CN103204933B - 一种稳定性高的人源抗vegf抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定性高的人源抗VEGF抗体及其应用。通过计算机辅助分子设计结合实验验证，对一株抗VEGF功能抗体的轻重链可变区进行热稳定性改造，在不降低抗体亲和力的前提下，获得了热稳定性更好的突变体抗体，将各突变位点进行叠加突变，获得的突变体抗体热稳定性较亲本抗体最高提高7℃以上。本发明获得的稳定性高的突变体抗体分子，有利于该抗体成药后的储存，同时为其他抗体的稳定性改造提供可供借鉴的经验。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，尤其是涉及治疗用人源抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）抗体的体外热稳定性改造，具体地，涉及针对一株抗VEGF人源抗体，通过计算机分子模拟技术对抗体进行结构模建，并对影响抗体结构稳定性的氨基酸进行定点突变，通过实验对突变体进行亲和力和热稳定性的评价，筛选获得了热稳定性明显提高的突变体抗体。
背景技术
与其他蛋白药物相比，抗体药物具有结构稳定、易于表达纯化、易于储存及体内半衰期长等特点，这也是其成为生物制药领域领军力量的重要原因之一。抗体的结构稳定性是影响其能否成为一个好的临床药物分子的重要因素之一，良好的结构稳定性是维持抗体与抗原特异性结合能力的基础。抗体结构稳定性研究不仅是生物物理学中蛋白质折叠理论的重要组成部分，也是治疗性抗体开发过程中必须面对的问题。结构稳定性不仅影响抗体的表达、纯化和储存，也影响其在体内与靶标抗原结合的亲和力和特异性，从而导致其体内生物学活性的丢失或毒副作用的增加。
人们对抗体稳定性的关注伴随着治疗性抗体产业的整个发展过程。对影响抗体结构稳定性的因素以及引发其结构不稳定的机制也进行了较深入的研究。热失活是抗体结构的不稳定最常见的形式，评价抗体抗热失活能力是评价其结构稳定性的重要指标。
抗体的热稳定性从本质上是指，抗体的天然态（Native state）与其去折叠态（Unfoldedstate）之间的自由能之差，即折叠自由能。理论上，抗体热稳定性越高，其抗热失活能力越强，这对抗体的开发具体重要的意义。首先，抗体的热稳性越高，则其新生肽链在细胞内装配时产生错折叠（mis-folding）的概率越低，从而可溶性表达量也越高。因此，提高抗体的稳定性，可以大幅降低生产成本，从而使得药物便于普及。其次，近十年的研究还表明，抗体的热稳定性与其在体内对各种蛋白酶的耐受性是相关的。抗体热稳定性越高，则其结构折叠的越紧凑，进而其内部的蛋白酶切位点越不容易暴露在外，因此在体内越不容易被蛋白酶降解，从而使得其在相同体内清除速度下在体内的剩下有效成分越多，而这在客观上使得在给药剂量相同的情况下其血药浓度越高。更重要的是，抗体的稳定性是其行使正确生物学功能的保障，抗体稳定性越高，其在体内保持生物活性的时间也越长。由此可见，较高的热稳定性，是一株治疗性抗体能否最终走上临床并投放市场的关键因素之一。除此以外，抗体的热稳定性对于其保质期及存放条件等性质也是至关重要的。热稳定越高，则在相同条件下的保存时间也就越长，而且对保存环境的要求也相对较低——而这在一定程度上也降低了抗体的储存和物流成本。因此，在保证抗体亲和力、特异性及表达量等性质不受太大影响的情况下，最大程度上提高其热稳定性，对于抗体药物研发具有重要的现实意义与应用价值。
目前，针对抗体稳定性改造的比较经典的几种方法包括：CDR移植的方法，基于晶体结构的计算机辅助分子设计、基于抗体同源模建的计算机辅助分子设计、基于蛋白质折叠理论指导下的分子改造策略以及基于已有结构知识的分子改造策略等。在以往的研究中，针对抗体稳定性改造成功的报道很多，其所采用的方法也不尽相同。通过上述的一种或几种方法的应用，均有成功案例的报道。尽管这些技术方法还未形成成熟的技术体系，但这些研究却为更深入的了解抗体结构稳定性提供了大量的素材。
