CN103190393A - 一种生物样本玻璃化冷冻载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物样本玻璃化冷冻载体以及快速、简便、密闭式无菌冷冻生物样本的方法。具体地，所述的载体包括本体和密封帽，其中所述本体近端和密封帽内底面相互密封形成一密闭的冷冻样本放置区，所述的冷冻样本放置区设有一冷冻样本放置平台，并且所述的本体设有冷冻液体流通通道，且所述密封帽设有与所述冷冻液体流通通道相对应的导流孔，使得进行生物样本冷冻时，在所述通道内流通的冷冻液体与所述的冷冻样本放置区的外表面接触并冷却所述冷冻样本放置区内的生物样本。本发明生物样本玻璃化冷冻载体及方法具有安全、无毒、玻璃化冷冻及复温操作效率高等优势，在生物样本冷冻领域有广阔的运用前景。

Description

一种生物样本玻璃化冷冻载体及其用途
技术领域
本发明涉及生物样品冷冻装置领域，具体地，包括为辅助生殖技术领域中用于无菌玻璃化冷冻胚胎或***提供安全有效、操作简易的密闭式冷冻载体。
背景技术
在人工辅助生殖技术中，将体外受精后得到的多个胚胎或者从女性体内取出的多个卵子放入-196℃的液氮冻存，以供短期或长期的择期胚胎移植，成为了提高体外受精、胚胎移植成功率的常用方法。玻璃化冷冻生物样本其临床意义在于在冷却剂如液氮中可长期存储，经冷却剂冻存的胚胎或细胞会停止发育并可保存数十年，第二是冻存生物样本在复温后，可恢复一个或多个生物学意义上的活细胞。
当常温材料冻存时，常温材料与极低温冷却剂，如液氮相遇时产生的莱顿弗罗斯特效应，会在冻存材料表面形成阻隔热传导汽膜，并减慢所需冻存材料的降温速度，一般需增加冷冻保护剂浓度来防止生物样本冷冻过程中冰晶化的形成，而高浓度冷冻保护剂对生物样本具毒害性，导致复苏后的细胞质量降低，因此，追求快速冷冻的玻璃化冷冻技术得到发展。
目前，为了加快冷冻速率，国内外玻璃化冷冻载体较普遍的都采用开放式，有拉伸麦管法、石英毛细管法、Cryoloop法、Cryotip法等。2005年，Kuwayama提出了通过最小化溶液体积提高冷却速率的新方法--Cryotop法等，即将载有样本的冷冻载体直接浸入液氮中。但由于生物样本与液氮直接接触，不能提供生物样本储存的无菌环境，存在交叉污染风险，且液氮对细胞的直接毒性作用也未可预测（Covo A,Domingo J,Perez S,et al.Vitrification:an effectivenew approach to oocyte banking and preserving fertility in cancerpatients[J].Clin Transl Oncol,2008,10(5):268-273;封闭式麦管玻璃化冷冻法用于人早期胚胎冷冻效果观察，山东医药2010年底50卷第15期；），而新近的研究更表明，液氮中的低分子化合物对生物样本具有毒性（YPanagiotidis,P Vanderzwalmen,Y Prapas,E kasapi，et，al Open versusclosed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme:a prospective randomized study.Reproductive BioMedicine Online,InPress,Uncorrected Proof,Mar2013）。专利申请（200710192245.9）公开了一种阻止外源病源性物质污染生物样本的密封型玻璃化冷冻装置，但尽管做到了与冷却剂隔离的封闭体系，但由于需要热塑封闭等各种步骤，该类型的冷冻载体的操作仍显复杂。
因此，本领域迫切需要开发一种玻璃化冷冻效率高、操作方便、安全无毒的生物样品密闭式冷冻装置。
