CN113563472A

CN113563472A - 一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列及其重组全长IgG抗体

Info

Publication number: CN113563472A
Application number: CN202110805530.3A
Authority: CN
Inventors: 郭逸蓉; 柳颖; 赵颖; 占绣萍; 刘毅华; 赵莉; 陆昕颖; 朱国念
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: SHANGHAI AGRICULTURAL TECHNOLOGY PROMOTION SERVICE CENTER; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-07-16
Also published as: CN113563472B

Abstract

本发明公开了一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种抗百菌清重组全长IgG抗体。本发明同时公开了一种重组抗体表达质粒。本发明的抗百菌清重组全长IgG抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株分泌高亲和力、高特异性抗百菌清抗体的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了小鼠IgG1重链恒定区基因和小鼠kappa轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒***的哺乳动物细胞表达获得了重组全长IgG抗体，其识别活性与鼠源亲本抗体非常接近，并可实现抗百菌清抗体的大批量标准化生产，为百菌清残留快速检测的各种免疫分析方法提供可靠的核心原料。

Description

一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列及其重组全长IgG 抗体

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列及其重组全长IgG抗体的制备与应用。

背景技术

百菌清是一种广谱、保护性杀菌剂，可以与真菌细胞中的三磷酸甘油醛脱氢酶发生作用，与该酶中含有半胱氨酸的蛋白质相结合，从而破坏该酶活性，使真菌细胞的新陈代谢受到破坏而失去生命力。百菌清可以有效杀灭子囊菌纲、半知菌纲、担子菌纲等真菌，但其对非靶标生物尤其是鱼类有剧毒，可引发人体迟发性***反应皮炎，因此欧盟委员会发布法规禁止使用百菌清，同时将其列入2B类致癌物清单。此外，随着世界各国对进出口食品质量要求的提高，农药残留问题也成为国际贸易壁垒的关键因素，会对我国的农业经济造成一定程度的影响。因此，对食品或环境中的百菌清残留进行有效监管监控具有重大意义。其中，最重要的是要建立快速、有效、低成本的百菌清残留检测方法。

免疫分析方法是基于农药抗原和特异性抗体亲和识别原理而建立的方法，具有灵敏度高、检测迅速、易操作、检测元件可塑性强等特点，在农残检测中具有广泛的应用前景。迄今为止，已有大量的免疫分析方法报道用于农药残留检测。目前，主要的农药残留免疫分析方法主要有酶联免疫分析方法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫层析试纸条方法(Immunochromatographic strip assay,ICS)，免疫生物传感器(Immunobiosensor)等。

免疫分析方法的核心为高灵敏度、高亲和力的抗体。目前普遍使用的抗体主要为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体制备周期短，但是特异性相对较差；基于杂交瘤技术，可以获得识别灵敏度较高且特异性较强的单克隆抗体，但杂交瘤细胞存在基因背景复杂及长期传代和反复冻存复苏过程中容易出现的基因缺失或突变等问题，无法确保获得不同批次单克隆抗体的时效性和稳定性。重组抗体的出现可以有效避免杂交瘤细胞的不稳定性，解决其在长期培养过程中目标抗体产生能力下降的问题；研究者可根据已知的单克隆抗体基因序列构建重组表达质粒，并利用哺乳动物工程细胞如HEK293(F)进行重组全长IgG抗体的表达，以不断获得具有与亲本单克隆抗体一致的性质、结构和识别灵敏度的重组全长IgG抗体，进而建立更加稳定可靠的免疫快速检测方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种高灵敏度、高特异性的抗百菌清重组全长IgG抗体的制备方法。

为解决技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还公开了一种抗百菌清重组全长IgG抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。

作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示。

作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明同时公开了一种重组抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗百菌清重组全长IgG抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗百菌清重组全长IgG抗体的轻链蛋白。

本发明对一株能稳定分泌抗百菌清单抗的杂交瘤细胞株的重链和轻链可变区基因进行扩增、测序和合成，采用同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，并共转染至哺乳动物细胞HEK 293(F)中，收集培养上清，经纯化后获得抗百菌清的重组全长IgG抗体。经ELISA方法验证，该重组全长IgG抗体与传统的抗百菌清腹水单抗相比，有一致的高灵敏度和高选择性，可以代替腹水单抗，应用于百菌清残留的免疫快速检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明公开的抗百菌清重组全长IgG抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株分泌高亲和力、高特异性抗百菌清抗体的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了小鼠IgG1重链恒定区基因和小鼠kappa轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒***的哺乳动物细胞表达获得了重组全长IgG抗体，其识别活性与鼠源亲本抗体非常接近，并可以实现抗百菌清抗体的大批量标准化生产，为百菌清残留快速检测的各种免疫分析方法提供可靠的核心原料。