由于抗体包括轻、重链两条链，因此其结构比较复杂，其整体结构的稳定性取决于：轻链和重链各自的稳定性、轻重链之间的界面稳定性及铰链区稳定性等几个方面，而轻重链的稳定性又细分为局部稳定性和整体稳定性。从影响蛋白结构稳定性的影响因素分析，影响局部稳定性因素包括局部结构熵、折叠和去折叠自由能、β转角位置及类型、特殊氨基酸如Pro和Gly所处位置是否合理、内部和表面氨基酸与其所处环境十分和谐及增加关键部位的氢键和其他有利于结构稳定的作用力等，而分子的整体稳定性除了取决于局部稳定性之外，还应考虑分子整体的去折叠次序和去折叠能量势垒等分子的热动力学特征。这些都是指导抗体稳定性改造的重要思路和技术方法。
抗体分子是一类较特殊的蛋白分子，其结构除重链CDR3变化巨大外，其他5个CDR区及框架区的结构变化较小，大部分抗体在除HCDR3以外的部分具有较相似的标准化结构特征。抗体的这种结构特征，为将计算机辅助药物设计（Computer Aided DrugDesign，CADD）用于抗体的分子改造提供了可能。目前，通过计算机辅助分子设计的方法提高抗体结构稳定性的成功案例很多。从本质上来讲，CADD是分子模拟（molecularmodeling）方法在制药领域的综合应用。随着分子模拟理论的完善及技术的进步，分子模拟方法正越来越多地被用于蛋白质结构-功能关系、蛋白质与配体的相互识别以及药物设计的研究工作当中。现在，分子模拟方法在某些方面已经成为实验研究难以替代的手段。按照分子模拟方法的理论基础，可将其大致分为三类，即基于牛顿力学，基于量子力学和基于知识的分子模拟方法。其中基于牛顿力学的分子模拟方法包括分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）、分子对接（molecular docking）和同源模建（homology modeling）等各种经典方法。其优点是理论基础扎实，计算速度较快，且在绝大多数情况下计算结果可靠，因此成为了当今分子模拟领域的主流方法。
计算机辅助分子模拟为了解抗体及复合物的结构提供了良好的平台支持，近年来，通过计算机辅助分子模拟对抗体分子进行设计或改造，尤其是对抗体进行体外亲和力成熟的成功报道越来越多，证明该技术在抗体研制领域具有重要的作用，国际上甚至开始尝试通过计算机模拟筛选的方法获得所需要的目标抗体。然而，由于我国的抗体药物开发起步较晚，相关的技术方法体系还处于建立初期，少有利用计算机分子分子设计进行抗体分子优化的报道，尤其尚未发现将其用于抗体稳定性改造的报道。
申请人一直从事原创性治疗性抗体的研发工作，通过自构建的大容量人抗体资源库技术获得了一些原创性候选抗体品种。在VEGF靶标抗原治疗性抗体的研究中，申请人获得了一株在体外具有和贝伐单抗中和活性相当的抗体分子，有望成为全新的抗VEGF候选药物。但其结构稳定性较差。因此需要获得稳定性明显改善的突变体抗体分子，为其进一步开发抗VEGF药物奠定基础，同时也希望完善对抗体分子物理结构稳定性的理论认识以及计算机辅助药物分子设计在该领域的不足和缺陷，为其他抗体药物的改造提供技术和理论支持。
发明内容
本发明的目的在于提供热稳定性明显提高的抗VEGF抗体及其活性片段。
本发明的第二个目的在于提供抗VEGF抗体的应用。
本发明运用计算机分子模拟技术对一株热稳定性和体外放置稳定性很差的抗VEGF功能抗体的可变区进行了全方面稳定性改造，通过亲和力和稳定性筛选，最终获得了多个亲和力基本不变，但对该抗体稳定性具有正向作用的轻、重链突变位点，并进一步证实这些突变位点可以进一步通过叠加突变，使抗体热稳定性进一步提高。最终其热稳定性较亲本抗体提高7℃以上。
本发明提供的抗体，各种抗体形式均包含在内。如，抗VEGF抗体可以是全抗体或抗体片段。进而，抗体可以被标记检测标签，固定在固相或交联异源复合物（如细胞毒性物质）。抗体可以做诊断或治疗用。在诊断应用时，本发明提供一种检测VEGF蛋白存在的方法。用于这一用途，本发明提供一试剂盒，包括抗体和用于检测的技术说明。
