CN103194409B

CN103194409B - 醋酸杆菌及其在制备苹果醋中的应用

Info

Publication number: CN103194409B
Application number: CN201310114214.7A
Authority: CN
Inventors: 张銮; 肖仔君; 曾彬; 钟瑞敏
Original assignee: TIANDIYIHAO BEVERAGE CO Ltd
Current assignee: TIANDIYIHAO BEVERAGE CO Ltd
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-04-03
Also published as: CN103194409A

Abstract

本发明公开了一株新分离得到的醋酸杆菌，以及采用谷壳固定化该株菌发酵苹果果醋的工艺方法。固定化醋酸杆菌可以多批次使用，且连续的批次发酵时间可到达90d以上，相应转酸率为90%以上，可简化发酵生产操作，提高生产效率，增加生产能力，且在生产后期易于细胞分离，可回收再利用。

Description

醋酸杆菌及其在制备苹果醋中的应用

技术领域

本发明属于食品发酵技术领域，涉及一株新分离的醋酸杆菌菌株及其在谷壳上吸附固定化后进行苹果果醋发酵的方法。

背景技术

苹果醋以其独特的风味和诸多的保健功能，越来越受到消费者的青睐。由苹果原醋调配而成的苹果醋饮料，近几年更是呈现出较快的增长趋势。目前市场上苹果醋饮料的种类繁多，真正以发酵为基础的苹果醋饮料并不多见。2012年5月1日首个苹果醋饮料的标准开始实施，该标准明确提出不得使用粮食等非苹果发酵产生或人工合成的食醋、乙酸、苹果酸、柠檬酸等调制苹果醋饮料。

醋酸发酵是酿造苹果醋的关键技术环节，苹果醋的风味主要源于该环节。目前，我国生产苹果醋在酒精发酵方面，虽然有较为成熟的游离细胞发酵技术，但缺乏性能稳定的苹果醋酸菌种，有的用现有的醋醅，有的用复合醋酸菌，还有的用自行选育的菌种。目前，液态发酵生产多数使用的醋酸菌为AS1.41，其耐酒精能力小于8％，最高产酸量为70～90ｇ/Ｌ，酒精转化率约70%，其中还有相当一部分醋酸被分解为二氧化碳和水，最后得到的总酸度一般在5%左右。

苹果果醋饮品中乙醇含量必须控制在较低值，这就要求苹果果醋的醋酸发酵要比较彻底。要达到这个要求，采用分批发酵方式是最合适的，工艺也相对简单。但游离醋酸杆菌细胞在醋酸发酵阶段后期随着细胞活力的下降而导致醋酸转化速率大大降低，而为了将残留乙醇尽量转化成醋酸，就必须继续延长发酵时间，这样不仅生产效率低，而且还导致苹果果醋的风味物质严重损失，最终影响产品品质和风格。采用固定化发酵可以解决此问题，目前醋酸杆菌细胞固定化方法主要有吸附法和包埋法，就目前现有醋酸杆菌固定化的专利中，主要是以海藻酸钙固定化为主，但由于醋酸杆菌属于好氧微生物，在发酵过程中为了获得足够的溶解氧，醋酸杆菌细胞最好直接暴露在发酵液中，否则会影响溶解氧的传质和醋酸发酵速度，且影响醋酸杆菌细胞的活性。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，本发明一方面涉及一种醋酸杆菌，其特征在于其保藏号为CCTCC M 2012551，保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明另一方面还涉及上述醋酸杆菌在发酵苹果果醋中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的发酵苹果果醋的工艺包括如下步骤：将谷壳载体灭菌预处理，然后将活化好的醋酸杆菌与灭菌处理好的载体和已灭菌的苹果果酒基质一起接入发酵罐，于25~32℃发酵1~5 d，然后进行固定化发酵3~8d制备苹果果醋。

本发明另一方面涉及一种固定化发酵苹果果醋的工艺方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：载体预处理：将谷壳先烘干，冷却，将谷皮适当破碎，优选地，每个谷壳成2至3片为宜；用食用酒精对谷壳进行灭菌预处理；

步骤2：将权上述醋酸杆菌进行菌种活化；

步骤3：将活化后的醋酸杆菌与步骤1处理好的载体谷壳以及已灭菌的苹果酒接入发酵罐，于25~32 ℃发酵1~5 d进行吸附，将发酵罐中的液体放出，重新输入苹果酒进行固定化发酵3~8 d。