发明内容
本发明提供的高效玻璃化冷冻且操作简易的生物样本密闭保存装置。
本发明提供了一种生物样本玻璃化冷冻载体，所述的载体包括本体和密封帽，其中所述本体的近端和密封帽底部相互密封形成一密闭的冷冻样本放置区，所述的冷冻样本放置区设有一冷冻样本放置平台，
并且所述的本体设有冷却剂流通通道，且所述密封帽设有与所述冷却剂流通通道相对应的导流孔，使得进行生物样本冷冻时，在所述通道内流通的冷却剂与所述的冷冻样本放置区的外表面接触并冷却所述冷冻样本放置区内的生物样本。
在另一优选例中，在所述通道内流通的冷冻液体与所述的冷冻样本放置平台的外表面直接接触，从而冷却放置于所述冷冻样本放置平台上的生物样本。
在另一优选例中，在用生物样本玻璃化冷冻载体进行生物样本冷冻时，在所述的玻璃化冷冻载体外所流动的冷冻剂，与所述的冷冻样本放置平台的外表面直接接触，从而冷却放置于所述冷冻样本放置平台上的生物样本。
在另一优选例中，所述的本体近端和密封帽之间还设有密封垫圈。
在另一优选例中，所述的冷冻样品放置平台为一适宜样本大小的平坦表面；
并且(a)被设置于设于所述本体近端的顶部，或者被固定于所述本体近端的顶部；
或(b)被设置于所述密封帽的底部（尤其是内底面）；或被固定于所述密封帽的底部。
在另一优选例中，所述的冷冻样品放置平台与所述本体近端顶面在同一水平面；或所述的冷冻样品放置平台低于所述的本体近端顶面水平。
在另一优选例中，所述的的冷冻样品放置区高度为0.5-5mm
在另一优选例中，所述的放置平台成型方式包括与载体本体或密封帽一体成型、粘接成型、扣接成型。
在另一优选例中，所述的生物样本包括：细胞、组织、器官。
在另一优选例中，所述的细胞包括***、胚胎细胞。
在另一优选例中，所述的本体还包括本体远端的持握部以及位于本体近端和远端之间的、用于和密封帽密封啮合的啮合部。
在另一优选例中，所述的通道包括位于所述持握部的远端开口以及设于所述本体侧壁的侧开口，且所述的远端开口和所述的侧开口相连通。
在另一优选例中，所述的远端开口自所述持握部向所述本体中心内部延伸至所述本体近端，与冷冻样品放置平台共同构成远端设有开口并中空的所述本体。
在另一优选例中，所述本体侧壁的侧开口位于所述冷冻样品放置区和所述啮合部之间，更佳地，所述本体侧壁的侧开口紧贴于所述冷冻样品放置区。
在另一优选例中，所述本体侧壁的侧开口为至少2个，更佳地，为4-6个。
在另一优选例中，所述的啮合部表面设有用于与密封帽密闭啮合的活动紧固部件。
在另一优选例中，所述的活动紧固部件包括螺旋紧固部件、套接紧固部件、扣接紧固部件。
在另一优选例中，所述的密封帽外顶面或侧面设有一样本信息标记区。
在另一优选例中，所述的密封帽具有不同色彩，用以区别不同发育周期的胚胎、不同类别细胞或组织。
在另一优选例中，所述的平台直径1-15mm，较佳地，为3-12mm，更佳的为5-10mm；最佳地，为6-8mm；和/或
所述的平台厚度为0.06-0.15mm，较佳地，为0.07-0.12mm，更佳地0.08-0.10mm；和/或
所述生物样本放置区高度为0.5-5mm，优选的为1-4mm，更优选的为2-3mm。
在另一优选例中，所述的载体在放置生物样本后的冷冻速率至少为10000-20000℃/分钟？；较佳地，为30000-50000℃/分钟；更佳地，为60000-100000℃/分钟。
在另一优选例中，所述的本体及密封帽材料相同或不同，且选自下组：高分子材料、金属；和/或
所述的载体平台材料选自下组：高分子材料、金属。
在另一优选例中，所述的高分子材料包括PE（聚乙烯）、HDPE(高密度聚乙烯)；PP（聚丙烯）；PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）；
在另一优选例中，所述的金属包括不锈钢、钛合金。