本发明提供的人源抗VEGF抗体，其轻链可变区的含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
其轻链可变区含有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQID No.2所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列是发明人先期研发的人源抗VEGF抗体Amv6（其轻、重链可变区的氨基酸序列及编码基因分别见SEQ ID No.3、4和SEQ ID No.9、11，Amv6抗体的相关序列也可参见中国专利ZL201210533178.3）的轻链可变区的氨基酸突变序列；SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是Amv6抗体的重链可变区的氨基酸突变序列；SEQ ID No.7所示的氨基酸序列是发明人先期研发的人源抗VEGF抗体Amv4（其轻链可变区编码基因见SEQ ID No.10）的轻链可变区的氨基酸突变序列。
进一步，本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其重链可变区的氨基酸如SEQ ID No.4所示。其中SEQ ID No.5所示的氨基酸序列为本发明发现的突变位点叠加后的轻链可变区，这些突变位点包括：这些突变位点包括：L21突变为I,V29突变为I,G52突变为A,S54突变为N,T57突变为P，A61突变为D，G97突变为P；SEQ ID No.4所示的氨基酸序列为Amv6抗体的重链可变区。
本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其重链可变区的氨基酸如SEQ ID No.6所示。SEQ ID No.3所示的氨基酸序列为Amv6抗体的轻链可变区，SEQ ID No.6所示的氨基酸序列为本发明发现的突变位点叠加后的重链可变区，这些突变位点包括：S31突变为D，G53突变为P，A88突变为P。
更优选地，本发明的轻、重链上的这些单点定向突变可以进一步叠加，最终产生如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的轻链和重链氨基酸序列。其与亲本抗体的重链即SEQ ID NO.4、轻链即SEQ ID NO.3组合后抗体的热稳定性进一步提高。
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组合后所产生的抗体其热稳定性最高，较亲本抗体提高7℃以上。热稳定性提高的突变体抗体，其体外血清放置稳定性和长期放置稳定性也随之提高。
本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列还可以如SEQID No.3所示，其重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID No.2所示的任一个或多个单点突变的序列。此处所述的单点突变是指抗体重链可变区相对于亲本重链可变区（SEQ IDNo.4所示）只有一个突变位点。
本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ IDNo.1所示的任一个或多个单点突变的序列，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。此处所述的单点突变是指抗体轻链可变区相对于亲本轻链可变区（SEQ ID No.3所示）只有一个突变位点。
本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ IDNo.1所示的任一个或多个单点突变的序列，所述多个为小于7个；其重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID No.2所示的任一个或两个单点突变的序列。