在本发明的一个优选实施方式中，所述醋酸杆菌的接种量为1%~5%（v/v）。

在本发明的一个优选实施方式中，所述载体谷壳对醋酸杆菌细胞的负载体率大于1×10⁶个/mg 。

在本发明的一个优选实施方式中，所述苹果酒乙醇浓度为2~8%（v/v）。

微生物信息

本发明所涉及到的醋酸杆菌(Acetobactersp. CCTCC M 2012551)XZJ001首次从杨梅果酒酒醪中分离出来，已于2012年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为M 2012551，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学（邮编为430072）。

具体实施方式

醋酸杆菌的生理生化鉴定：

(1)产醋酸定性实验

将新鲜菌种接种于醋酸杆菌增殖培养基中，30℃摇床培养2天后，取培养液5 mL于试管内，氢氧化钠溶液中和至pH 7.0，加100 g/L氯化铁溶液2~3滴混匀，观察液体颜色是否变为黄红色，在火焰上煮沸，观察有无红褐色沉淀生成，清液是否变无色。增殖培养基：酵母浸膏 10 g/L，葡萄糖10 g/L， pH 4.5，121℃灭菌20min后加入30 mL/L无水酒精。

(2)乙醇氧化实验

用新鲜菌种接种乙醇氧化培养基，培养2~3天后观察，若培养基产酸变黄者为阳性反应。乙醇氧化培养基配方为：酵母浸膏 10 g/L，20 mL/L 浓度为0.4 g/L溴酚蓝水溶液，pH 6.8~7.0，121℃灭菌20min后加入40 mL/L无水酒精。

(3)过氧化氢酶测定

取一环生长于PYG琼脂斜面的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加5滴100 mL/L的H₂O₂，若有气泡产生则为阳性反应。PY基础培养基：蛋白胨5 g/L，胰酶解酪朊5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，盐溶液 40 mL/L。

PY盐溶液成分：无水氯化钙 0.2 g/L，七水硫酸镁 0.48 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，碳酸氢钠 10.0 g/L，氯化钠 2.0 g/L。

PY盐溶液制法：将氯化钙和七水硫酸镁混合溶解于300 mL蒸馏水中，再加500 mL水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌至全部溶解后加200 mL蒸馏水，混合后贮备于4℃备用。PY基础培养液内加入10 g/L葡萄糖即为PYG培养基。

(4) 石蕊牛奶实验

用新鲜菌种接种石蕊牛奶培养基，于37 ℃培养1，3，7天后观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。石蕊牛奶培养基：在100 mL 浓度为100 g/L脱脂牛奶中加入4 mL浓度为25 g/L的石蕊，分装试管，牛奶高度4-5 cm。

(5) 明胶液化实验

用新鲜菌种接种明胶液化实验培养基，置于37 ℃培养，用两只未接种的试管培养基做对照。培养2~3天后，将已接种和对照管分别置于冰箱中，若对照管凝固，接种管液化记录为阳性，同时液化或凝固则为阴性结果。

明胶基础培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 10 g/L，葡萄糖1 g/L，盐溶液 40 mL /L（与PY基础培养基同），明胶120 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

(6) 产硫化氢实验

乙酸铅试剂条的制备：将普通滤纸条剪成约0.5～0.6 cm宽的纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100 g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘箱烘干，放入培养皿或试管内，灭菌后备用。

将新鲜菌种接种产硫化氢实验培养基试管后，用无菌镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。一支不接种的试管设为空白对照，也要悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养，纸条变黑则为阳性反应。

产硫化氢实验培养基（半胱氨酸培养基）：胰蛋白胨 10 g/L，牛肉浸膏 3 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 5 g/L，半胱氨酸 0.4 g/L，葡萄糖 2 g/L，分装试管，每管培养液高度4-5 cm，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20 min。

(7) 产吲哚实验

将新鲜菌种接种产吲哚实验培养基，置于37 ℃培养。培养2-3天后，取培养液加入试管，沿管壁加入3-5 mm高的试剂于培养液表面，若液层界面出现红色则为阳性反应。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛 0.08 g，无水乙醇7.6 mL，浓HCl 1.6 mL，

产吲哚实验培养基：10 g/L胰胨水溶液，调pH 7.2～7.5，分装试管，121℃灭菌20min。

菌种的生理生化特性如表1所示，能产醋酸和硫化氢，接触酶阳性，石蕊牛奶实验阳性，能氧化乙醇，不能进行明胶液化，不产吲哚。根据形态特征和生理生化特征，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》可鉴定菌种为醋杆菌属，结合分子生物学鉴定结果，初步确定菌株XZJ001为醋酸杆菌(Acetobacter pomorum )。