附图说明

图1为本发明以反转录获得的cDNA为模板，抗百菌清抗体重链可变区基因、轻链可变区基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为本发明抗百菌清重组全长IgG抗体(瞬时表达)和小鼠腹水单抗对百菌清的ELISA竞争曲线(天然小鼠腹水单抗和重组全长IgG抗体的ELISA检测中百菌清浓度从低到高依次为0.1563、0.3125、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00ng/mL)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围，如无特殊说明，实施例中的实验方法均为常规方法。

本发明涉及的抗百菌清重组全长IgG抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其重链恒定区序列为小鼠IgG1的重链恒定区序列，该抗体的轻链恒定区序列为小鼠κ抗体轻链恒定区序列。

抗百菌清重组全长IgG抗体的制备

1)抗百菌清单克隆抗体可变区基因扩增

百菌清半抗原偶联载体蛋白后免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得小鼠杂交瘤细胞，间接竞争ELISA方法筛选出一株分泌高特异性抗百菌清抗体的杂交瘤细胞株，抗体重链亚类为IgG1，轻链亚型为κ。Trizol法提取细胞株的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整后，用5’Race方法(SMARTer RACE 5/3’Kit)反转录合成特异性cDNA。其中，重链和轻链上游引物为试剂盒中自带的接头引物(5’-3’)序列为GCAGTGGTATCAACGCAGAGT，IgG1亚类重链下游特异性引物为CTCAATTTTCTTGTCCACCTTGGT，κ亚型轻链下游特异性引物为CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG。

PCR扩增的程序为：

用凝胶提取试剂盒纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-Blunt载体上，转化、测序，序列经NCBI数据库Blast比对后，获得序列完整、亚型相符和正确表达框的VH和VL基因。

抗百菌清抗体的重链可变区核苷酸序列为：

GAAGTGAAGGTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTCTTTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGAAATACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGGGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGATGACACTGGCATTTATTACTGTAGGGGCGGGGGATATTCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1)

功能性重链可变区全长为360个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码120个氨基酸，该有功能的重链V区基因为IGHV6-6*02F，匹配率为96.94％；D区基因为IGHD3-1*01(未显示拟合率，存在一定的突变)；J区基因为IGHJ4*01F，匹配率为94.34％。

以IMGT法定义结构域，具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序列	1-75	76-99	100-150	151-180	181-294	295-327	328-360

抗百菌清抗体的重链可变区氨基酸序列为：

EVKVEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSLYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYEIHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRADDTGIYYCRGGGYSFAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:2)

抗百菌清抗体的轻链可变区核苷酸序列为：

CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAGTCATGTCTGCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTCCAGCTACTTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAACATGGAGGCTGAGGATGCTGCCTCTTATTTCTGCCTTCAGTGGACTACTTACCCACGCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAGA(SEQ ID NO:3)

功能性轻链可变区全长为个324个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码108个氨基酸，该有功能的轻链V区基因为IGKV4-79*01，匹配率为97.16％，J区基因为IGKJ4*01，匹配率为94.29％。

以IMGT法定义结构域，具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序列	1-78	79-108	109-159	160-168	169-276	277-303	304-333

抗百菌清抗体的轻链可变区氨基酸序列为：

QIVLTQSPAVMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAASYFCLQWTTYPRTFGSGTKLEIR(SEQ ID NO:4)

2)表达质粒的构建

在鉴定出正确的抗百菌清抗体的重链和轻链可变区基因后，合成正确的基因序列。采用同源重组法分别将重链和轻链可变区基因连接到线性化的表达载体pcDNA3.4-Mouse-IgG1和pcDNA3.4-Mouse-Kappa上。其中，pcDNA3.4-Mouse-IgG1含有小鼠IgG1重链恒定区基因，pcDNA3.4-Mouse-Kappa含有小鼠Kappa轻链恒定区基因，故构建的重/轻链重组质粒上面分别包含了重链可变区及恒定区基因和轻链可变区及恒定区基因。分别将重链/轻链表达载体转化至T1感受态细胞、摇菌培养并测序。