更进一步地，其轻链定点突变体热稳定性提高的特点，具有一定的普适性，同样适用于另一株抗VEGF突变体抗体Amv4，即以SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.4为轻、重链可变区组成的抗体。
本发明提供的稳定性高的抗VEGF抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，其重链可变区的氨基酸如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.8所示的氨基酸序列是Amv4抗体的轻链可变区发生突变叠加后的氨基酸序列。
进一步地，本发明的抗体，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID No.7所示的任一个单点突变的序列，其重链可变区的氨基酸如SEQ ID No.4所示。
本发明提供了上述抗体在制备以VEGF为靶标的疾病治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述抗体的药物或检测试剂。
在本发明中，亲本抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示。其中轻链上多个单点氨基酸的定向突变可以提高抗体的热稳定性，这些定向突变包括，L21突变为I,V29突变为I,G52突变为A,S54突变为N,T57突变为P，A61突变为D，G97突变为P；重链上也有多个单点氨基酸的定向突变可以提高抗体的热稳定性，这些定向突变包括，S31突变为D，G53突变为P，A88突变为P。
本研究首先采用ZDock方法对Amv6与VEGF的相互作用进行了限制性刚性分子对接，并在此基础上采用Rosetta SnugDock方法对复合物的结构重新进行了柔性的局部对接和复合物优化，最后用Rosetta Antibody程序对Amv6的Fv区的分子结构进行详细的分析，避开与VEGF结合的区域和氨基酸残基，主要从影响抗体结构的多个角度进行突变体的设计，包括抗体与标准结构的差异比较、氨基酸使用频率统计分析、β转角位置及类型、特殊氨基酸如Pro和Gly所处位置是否合理、分子局部稳定性和分子去折叠的热动力学特征等，以及轻重链界面稳定性等多个角度，给出不同的设计方案，提高了突变体设计的准确性，共设计突变体抗体42个，其中对稳定性有改善作用的突变位点为18个，准确率达到40%以上。
本发明充分运用计算机分子模拟技术，从影响抗体蛋白稳定性的各个角度进行综合考虑，采用基于经验、基于结构和基于统计分析等多种方法，对抗VEGF抗体Amv6的轻重链分别进行了数十株突变体的设计、构建与筛选，最终获得了对热稳定性有改善作用的11个轻链定向突变位点和7个重链定向突变位点，进一步对这些位点进行叠加突变，实现了轻链上的7个叠加突变，重链上的3个叠加突变，叠加突变体的热稳定性进一步改善，最终的突变体抗体热稳定性较亲本抗体提高了7℃以上，为改善该功能抗体的结构稳定性和理化性质提供了更好的选择。
附图说明
图1所示为pABG1载体信息示意图；
图2所示为pABκ-Amv6L和pABG1-Amv6H载体信息示意图；
图3所示为Amv6血清放置稳定性分析；
图4所示为Amv6长期放置稳定性加速实验结果分析；
图5所示为Amv6热稳定性测定结果分析；
图6所示为预测的Amv6的Fab与VEGF结合复合物模型图；
图7所示为轻链单点突变体与Amv6热稳定性的比较；
图8所示为重链单点突变体与Amv6热稳定性的比较；
图9所示为轻链多点联合突变体热稳定性的变化情况；
1：阿伐斯汀；2：amv6-L97P；3：Amv6-L52G-L57P-L97P；
4：Amv6-L21I-L52G-L57P-L61D；5：Amv6-L21I-L29I-L52G-L57P-L61D；