在另一优选例中，所述的高分子材料或金属为医用高分子材料或医用金属。
在另一优选例中，所述的持握部直径6-15mm，所述远端开口直径2-10mm；和/或
所述的本体侧开口的大小为1-3mm×1-3mm；和/或
所述的密封帽导流孔大小为2-5mm×2-5mm。
在另一优选例中，所述的冷冻液体流通通道呈阶梯状、去顶圆柱状。
在另一优选例中，所述的本体侧开口可以是圆形孔、椭圆孔、异形孔或扁平孔。
在另一优选例中，所述的本体侧开口至少为2个，更佳地为4-6个，所述的密封帽导流孔孔至少为2个，更佳地为4-6个。
本发明第二方面，提供了一种生物样本的密闭式玻璃化冷冻方法，包括步骤：
a）提供本发明第一方面所述生物样本玻璃化冷冻载体，所述的载体包括本体和密封帽，并且将所述的生物样本，放置于所述生物样本玻璃化冷冻载体的冷冻样本放置平台上，从而形成含生物样本的载体本体；
b）将步骤a）的含生物样本的载体本体与所述密封帽啮合并拧紧，从而形成含生物样本的密封载体；
c）将步骤b）的含生物样本的密封载体在标记区进行样本信息标记；
d）将步骤c）已标记有生物样本信息的密封载体置入冷却剂中保存。
在另一优选例中，所述的生物样本的密闭式玻璃化冷冻方法还包括对含有生物样本的密封载体进行标记；和/或对冷冻载体进行标记后放置生物样本并进行密封，从而得到已标记的生物样本密封载体。
本发明第三方面，提供了一种生物样本冻存组合装置，所述的组合装置包括i）一个或多个本发明第一方面所述的载体；ii）液氮；和iii）液氮储存装置。
本发明还提供了一种本发明第一方面所述的生物样本密闭式玻璃化冷冻载体的用途，用于对生物样本进行密闭冷冻保存。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明生物样本玻璃化冷冻载体一的装配示意图。
图2显示了本发明生物样本玻璃化冷冻载体二的装配示意图。
图3显示了本发明生物样本玻璃化冷冻载体三的装配示意图。
其中，附图标记对应的载体各部件名称及功能如下：
1冷冻液体流通通道；2导流孔；4侧孔；5远端开口；10密封帽；11样本标记区；12持握部；13远端；20冷冻样品放置平台；22密封圈；23冷冻样品放置区；24近端。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了一种用于生物样品密闭冷冻保存的载体及装置。试验证明，本发明载体的所设计的冷却剂流通通道、冷却剂导流孔及生物样品冷冻平台在使生物样品与冷冻液密闭隔离的同时，仍能达到高效的玻璃化冷冻效果，复温后胚胎成活率高，且操作简单。在此基础上，完成了本发明。
冷冻样品放置平台及放置区
本发明本体近端与本发明密封帽的内底面互相密封形成一密闭的冷冻样本放置区，且所述的冷冻样本放置区设有一冷冻样本放置平台。
所述的平台可固定连接于所述本体近端的顶面，与所述本体近端共同构成近端封闭的中空状本体结构。其中，所述平台的平面可以与所述本体近端的顶面在同一水平，或低于本体近端的顶面。且所述平台可通过各种常规的固定连接方式与本体近端顶面固定，通常，可以为与本体压模成型、通过高分子粘结物质与本体近端连接，或通过扣接连接扣合于本体近端。一种优选的连接方式为与本体压模成型。
所述的平台还可以固定连接于所述密封帽的内底面。当所述平台与所述密封帽连接后，所述的本体倒扣入密封帽，并由本体近端与平台嵌合，并形成密闭的冷冻样本放置区。
通常，沿着所述的冷冻样品放置区的周径，均设有密封圈，用于密闭本体近端和密封帽之间的空隙，保障冷冻样品放置区达到的密闭，有效隔离生物样本与冷却剂的接触，从而防止冷冻剂中的未知病原体等毒性物质对生物样本的交叉污染与毒害。
本发明冷冻样品放置平台的材料为无毒且可以耐受骤冷与骤热温度变化的医用高分子材料、金属。通常，可用于本发明冷冻样品放置平台的材料包括PE、HDPE、PET、PP、医用不锈钢、医用钛合金。
