mL PBS溶液溶解，超声破碎；8000r离心10min 收集上清液；0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装后于-20℃冰箱保存(0.1g湿菌泥得到1mL 的胞内上清液)。
完全培养基：5％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、95％DMEM 培养基。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
以来源于江苏无锡地区的人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于 -80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05g/L半胱氨酸的9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取动物双歧杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含有0.05g/L半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株；其中，动物双歧杆菌的典型菌落呈乳白色、不规则型、圆形凸起、光滑。
2、鉴定
提取菌株CCFM1160的基因组，将菌株CCFM1160的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行，CCFM1160的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM1160为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160。
实施例2：动物双歧杆菌对SDS诱导的HaCaT细胞存活的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用完全培养基洗涤一次后，用完全培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换完全培养基继续于 37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至培养皿的70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用完全培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照5×103个/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL；将96孔培养板置于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h。
设置正常对照组、动物双歧杆菌MRS培养基发酵液实验组D1、动物双歧杆菌1号发酵培养基发酵液实验组D2、动物双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组D3、动物双歧杆菌活菌实验组D4、动物双歧杆菌胞内物实验组D5、短双歧杆菌R1实验组和长双歧杆菌R2实验组。
使用MRS培养基、动物双歧杆菌1号发酵培养基或动物双歧杆菌2号发酵培养基培养动物双歧杆菌至菌浓达6×109CFU/mL，离心并收集上清，分别记作实验组D1、D2和D3的孵育上清；选取使用MRS培养基培养动物双歧杆菌的发酵液离心获得活菌，用完全培养基重悬致菌浓达6×109CFU/mL，记作实验组D4的孵育上清；选取使用MRS培养基培养植物乳杆菌的发酵液离心获得活菌，制备胞内物，记作实验组D5的孵育上清；使用MRS培养基分别培养短双歧杆菌实验组R1和长双歧杆菌实验组R2至菌浓达6×109CFU/mL，离心并收集上清，分别记作实验组R1和R2的孵育上清。
将D1、D2、D3、D4、D5和R1、R2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取100μL分别培养经SDS处理过的HaCaT细胞24h。对照组添加100μL的完全培养基，每组设置5个复孔，MTT法检测细胞存活率。
由图1可知，以正常对照组增殖存活率为62.30％，而动物双歧杆菌显著促进了细胞的增殖(P＜0.001)，动物双歧杆菌MRS培养基发酵液实验组D1细胞存活率为83.53％，动物双歧杆菌1号发酵培养基发酵液实验组D2细胞存活率为80.48％，动物双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组D3细胞存活率为78.32％，动物双歧杆菌活菌实验组D4细胞存活率为78.90％，动物双歧杆菌胞内物实验组D5细胞存活率为69.48％，且较之短双歧杆菌R1(细胞存活率＝47.23％)、长双歧杆菌(细胞存活率＝48.56％)增殖效果更好。
可见，相比于短双歧杆菌R1、长双歧杆菌R2，动物双歧杆菌更能够显著促进HaCaT细胞生长，缓解细胞屏障损伤。
实施例3：动物双歧杆菌对HaCaT细胞形态影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用完全培养基洗涤一次后，用完全培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换完全培养基继续于 37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至培养皿的70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照5×106个/孔接种于6孔培养板中，每孔1mL，将6孔培养板置于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h。
设置正常对照组、动物双歧杆菌D1、短双歧杆菌R1实验组和长双歧杆菌R2实验组(图2)。使用与实施例2相同浓度的孵育上清，将动物双歧杆菌D1、R1和R2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取2mL分别培养经SDS处理过的HaCaT细胞24h。正常对照组添加2mL的完全培养基。
由图2可知，正常对照组的HaCaT细胞培养24h后，在显微镜下见其贴壁生长旺盛，邻近细胞生长融合成片，胞浆饱满，细胞轮廓清晰，细胞外型呈梭形或多角形，铺展良好；加入动物双歧杆菌CCFM1160后的HaCaT细胞，24h后观察可见细胞贴壁生长良好，呈现出梭形或者多边形，可群集生长，核大，核质比高，短双歧杆菌R1实验组和长双歧杆菌R2实验组中的HaCaT细胞悬浮稍有增多，出现胞体缩小，变圆的现象。
因此，从形态学上直接观察细胞生长状态，动物双歧杆菌可保持HaCaT细胞的正常形态，细胞数量增多，细胞活性增强，有对HaCaT细胞的生长有促进作用。
实施例4：动物双歧杆菌对HaCaT细胞迁移能力的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用完全培养基洗涤一次后，用完全培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换完全培养基继续于 37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至培养皿的70％～80％密度时进行传代。