6：Amv6-L21I-L29I-L52G-L57P-L61D-L97P；
7：Amv6-L21I-L29I-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P；
图10所示为重链多点联合突变体与Amv6热稳定性的比较；
图11所示为轻、重链多点联合突变体热稳定性变化情况；
1：阿伐斯汀；2：Amv6-L21I-L52G-L57P-L61D；
3：Amv6-L21I-L52G-L57P-L61D-L97P；
4：Amv6-L21I-L29I-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P；
5：Amv6-L21I-L52G-L57P-L61D-H31D-H53P-H88P；
6：Amv6-L21I-L52G-L57P-L61D-L97P-H31D-H53P-H88P；
7：Amv6-L21I-L29I-L52G-L54N-L57P-L61D-L97P-H31D-H53P-H88P；
8：Amv6-H31D-H53P-H88P
图12所示为热稳定性提高对抗体长期放置稳定性的影响；
图13所示为Amv4轻链单点及叠加突变的突变体与Amv4热稳定性的比较。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1抗VEGF抗体Amv6稳定性研究
一、材料与方法
1、材料：哺乳动物细胞HEK293T细胞购自invitrogen公司，无血清培养基FreestyleTM293表达培养基（货号：12338-026）和转染介质Opti-MEMI（货号：31985-070）为Gibco公司产品，转染试剂293fectinTMreagent（货号：12347-019）也为Invitrogen公司产品。高保真DNA聚合酶primeStar DNA聚合酶（Takara公司产品），引物合成由上海生工完成。HRP-羊抗人IgG抗体购自中杉金桥生物有限公司。96孔ELISA为Cornning公司产品。纯化介质ProteinA1ml预装柱为Invitrogen公司产品。重组VEGF165蛋白纯品为HEK293T瞬时表达纯化获得。Amv6抗体轻重链表达载体pABκ-Amv6L和pABG1-Amv6H为本室保存，载体信息见图1和2。对照抗体阿伐斯汀为罗氏公司产品。
2、方法
2.1重组蛋白抗原VEGF165的制备：
将VEGF165基因（由军事医学科学院生物工程研究所师明磊博士惠赠，具体来源及序列可见师明磊博士论文：重组VEGF可溶性受体的构建表达与鉴定，中国人民解放军军事医学科学院，2008)利用常规分子克隆方法克隆入真核瞬时表达载体pABG1（图2）。具体而言，利用酶切位点EcoR I和BamH I克隆入载体，构建重组表达质粒，并利用HEK293T细胞对重组质粒进行表达，利用在VEGF165的C端引入的6个His的组氨酸标签进行纯化，获得蛋白纯品，蛋白定量后分装冻存。
2.2Amv6抗体的表达与纯化
将重组质粒pABκ-Amv6L和pABG1-Amv6H以摩尔比1：1转染HEK293T细胞，进行全抗体的瞬时表达，3天后收集细胞培养上清，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，纯化后抗体样品脱盐于pH7.4的PBS中。并利用分光光度计测定其在280nM的吸光度值，其除以消光系数1.35后即为抗体的浓度。纯化后抗体放于4℃保存。
2.3抗体的血清放置稳定性分析
待测抗体独立分装于含50%血清的无菌PBS缓冲液中，浓度为5ug/ml，50ul/管分装于无菌PCR管，密封后放置于37℃，于不同的时间点收取一份样品，冻存于-20℃，最后通过ELISA方法分析不同取样点样品与VEGF的反应性。即，VEGF以1ug/ML浓度包被50ul于96孔板，4℃包被过夜，次日用脱脂奶粉封闭处理，将待检测抗体用封闭液稀释至50ng/ML的检测浓度，加入封闭后的96孔板，37℃作用1h后，用PBST洗涤5遍后加入脱脂奶粉预封闭的HRP-羊抗人IgG，37℃作用30min后，PBST洗涤5遍，加入底物显色液显色，并于5min后用2M的H2SO4终止反应并与4℃放置的样品进行比较，评价抗体在37℃血清中放置的稳定性。