本发明冷冻样品放置平台的其特征在于，所述的平台直径1-15mm，较佳地，为3-12mm，更佳的为5-10mm；最佳地为6-8mm；和/或载体平台的厚度为0.06-0.15mm，较佳地，为0.07-0.12mm，更佳地0.08-0.10mm。
此外，本发明生物样本玻璃化冷冻载体的尺寸可以根据所需冷冻的生物样本具体大小及多余冷冻保护剂的移除的操作而改变。通常，冷冻载体平台的直径可以为1-15mm，高度0.5-5mm。
冷冻液流通通道
可用于本发明的冷却剂流通通道包括以下部分：
（a）位于本体远端的远端开口；
（b）位于本体近端的侧开口；
（c）位于密封帽侧壁、与本体近端侧开口位置相对应的导流孔。
其中，所述的远端开口、侧开口经由本体中心内部相互连通，且对应于位于所述的密封帽侧壁的导流孔。所述的侧开口位于本体近端，更佳地，所述的侧开口紧贴于冷冻样品放置平台。
通常，所述的侧开口和导流孔分别至少为两个，更佳地为四个或更多。
在本发明中，当密封帽与本体相互闭合密封后，置入冷冻液体中，冷冻液体可经冷冻液流通通道由远端开口-侧开口-导流孔循环交流，如此，冷却剂流动的过程，即可使生物样本载体平台表面进行预冷，由于载体平台的足够薄，从而降低leidenfrost效应，使位于冷冻放置平台的组织样本迅速冷却。
在本发明中，所述本体侧开口直径1-3mm，或2×3mm椭圆横向孔，所述的密封帽导流孔直径为2-5mm×2-5mm的椭圆横向孔。
可用于本发明的远端开口或本体侧开口或导流孔的立体形状没有特别限制，可以为任何有利于冷冻剂流通的、互相对应匹配的形状，通常，本发明中各开口或导流孔的立体形状呈阶梯状、去顶圆柱状。
快速冷冻生物样本的方法
本发明中快速冷冻生物样本的方法，包括步骤：
a）提供权利要求1所述生物样本玻璃化冷冻载体，所述的载体包括本体和密封帽，并且将所述的生物样本，放置于所述生物样本玻璃化冷冻载体的冷冻样本放置平台上，从而形成含生物样本的载体本体；
b）将步骤a）的含生物样本的载体本体与所述密封帽啮合并拧紧，从而形成含生物样本的密封载体；
c）将步骤b）的含生物样本的密封载体在标记区进行样本信息标记；
d）将步骤c）已标记有生物样本信息的密封载体置入冷却剂中保存。
通常，所述的生物样本的密闭式玻璃化冷冻方法还包括对含有生物样本的密封载体进行标记；和/或对冷冻载体进行标记后放置标本并进行密封，从而得到已标记的密封载体。
使用本发明玻璃化冷冻载体以及快速冷冻生物样本的方法，可达到20000℃/分钟的冷却速率，更佳地，40000-100000℃/分钟的冷却速率，视采用载体平台不同材料或大小而获得不同的冷却速率和生物样本玻璃化效果。
此外，本发明中的载体在应用于实验或诊疗时，需进行无菌化处理后使用，并在操作过程中保持无菌环境。
材料与外观
可用于制备本发明生物样本玻璃化冷冻载体的材料为无毒，并经过无菌处理，且可以耐受骤冷与骤热温度变化的高分子材料或金属。
在另一优选例中，所述的高分子材料包括PE（聚乙烯）、HDPE(高密度聚乙烯)；PP（聚丙烯）；PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）。
在另一优选例中，所述的金属包括不锈钢、钛合金。
在另一优选例中，所述的高分子材料或金属为医用高分子材料或医用金属。
在本发明中，本体与密封帽以相互扣接或螺纹旋转连接等各种活动套接方式相互扣合密封。通常，所述的扣接或螺纹旋转连接装置可以通过各种常规方法达到密封的效果，如增加可以耐受骤冷与骤热温度变化的密封圈，如改变螺纹的形态或角度等，保证密闭装置在骤冷骤热过程中的密闭自锁。
