CN103190344A - 一种灰楸的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灰楸组织培养方法，包括：采集灰楸母树一年生萌生枝条依次进行枝条水培催芽、无菌化处理、芽的诱导和增殖、不定芽生根培养、炼苗与移栽，得到灰楸组培苗。本发明方法选择特定的健壮无病虫害灰楸母本，通过特定的组织培养技术和培养条件，能够在短时间内获得大批量优质灰楸组培苗，满足科研和生产所需；与其他繁殖方法相比，本发明需要的母本材料少，有1～2个茎段即可大批量繁殖，且更好地保持母本的优良性状，将幼苗移栽室外，成活率能达到95%以上；繁殖速度快，苗木质量好，出苗率高；无需培育砧木与接穗，极大地减少占地面积，并降低人力及管理成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种木本植物的组织培养方法，尤其是涉及一种灰楸的组织培养方法。
背景技术
灰楸（Catalpa fargesii）为紫葳科（Bignoniaceae）梓树属（Catalpa）高大落叶乔木，是我国传统栽培的优质珍贵用材及园林观赏树种。其分布范围广，主要分布于我国中西部地区，以渭河、泾河、汾河流域及秦岭山地为集中区，散生于村庄周边及山谷中。灰楸根系发达，生长速度快，抗风、固土能力强，耐寒耐旱，材质纹理通直、坚韧致密，是优质速生用材树种。
通常，灰楸通过嫁接和扦插来繁殖。嫁接繁殖需提前1年培育砧木（梓树），翌年采集母本1年生枝条或苗干上的芽作为接穗；嫁接过程中，由于接穗直径生长一般大于砧木，导致接口愈合较差，成活率一般在70%左右，嫁接苗抗风性较弱，且砧木基部多萌芽，需不断抹芽，增加了管理成本。扦插繁殖需采集当年生枝条、苗干或根进行埋干（根）催芽，采集半木质化嫩枝进行扦插，对催芽床和扦插床温、湿度及空气相对湿度要求较为严格，管理成本高，扦插成活率较低，一般为50%左右。
组织培养是一种高效的无性繁殖方式，繁殖效率高且成本较低，是解决灰楸优良无性系快繁的有效手段，目前尚未见有关灰楸优良无性系组织培养方面的报道。
发明内容
为了克服嫁接和扦插等无性繁殖技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种灰楸的组织培养方法，该方法可以高效地获得优质的灰楸组培苗。
本发明提供的灰楸组织培养方法，包括：采集灰楸母树一年生萌生枝条依次进行枝条水培催芽、无菌化处理、芽的诱导和增殖、不定芽生根培养、炼苗与移栽，得到灰楸组培苗。
所述枝条水培催芽包括：采集灰楸母树一年生萌生枝条，在室内水培（自来水）催芽后，摘取萌发芽。最好待萌发芽长度为10cm左右，最优选8～12cm时摘取。
所述无菌化处理包括：将水培催芽后的萌发芽用自来水冲洗30min，之后用质量浓度为10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，之后再经无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。
所述芽的诱导和增殖包括：将无菌化处理过的萌发芽截成茎段，然后接种于诱导培养基上，培养35～50天，得到分化芽；然后再将该分化芽截成茎段接种于增殖培养基上，培养30～45天后形成不定芽。
优选地，无菌化处理过的萌发芽截成的茎段，以及分化芽截成 的茎段上至少有一个腋芽。
更优选地，所述芽的诱导和增殖包括：将无菌化处理过的萌发芽截成长度为1.5cm左右，最优选1.4～1.6cm的茎段，然后接种于诱导培养基上，培养35～50天，得到分化芽；然后再将该分化芽截成长度为1.0cm左右，最优选0.8～1.2cm的茎段接种于增殖培养基上，培养30～45天后形成不定芽。
其中，所述芽的诱导分化和增殖培养所用培养基为DKW基本培养基，还包括：0.6～1.4mg·L-16-BA（6-苄基氨基嘌呤，benzylaminmopurine），0.1～0.3mg·L-1IBA（吲哚丁酸，Indole-3-Butytric acid），25g·L-1蔗糖和4.5g·L-1琼脂。优选为：DKW基本培养基，0.75～1.2mg·L-16-BA，0.13～0.23mg·L-1IBA，25g·L-1蔗糖和4.5g·L-1琼脂。
进一步地，所述芽的诱导分化和增殖培养基的pH为5.8。
进一步地，芽的诱导分化过程中，培养3天后，茎段腋芽处芽开始膨大；8～10天茎段基部愈伤组织开始膨大；共诱导培养35～50天（优选40～48天）分化芽的芽长大于0.7cm。
进一步地，将该分化芽截成茎段接种于增殖培养基上，培养8～10天后开始增殖分化形成不定芽，30～45天（优选34～40天）后不定芽可以长到1.0cm以上。
所述不定芽生根培养包括：将增殖得到的不定芽截成茎段，转接入生根培养基中诱导生根，28～40天后长成生根苗。
其中，所述不定芽生根培养所用的培养基为1/2MS基本培养基，还包括：0.25～0.35mg·L-1IBA，0.025～0.035mg·L-1NAA（萘乙酸，1-naphthlcetic acid），10g·L-1蔗糖和5.0g·L-1琼脂。优选为：1/2MS基本培养基，0.28～0.32mg·L-1IBA，0.029～0.032mg·L-1NAA，10g·L-1蔗糖和5.0g·L-1琼脂。
进一步地，所述不定芽生根培养基的pH为5.8。
优选地，将不定芽截成至少带一叶片的茎段。
更优选地，30～45天后，将不定芽截成1.5cm左右长的茎段。
其中，不定芽在诱导生根过程中，5～6天后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，8～10天后开始生根，28～40天（优选30～40天）后即得到生根苗（28～40天（优选30～40天）后幼苗可长1.0～2.5cm）。