2.4抗体的长期放置稳定性（加速试验）
将抗体独立分装于无菌的pH7.0的PBS缓冲液中，浓度为5μg/ml，50μl/管，密封后放于37℃,于不同时间点收取1份样品，冻存于-20℃，最后通过ELISA方法分析不同取样点样品与VEGF的反应性。具体ELISA信息见2.3。
2.5抗体的热稳定性分析
（1）样品制备：将待测抗体以PBS稀释至5ug/ml的工作浓度，分装至PCR管，50ul/管；（2）加热:用梯度PCR程序加热样品并持续2小时。温度范围根据经验一般选择45～70℃，温度梯度一般不超过2℃。（3）ELISA检测：采用常规ELISA方法分析处理后抗体样品与VEGF的反应性，具体ELISA信息见2.3；（4）数据分析：做温度-样品ELISA显色值相关曲线，分析不同样品在加热处理后与VEGF抗原结合能力的变化。
二、结果
1.Amv6的血清放置稳定性
将Amv6和对照抗体阿伐斯汀按方法2.3进行处理后ELISA分析Amv6与VEGF的结合活性，结果表明（图3），Amv6在血清中放置不稳定，呈现逐步的活性丢失趋势，而对照抗体阿伐斯汀在血清中稳定存在。
2.Amv6的放置稳定性
将Amv6对照抗体阿伐斯汀按方法2.4进行处理后ELISA分析Amv6与VEGF的结合活性，结果表明（图4），Amv6在37℃长期放置不稳定，呈现逐步的活性丢失趋势，而对照抗体阿伐斯汀稳定性较好。
3.Amv6的热稳定性
将Amv6和对照抗体阿伐斯汀按方法2.4进行处理后ELISA分析Amv6与VEGF的反应性，结果表明（图5），Amv6热稳定性远低于对照抗体阿伐斯汀，其半失活稳定约为58℃。
上述结果提示，Amv6分子体外稳定性较差，表现为在pH7.0的PBS和血清中37℃长期放置不稳定，而抗体的热稳定性是评价分子稳定性的重要指标，热稳定性分析结果提示Amv6热稳定性较差。
实施例2Amv6轻链突变对热稳定性的影响
一、方法
1.Amv6可变区结构模建
抗体是一类被广泛研究的功能性蛋白，通过对抗体的结构信息的总结与分析，目前已经归纳出了一套有效的结构预测及筛选方案，可比较准确地模建出抗体的可变区。在本发明中，对Rosetta Antibody中部分代码进行了修改并进行了并行化处理，使之适合计算环境。在实际工作中，采用本地化的Rosetta Antibody软件对Amv6的可变区进行模建，模建共生成5000个模型。对这些模型进行打分排序，挑选打分排在前10的模型进行细致的分析，选取综合性质最优的模型作为最终的模型。利用该方法，可以非常准确的模建出除重链CDR3以外的所有CDR区，对于较短（12个残基以内）的重链CDR3区，也可以给出相对准确的模型。
2.Amv6-VEGF结合模式预测
本发明的目的是在不影响Amv6与VEGF间亲和力及特异性的前提下大幅提高其稳定性，因此有必要模建出Amv6与VEGF的复合物结构。通过前期的丙氨酸扫描（Ala-scan）及大量的定点突变实验（专利申请号：201210533178.3），已经比较清楚的获得了Amv6与VEGF的结合界面信息，因此可以通过限制性对接对Amv6-VEGF的复合物进行预测。首先，利用ZDock对Amv6可变区与VEGF进行限制性对接，并对结果进行聚类分析，从中选取打分和聚类性质最优的结果作为可能的结合模式；然后，利用Rosetta SnugDock对ZDock获得的刚性对接结果重新进行局部对接及优化，根据打分及实验信息选取复合物模型。最终确认以最适复合物模型如图6所示为依据进行突变体设计。
3.突变体设计