本发明中的本体和密封帽的外观形状没有特别限制，可以为任何互相匹配的柱形外观，如圆柱形、六角柱形，从而便于操作者持握以及在放置胚胎、卵子等生物样本时载体的稳定。此外，本发明的本体和密封帽可以采用各种不同色彩，以区分载体用于不同生物样本、组织、细胞等的冻存标识。
本发明的有益效果：
1.密封保存生物样本，安全无毒：本发明载体及方法用于将生物样本与冷冻液体隔离、密闭保存，安全无污染，减少了冷冻液体对生物样本的潜在毒性危险。
2.冷冻速率快，达到高效玻璃化冷冻：采用本发明载体以及方法可以达到10000-100000℃/分钟的冷冻速率，视采用载体平台不同材料或大小而获得不同的冷却速率和生物样本玻璃化效果。从而起到快速玻璃化冷冻并避免生物样本冷冻过程中受冰晶破坏的影响。
3.操作方便：本发明载体采用螺纹紧固或套接、扣接式紧固等密封方式，操作时仅需将生物样本放置于平台后拧紧密封帽，即可放入液氮储存，代替了传统热塑密封的复杂程序。
4．安全有效：由于本装置的特殊结构及操作简易，在样本升温后取出如同样本装载一般方便，升温后不易发生生物样本的丢失。
实施例1：密封性能测试
各取50套密闭式玻璃化冷冻载体一（如图1）和载体三（如图3），灭菌后，分别放入液氮中一天、一周、30天、60天、90天后，于液氮中取出，迅速投入37℃水中，放置10分钟，取出后放于滤纸上站立数秒，打开密封帽，用干净滤纸擦拭放置平台，镜下观察滤纸有否水印，结果如表1所示：
表1
Figure BDA00003027868600081
结果表明，该装置密闭性能达到100%。
实施例2：卵或胚胎存活率
1．实验对象
实验动物为清洁级昆明小鼠（购自上海生物制品研究所）,雌性为9周龄,29-33g/只,共80只,
雄性为9周龄,体重38-45g/只,共20只,光照采用12h明暗交替。
2实验方法：
1）***收集：短颈处死超促***性成熟昆明雌性小鼠分离输卵管，取透明带完整，胞间质折光性好的***（透明带和胞膜无损伤,卵周隙清楚,无胞质外漏或***萎缩,大小正常,胞浆均质折光好）。
2）***收集：受精当日，断柱处死健康雄性小鼠获得***。
3）体外受精：以2×106/ml浓度***与卵子共同孵育，5小时后取出，卵子24小时37℃5%CO2培养箱中培养后，观察双原核细胞的形成。
4）冷冻载体：各取80套经灭菌后的本发明冷冻载体一（图1）、二（图2）、三（图3），装载好挑选合格的原核胚后于液氮冷冻，3天后取出，复温，培养，观察其胚胎***情况。
其中，2细胞胚胎数为受***培养后1天获得的存活2***细胞胚胎数；4细胞数为受***培养后48小时后获得的存活4***细胞胚胎数；囊胚数为受***培养后96小时获得的进入囊胚期的细胞数。
3.本发明装置对小鼠原核胚胎冷冻的结果如表2所示：
表2
冷冻载体 原核胚胎数（个） 2细胞率（%） 4细胞率（%） 囊胚率（%）
装置一 80 75.00（60/80） 65.00(39/60) 51.67(31/60)
装置二 80 81.25(65/80) 72.30(47/65) 66.15(43/65)
装置三 80 83.75(67/80) 76.12(51/67) 73.13(49/67)
注：2细胞率=2细胞胚胎数/原核胚胎数；4细胞率=4细胞胚胎数/2细胞胚胎数；囊胚率=囊胚数/2细胞胚胎数。
5.结论
在本领域中，使用开放或封闭式冷冻载体对生物样本（胚胎）进行玻璃化冷冻时，囊胚率约为50%-70%。由本实施例的结果可见，使用本发明载体进行玻璃化冷冻胚胎，囊胚率分别为51.67%、66.15%和73.13%，其结果与本领域其他装置和方法的囊胚率是相近甚至是更优异的。此外，本发明载体还具有操作简单、安全性高的优点，因此，可以替代传统装置与方法，适于广泛应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种生物样本玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述的载体包括本体和密封帽，其中所述本体的近端和密封帽底部相互密封形成一密闭的冷冻样本放置区，所述的冷冻样本放置区设有一冷冻样本放置平台，