3)重组全长IgG抗体的瞬时表达

将测序正确的质粒对应的菌液继续大体积培养扩增，提取质粒，待用。复苏HEK293(F)细胞,120rpm，8％CO₂，37℃悬浮培养3代。转染前，将细胞接种至新的培养瓶，接种密度为1.5×10⁶个/mL，悬浮培养2h后，将重链质粒、轻链质粒和转染试剂按照一定的比例静置孵育15min后，转染HEK293(F)细胞。转染后的细胞悬浮培养，当细胞活率低于70％收集上清培养液，4000rpm离心5min后，采用Protein A亲和层析柱纯化细胞上清中重组全长IgG抗体，纯化过程中液体流速均为1mL/min。纯化后的抗体用0.01M PBS溶液进行透析过夜，透析结束后，测定抗体浓度为0.9mg/mL。

重组全长IgG抗体的ELISA应用与性能评价

将百菌清-OVA作为包被原包被96孔板，百菌清农药标准品作为竞争物，进行间接竞争ELISA检测。灵敏度(IC₅₀)结果如下图所示(图2)，IC₅₀分别为0.87ng/mL(腹水抗体)、0.51ng/mL(瞬时表达重组抗体)，提示两者具有相似的灵敏度，证实杂交瘤细胞测序无误。

近年来，文献报道有关百菌清单克隆抗体的灵敏度情况如下：Hirakawa,Yuki,etal.报道了一种检测百菌清的表面等离子共振免疫传感器方法，其中采用前期研制的百菌清抗体所构建的间接竞争ELISA法的IC₅₀为2.5ng/mL(Development of an immunosensorfor determination of the fungicide chlorothalonil in vegetables,using surfaceplasmon resonance,Journal of agricultural and food chemistry(2015):6325-6330)；Yang,Xingdong,et al.研制的百菌清检测金标试纸条提及的IC₅₀为91.78ng/mL("Development of a colloidal gold-based strip test for the detection ofchlorothalonil residues in cucumber."Food and Agricultural Immunology(2015):729-737)；Liu,Liqiang,et al.报道了一种基于百菌清药物与6-氨基乙酸反应产生的全新半抗原，获得了能高灵敏检测百菌清的单克隆抗体，间接竞争ELISA法的IC₅₀为0.36ng/mL(Development of an anti-chlorothalonil monoclonal antibody based on a noveldesigned hapten.Food and Agricultural Immunology(2015):410-419)。但是，上述抗体的批量生产都需要依赖于杂交瘤细胞株，存在细胞株退化或丢失的风险。相比而言，本发明的抗百菌清重组全长IgG抗体不仅灵敏度更高或相似，且首次公开报道了已确证的百菌清抗体基因序列，并据此可以实现抗体的标准化生产，大大减少了批次间的差异性，可替代传统抗体构建各类免疫分析方法，适用于百菌清快速检测产品的开发与生产。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列及其重组全长IgG抗体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

gaagtgaagg ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt ctttattgga tgaactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgaaata 180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gggatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gatgacactg gcatttatta ctgtaggggc 300

gggggatatt cctttgctat ggactactgg ggtcaaggaa cgtcagtcac cgtctcctca 360

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Ile His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Asp Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Gly Gly Gly Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

caaattgttc tcacccagtc tccagcagtc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60

ttgacctgca gtgccagctc aagtgttagt tccagctact tgtactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 180

actcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag caacatggag 240

gctgaggatg ctgcctctta tttctgcctt cagtggacta cttacccacg cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaga 324

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Val Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys Leu Gln Trp Thr Thr Tyr Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105

Claims

1.一种特异性抗百菌清抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的特异性抗百菌清抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的特异性抗百菌清抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求3所述的特异性抗吡百菌清抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种抗百菌清重组全长IgG抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的抗百菌清重组全长IgG抗体，其特征在于：所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述的抗百菌清重组全长IgG抗体，其特征在于：所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

8.根据权利要求7所述的抗百菌清重组全长IgG抗体，其特征在于：所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种抗体表达质粒，其特征在于：含有如权利要求1-2中任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗百菌清重组全长IgG抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗百菌清重组全长IgG抗体的轻链蛋白。