在本发明中，主要采用了经验法、局部结构熵法及结构分析法等3种突变体设计方法以提高Amv6的稳定性。经验法是指利用统计信息和以往设计积累下的经验进行蛋白质改造的方法，比如在将转角处的氨基酸残基替换成Gly、Ser及Pro等高频氨基酸残基。局部结构熵（Local structure entropy，LSE）法是根据对PDB结果数据库中的结构进行统计分析并根据计算结果对蛋白质进行改造的一种方法。通过计算出一定长度（通常为4个氨基酸残基）肽段在某一位置的出现频次，可根据公式推断出一条特定的氨基酸序列的LSE，LSE越低说明该拥有该序列的结构越稳定。结构分析法实际上是根据对蛋白结构的综合分析对蛋白质稳定性进行改造的方法，一般都以基于物理及半经验打分函数对设计的突变体进行打分，并挑选打分较好的突变体进行实验验证。具体设计结果详见结果。
4.突变体抗体的载体构建、蛋白表达及纯化
突变体轻、重链重组载体构建采用质粒快速定点突变的方法进行，参照文献[王荣浩，陈瑞川，刘润忠。快速点突变的优化方法。厦门大学学报（自然科学版），2008,Vol47，sup2,282-285]。具体到本实验为：分别以Amv6轻、重链重组载体为质粒模板，每个突变位点设计一对突变引物（具体引物信息略，设计原则参照上述参考文献），对轻重链基因进行定点突变，采用含有突变位点的成对引物，以亲本抗体的质粒为模板，进行常规PCR（DNA高保真聚合酶和dNTP等均为Takara公司产品），PCR产物直接用Dpn I酶进行处理，之后用PCR试剂盒进行回收，将回收的突变基因产物转化大肠杆菌感受态，获得突变后的重组载体，经测序确认正确后用于突变体的瞬时表达；突变体的瞬时表达和纯化按实施例1的2.2进行。
5.ForteBio QKe***测定突变体抗体亲和力
将VEGF165利用生物素试剂盒（GE公司产品，货号：）进行生物素化，将生物素化的VEGF以PBS稀释至100nM的浓度，包被于链亲和素传感器表面（ForteBIO，adivision of Pall Life Sciences，货号:18-5020），时间为20min，使用HEPES EP对传感器清洗5min，将待测突变体抗体和亲本抗体Amv6均以50nM的浓度放于检测孔中，并使其与清洗后的链亲和素传感器表面的VEGF结合，结合时间为10min，待结合达到平衡态后将复合物在HEPES EP中进行解离，解离时间为20min。采用ForteBio软件包进行亲和力分析。
6.突变体抗体热稳定性分析
方法与实施例1中的2.5相同。
三、结果
以Amv6轻链可变区序列（SEQ ID NO.3）为对象，共设计轻链单点突变28个，对每个单点突变体进行表达纯化及蛋白定量后，采用Fortebio蛋白相互作用***进行相对亲和力的测定，评价其亲和力与亲本抗体Amv6的差别，统计结果如表1所示。对亲和力基本保持不变的突变体抗体进行进一步的热稳定性评价，统计结果见表1。其中，有11个单点突变体热稳定性较亲本抗体有所提高，部分结果如图7所示。其中，热稳定性改善最明显的是L97P这个位点。
表1Amv6轻链单点定向突变对Amv6亲和力和热稳定性的影响
注：亲和力变化表示以Amv6为对照，突变体亲和力变化情况，即等于突变体亲和力/Amv6亲和力；1表示基本没变化；0.5表示略有约1倍的提高；1.5、2和3分别表示略有不同程度降低。本研究认为亲和力变化在0.5～2倍之间的突变体可认为亲和力基本不变。热稳定性：↑表示热稳定性改善；↓表示热稳定性降低；—表示热稳定性基本不变。
实施例3Amv6重链突变对热稳定性的影响
以Amv6重链可变区序列（SEQ ID NO.4）为对象，共设计重链单点突变17个，对每个单点突变体进行表达纯化及蛋白定量后，采用Fortebio蛋白相互作用***进行相对亲和力的测定，评价其亲和力与亲本抗体Amv6的差别，统计结果如表2所示。对亲和力基本保持不变的突变体抗体进行进一步的热稳定性评价，方法参照实施例2，统计结果见表2。其中，有6个单点突变体热稳定性较亲本抗体有所提高，部分结果如图8所示。
表2Amv6重链单点定向突变对Amv6亲和力和热稳定性的影响