所述炼苗与移栽包括：将不定芽生根培养出的生根苗置于温室中炼苗（16～20天）后移栽，移栽后用遮阴网遮阴。
其中，生根苗置于温室中适应环境6～8天松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10～12天后移栽。
其中，生根苗移栽的基质为泥炭土：珍珠岩（V/V）=3～5:1，优选4:1。
进一步地，生根苗移栽的基质还可包含多菌灵，用量为200g/m3。
其中，所述的芽的诱导和增殖、不定芽生根培养的温度均为22～26℃，光照强度均为1800～2200勒克斯(lx)，光照时间均为12～15小时/每天。优选：光照强度均为2000勒克斯(lx)，光照时间均为14小时/天。
和现有的楸树的组织培养方法相比：
①楸树和灰楸的区别：楸树和灰楸是都属于紫葳科梓树属的两个不同的种，其分布区、生长、适应性、材性具有很大的差异；
②楸树已有成熟的组织培养方法，但是目前还未有成熟的灰楸组织培养方法，依据目前所具有的楸树组织培养方法，无法正常、高效进行灰楸的组织培养。
因此，本发明方法选择特定的健壮无病虫害灰楸母本，通过特定的组织培养技术和培养条件，能够在短时间内获得大批量优质灰楸组培苗，满足科研和生产所需。与其他繁殖方法相比，本发明需要的母本材料少，有1～2个茎段即可大批量繁殖，且更好地保持母本的优良性状，将幼苗移栽室外，成活率能达到95%以上；繁殖速度快，苗木质量好，出苗率高；无需培育砧木与接穗，极大地减少占地面积，并降低人力及管理成本。
附图说明
图1为根据实施例1水培催芽30天后得到的萌发芽。
图2为根据实施例1无菌化材料培养诱导15天后得到的分化芽。
图3为根据实施例1无菌化材料诱导培养45天后得到的分化芽。
图4为根据实施例1分化芽转接诱导增殖40天后得到的不定芽。
图5为根据实施例1不定芽转接生根诱导培养30天后得到的生根苗。
图6为根据实施例1不定芽转接生根诱导培养30天后得到的生根苗根系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所涉及的基本培养基的配方如下：
DKW基本培养基的标准配方：
MS基本培养基（Murashing and Skoog medium，1962）的标准配方：
1/2基本MS培养基，即大量元素组成成分各减半（其他元素不减半）的MS培养基（Murashing and Skoog medium,1962）的标准配方：
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明取灰楸母树一年生萌生条进行水培催芽，具体为：取灰楸母树一年生萌生枝条，在室内水培（自来水）催芽，待芽长10cm左右摘取。
本发明所给出的天数，都是从开始培养起进行计算的。
实施例1
一种灰楸的组织培养方法，取灰楸母树一年生萌生枝条，在室内进行水培（自来水）催芽，待萌发呀长度达到8cm以上后，摘取萌发芽（如图1所示），接下来包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，9d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，待分化芽的芽长大于1.0cm后（诱导培养共45天），取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，35d后可以长到2.2cm，增殖系数为8.8。
（3）不定芽的生根培养
取长度大于1.5cm的增殖分化芽，截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基：1/2MS基本培养基＋0.3mg·L-1IBA＋0.03mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），5d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，10d后开始生根，共生根培养30d后幼苗可长1.2cm。
（4）炼苗与移栽
生根培养根系长至2.5cm时（生根培养30～40d后），将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为99%。生根苗移栽的基质为泥炭土：珍珠岩（V/V）=4:1，并且用多菌灵灭菌，用量为200g/m3。芽的诱导和增殖、不定芽生根培养的温度均为25℃，光照强度均为2000勒克斯(lx)，光照时间均为14小时/每天。
培养过程中，各阶段的图片如图2～图6所示。
实施例2
一种灰楸的组织培养方法，在取灰楸母树一年生萌生枝条进行水培催芽后，包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋0.8mg·L-16-BA＋0.15mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导分化和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，10d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，培养40d后分化芽芽数达到5个，芽长2.86cm；取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，36d后增殖分化芽数4.7个，分化芽长2.97cm，增殖系数为14。
（3）不定芽的生根培养
取增殖分化芽（长度大于1.5cm），截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基：1/2MS基本培养基＋0.31mg·L-1IBA＋0.029mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），5d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，10d后开始生根，32d后幼苗发根数为1.13个，根长0.734cm，幼苗新芽长1.197cm。