表1 醋酸杆菌XZJ001生理生化鉴定实验结果

接触酶

明胶液化

产H₂S

石蕊牛奶

产吲哚

产醋酸

乙醇氧化

+

-

+

-

+

“+”：表示阳性，“-”：表示阴性。

实例1：

1）载体预处理：将谷壳先85℃ 2.5 h烘干，冷却。取谷壳300g，将谷皮适当破碎，以每个谷壳成2至3片为宜。用食用酒精按料液比1：7搅拌浸泡水浴加热至40℃ 3h，不断搅拌。纱布过滤，然后于精油提取瓶内加水回流2 h，倒出后再用纱布过滤，然后于80℃烘干，冷却后装塑料袋待用。

2）将30 g已灭菌处理的上述谷壳放入10 L发酵罐，接入200 mL扩大培养的醋酸杆菌液，然后输入6 L酒精度为2%（v/v）苹果酒，于30 ℃进行吸附固定化发酵，发酵期间溶解氧始终控制在2.0~5.0 mg/L，发酵5d得到苹果果醋，乙酸的转化率达到93%，载体对醋酸杆菌的细胞负载率为1.5×10⁶个/mg载体。

3）采用无污染方式将上述发酵罐中的液体放出，固定化醋酸杆菌保留在罐中，重新输入7 L酒精度为4.5%(v/v)的苹果酒，于28 ℃进行固定化发酵，发酵期间溶解氧始终控制在2.0~5.0 mg/L，发酵5 d得到乙酸，乙酸的转化率达到90%以上。重复上述操作，进行了18批次发酵，转酸率均介于90%~95%之间，固定化细胞活性持续时间达到96 d。

实例2：

1）将谷壳先:90℃ 2.0 h烘干，冷却。取谷壳300g，适当破碎，以每个谷壳成2至3片为宜。用食用酒精按料液比1：5搅拌浸泡水浴加热至40℃ 3h，不断搅拌。纱布过滤，然后于提取瓶内加水回流2 h，倒出后再用纱布过滤，然后于70℃烘干，冷却后装塑料袋待用。

2）将25 g已灭菌处理的上述谷壳放入10 L发酵罐，接入300 mL扩大培养的醋酸杆菌液，然后输入5 L酒精度为2%（v/v）苹果酒，于30 ℃进行吸附固定化发酵，发酵期间溶解氧始终控制在2.0 ~5.0 mg/L，发酵5 d得到乙酸，乙酸的转化率达到92%，载体对醋酸杆菌的细胞负载率为6.1×10⁶个/mg载体。

3）采用无污染方式将上述发酵罐中的液体放出，固定化醋酸杆菌保留在罐中，重新输入5 L酒精度为4.0%(v/v)的苹果酒，于30 ℃进行固定化发酵，发酵期间溶解氧始终控制2.0 ~5.0 mg/L，发酵5 d得到苹果果醋，乙酸的转化率达到95%。重复上述操作，进行了20批次发酵，转酸率均介于90%~96%之间，固定化细胞活性持续时间达到115 d。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种醋酸杆菌 (Acetobacter pomorum) XZJ001，其特征在于其保藏号为CCTCC NO：M 2012551，保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的醋酸杆菌在发酵苹果果醋中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：将谷壳载体灭菌预处理，然后将活化好的醋酸杆菌与灭菌处理好的载体和已灭菌的苹果酒一起接入发酵罐，于25~32℃发酵1~5d，将发酵罐中的液体放出，然后重新输入苹果酒进行固定化发酵3~8d制备苹果果醋。

4.一种固定化发酵苹果果醋的工艺方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：载体预处理：将谷壳先烘干，冷却，将每个谷壳破碎为2至3片；用食用酒精对谷壳进行灭菌预处理；

步骤2：将权利要求1所述的醋酸杆菌进行菌种活化；

步骤3：将活化后的醋酸杆菌与步骤1处理好的谷壳载体以及已灭菌的酒精度为2~8%（v/v）的苹果酒接入发酵罐，所述醋酸杆菌接种量为1%~5%（v/v），于25~32℃发酵1~5d进行吸附，谷壳对醋酸杆菌的负载率大于1×10⁶个/mg，将发酵罐中的液体放出，重新输入苹果酒进行固定化发酵3~8d。