并且所述的本体设有冷却剂流通通道，且所述密封帽设有与所述冷却剂流通通道相对应的导流孔，使得进行生物样本冷冻时，在所述通道内流通的冷却剂与所述的冷冻样本放置区的外表面接触并冷却所述冷冻样本放置区内的生物样本。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的冷冻样品放置平台为一适宜样本大小的平坦表面；
并且(a)被设置于设于所述本体近端的顶部，或者被固定于所述本体近端的顶部；
或(b)被设置于所述密封帽的底部（尤其是内底面）；或被固定于所述密封帽的底部。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的本体还包括本体远端的持握部以及位于本体近端和远端之间的、用于和密封帽密封啮合的啮合部。
4.如权利要求1或3所述的载体，其特征在于，所述的通道包括位于所述持握部的远端开口以及设于所述本体侧壁的侧开口，且所述的远端开口和所述的侧开口相连通。
5.如权利要求1或3所述的载体，其特征在于，所述的啮合部表面设有用于与密封帽密闭啮合的活动紧固部件。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的平台直径1-15mm，较佳地，为3-12mm，更佳的为5-10mm；最佳地，为6-8mm；和/或
所述的平台厚度为0.06-0.15mm，较佳地，为0.07-0.12mm，更佳地0.08-0.10mm；和/或
所述生物样本放置区高度为0.5-5mm，优选的为1-4mm，更优选的为2-3mm。
7.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的载体在放置生物样本后的冷冻速率至少为10000-20000℃/分钟？；较佳地，为30000-50000℃/分钟；更佳地，为60000-100000℃/分钟。
8.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的本体及密封帽材料相同或不同，且选自下组：高分子材料、金属；和/或
所述的载体平台材料选自下组：高分子材料、金属。
9.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的持握部直径6-15mm，所述远端开口直径2-10mm；和/或
所述的本体侧开口的大小为1-3mm×1-3mm；和/或
所述的密封帽导流孔大小包为2-5mm×2-5mm。
10.如权利要求1所述的，其特征在于，所述的本体侧孔至少为2个，更佳地为4个，所述的密封帽导流孔孔至少为2个，更佳地为4-6个。
11.一种生物样本的密闭式玻璃化冷冻方法，其特征在于，包括步骤：
a）提供权利要求1所述生物样本玻璃化冷冻载体，所述的载体包括本体和密封帽，并且将所述的生物样本，放置于所述生物样本玻璃化冷冻载体的冷冻样本放置平台上，从而形成含生物样本的载体本体；
b）将步骤a）的含生物样本的载体本体与所述密封帽扣合并拧紧，从而形成含生物样本的密封载体；
c）将步骤b）的含生物样本的密封载体在标记区进行样本信息标记；
d）将步骤c）已标记有生物样本信息的密封载体置入冷却剂中保存。
12.一种生物样本冻存组合装置，其特征在于，所述的组合装置包括i）一个或多个权利要求1所述的载体；ii）液氮；和iii）液氮储存装置。
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