| 突变位点 | 亲和力变化 | 热稳定性 | 突变位点 | 亲和力变化 | 热稳定性 |
| A23T | 1 | ↑ | D62P | 3 | ↑ |
| T28P | 0.5 | — | S63P | 1 | ↓ |
| T28D | 1.5 | ↑ | T69K | 1 | ↓ |
| S31D | 1.5 | ↑ | N77K | 1.5 | ↓ |
| S35L | 0.5 | ↓ | N77G | 1.5 | ↓ |
| T52S | 1.5 | - | Y80S | 0.7 | ↓ |
| G53P | 1 | ↑ | A88P | 0.5 | ↑ |
| G55D | 1 | ↓ | V93I | 1 | ↓ |
| E57S | 1.5 | ↓ |
注：亲和力变化表示以Amv6为对照，突变体亲和力变化情况，即等于突变体亲和力/Amv6亲和力；1表示基本没变化；0.5表示略有约1倍的提高；1.5、2和3分别表示略有不同程度降低。本研究认为亲和力变化在0.5～2倍之间的突变体可认为亲和力基本不变。热稳定性：↑表示热稳定性改善；↓表示热稳定性降低；—表示热稳定性基本不变。
实施例4Amv6轻、重链联合突变对热稳定性的影响
根据事实例2和3提供的结果，分别对明显提高抗体热稳定性的11个轻链单点突变和6个重链单点突变进行叠加突变，获得叠加突变后的轻链和重链重组载体后，进一步将其与重链和轻链重组载体共转染293T细胞进行瞬时表达和纯化，获得含有多个突变位点的突变体抗体。采用Fortebio蛋白相互作用***对其与亲本抗体进行亲和力比较分析，方法参照实施例2。结果表明（表3），有7个轻链突变位点和3个重链突变位点叠加后其亲和力较亲本抗体无明显变化。对其进行进一步的热稳定性评价，结果表明，轻链第21位、29位、52位、54位、57位、61位和97位氨基酸可以同时突变，且热稳定性随突变位点的增加而进一步增强（图9），较单点突变改善最明显的L97P进一步大幅度改善；重链第31位、53位和88位氨基酸可以同时突变，且热稳定性随突变位点的增加而进一步增强（图10）；并且，将轻链的多点突变与重链的多点突变组合后所形成的突变体，其热稳定性较单独突变轻链或重链均明显增强（图11）。其中，全部轻链7个突变位点叠加和4个重链突变位点叠加产生的突变体，其热稳定性达到Tm值达到66℃以上，较亲本抗体Amv6的Tm值（约为58.5℃）提高7℃以上。
表3Amv6轻、重链组合突变对抗体亲和力的影响
实施例5Amv4轻链突变对抗体热稳定性的影响
为验证这种提高抗体稳定性方法的普适性，在另一株与Amv6在CDR3区序列不同，但同属于Kappa3家族的轻链Amv4L（SEQ ID NO.8，其编码基因如SEQ ID NO.10所示）上验证了这些轻链突变位点对抗体热稳定性的影响。该轻链与重链SEQ ID NO.4组合形成一株抗VEGF特异性抗体Amv4(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.4组合)。将L21I、L29I、L52G、L57P和L61D几个突变位点在SEQ ID NO.8上进行单点和组合突变，并对其亲和力和热稳定性进行分析和评价。亲和力测定结果表明（图13）。图13中Amv4-IIGPD是指将L21I、L29I、L52G、L57P和L61D同时突变形成的突变体，上述位点的突变对亲和力无明显影响，进一步评价其热稳定性的结果表明，这些位点的单点和组合突变（SEQ ID No.7）同样可以明显提高Amv4的热稳定性。提示本发明提供的轻链、重量突变位点提高抗VEGF抗体的稳定性具有一定的普适性。
Claims (1)
1.一种人源抗VEGF抗体，其特征在于，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其重链可变区的氨基酸如SEQ ID No.4所示。
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