先将直尺标定在24孔板背面，用marker笔沿直尺划两道横向平行直线，直线间距在0.5～1 cm。选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将HaCaT细胞以每孔6×105个细胞接种于24孔板中培养48h致细胞达到100％融合；更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h后，用直尺标定，沿24孔板底部预先标记的平行线垂直方向，用200μL枪头在培养板底部划痕(使用同一枪头，保持枪头垂直于底面，一次划过)，PBS轻洗后，更换含样品的新鲜无血清培养基，根据marker笔标记的位置在显微下观察拍照(快速完成，减少细胞应激)，设置正常对照组、动物双歧杆菌实验组D1、短双歧杆菌R1实验组和长双歧杆菌 R2实验组(图2)。正常对照组添加200μL的完全培养基，实验组使用与实施例2相同浓度的孵育上清，将动物双歧杆菌实验组D1、R1和R2的孵育上清分别与完全培养基混合 (5％:95％)，并各吸取200μL分别培养经SDS处理过的HaCaT细胞48h，用无血清培养基清洗细胞，根据marker笔标记的位置，选取与之前相同的视野观察并拍照。
由图3可知，与正常对照组相比，动物双歧杆菌D1处理后划痕相对宽度减小，细胞迁移速率增快，划痕愈合率为(49.57±0.85)％，明显提高细胞迁移能力；短双歧杆菌R1和长双歧杆菌R2处理后划痕相对宽度较宽，细胞迁移速率减慢，细胞划痕愈合率降低，分别为(35.41±0.96)％、(38.23±1.04)％，抑制细胞迁移。
实施例5：动物双歧杆菌对HaCaT细胞AQP-3mRNA水平的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用完全培养基洗涤一次后，用完全培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换完全培养基继续于 37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至培养皿的70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将HaCaT细胞以每孔5×106个细胞接种于6cm细胞培养皿中培养24h；更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h。。
设置正常对照组、动物双歧杆菌实验组、短双歧杆菌R1实验组和长双歧杆菌R2实验组 (图2)。使用与实施例2相同浓度的孵育上清，将D1、D2、D3、D4、R1和R2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取7mL分别培养经SDS处理过的HaCaT细胞 24h。正常对照组添加7mL的完全培养基。
收集细胞，提取总RNA，测RNA浓度，反转录后于-20℃冰箱保存备用。Q-PCR法检测AQP-3基因表达水平。
引物名称
AQP-3-F：5'-AGGTGGACCCAGAAGTGAGT-3'；
AQP-3-R：5'-CCCCAGTCAAGGGTCATAGC-3'。
human-Actin-F：5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'；
human-Actin-R：5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。
Q-PCR：详细步骤参照PCR试剂盒说明书。
由图4可知，与正常对照组比较，在相同培养时间下，添加动物双歧杆菌培养的HaCaT 细胞中AQP-3mRNA相对表达量明显增加，较正常对照组增加了约1.6～2倍。动物双歧杆菌显著地提高HaCaT人角质形成细胞AQP-3基因相对表达量，这说明动物双歧杆菌可以促进皮肤AQP-3的表达，改善皮肤屏障功能和保湿能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的的动物双歧杆菌
<130> BAA210511A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 434
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgaacgggtc ccttgaccgg gtcagtcaca ccggcggcca gcaggtcctc gtaggtgtcg 60
gtggcggcgt tgaagccttc cccatcgggc agagaacgaa ccttgttgat caccacgtcg 120
ccggacacgc tgcgttctcg gcaatctgct tgatcggggc ttcgatggcg cggaacacga 180
tggcggcacc ggtagcctct tcgccggtca gggaggtgac ggcctcaccc ttctcggcct 240
tggcagcagc ctgaacgagg gccacgccac cgccgggcag caggccttcc tcaatggcgg 300
ccttggcgtt acgcacggca tcttcgatgc ggtgcttgcg ctccttggcc tcgacctcgg 360
tgacagcgcc gaccttgatg acagccacgc cgccggccag cttggccaga cgctcctgca 420
gttccttcac ggaa 434

Claims (9)

1.一株动物双歧杆菌（Bifidobacteriumanimalis）CCFM1160，已于2021年2月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61500。
2.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述动物双歧杆菌CCFM1160的细胞、胞内物或发酵上清液中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述胞内物为权利要求1所述动物双歧杆菌破碎后的上清液。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述细胞的制备方法为：将权利要求1所述动物双歧杆菌接种于培养基中发酵，将得到的发酵液离心，收集动物双歧杆菌细胞。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述发酵上清液的制备方法为：将权利要求1所述动物双歧杆菌接种于培养基中发酵，将得到的发酵液离心并除去固形物，收集动物双歧杆菌的发酵上清液。
6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述胞内物的制备方法为：将权利要求1所述的动物双歧杆菌接种于培养基中发酵，将得到的发酵液离心，收集并破碎细胞，离心除去固形物，收集动物双歧杆菌的胞内物。
7.如权利要求2~6任一项所述的组合物，其特征在于，所述发酵液的活菌数达到4~6×109cfu/mL。
8.如权利要求4~6任一项所述的组合物，其特征在于，所述培养基中碳源为10~40g/L葡萄糖，氮源为5~25g/L酵母浸粉、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，无机盐为0.1~0.5g/L硫酸镁，0.1~0.5g/L硫酸锰，微量元素为1~5g/L无水乙酸钠，1~5g/L柠檬酸氢二铵，1~5g/L磷酸二氢钾和吐温800.5~1.5 mL/L。
9.权利要求1所述的动物双歧杆菌在制备预防或治疗皮肤屏障损伤的药物方面的应用。
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