（4）炼苗与移栽
生根培养36d后，将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为98%。其他条件同实施例1。
实施例3
一种灰楸的组织培养方法，在取灰楸母树一年生萌生条进行水培催芽后，包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋1.2mg·L-16-BA＋0.16mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导分化和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，8d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，培养38d后分化芽芽数3.43个，芽长0.765cm；取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，34d后增殖分化芽数3.567个，分化芽长1.672cm，增殖系数为6.0。
（3）不定芽的生根培养
取长度大于1.5cm的增殖分化芽，截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基：1/2MS基本培养基＋0.29mg·L-1IBA＋0.03mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），5d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，10d后开始生根，36d后幼苗发根数为3.3个，根长0.906cm，幼苗新芽长0.736cm。
（4）炼苗与移栽
生根培养32d后，将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为96%。其他条件同实施例1。
实施例4
一种灰楸的组织培养方法，在取灰楸母树一年生萌生条进行水培催芽后，包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋0.9mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导分化和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，10d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，培养48d后分化芽芽数2个，芽长0.506cm；取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，43d后增殖分化芽数4.033个，分化芽长1.893cm，增殖系数为7.6。
（3）不定芽的生根培养
取增殖分化芽（长度大于1.5cm），截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基:1/2MS基本培养基＋0.32mg·L-1IBA＋0.031mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），6d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，8d后开始生根，38d后幼苗发根数为1.433个，根长1.249cm，幼苗新芽长0.488cm。
（4）炼苗与移栽
生根培养30d后，将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为99%。其他条件同实施例1。
实施例5
一种灰楸的组织培养方法，在取灰楸母树一年生萌生条进行水培催芽后，包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋0.75mg·L-16-BA＋0.23mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导分化和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，10d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，培养44d后分化芽芽数4.333个，芽长1.1cm；取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，45d后增殖分化芽数7.037个，分化芽长1.992cm，增殖系数为14.0。
（3）不定芽的生根培养
取增殖分化芽（长度大于1.5cm），截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基：1/2MS基本培养基＋0.3mg·L-1IBA＋0.032mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），5d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，10d后开始生根，40d后幼苗发根数为2.8个，根长0.801cm，幼苗新芽长0.764cm。
（4）炼苗与移栽
生根培养35d后，将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为96%。其他条件同实施例1。
实施例6
一种灰楸的组织培养方法，在取灰楸母树一年生萌生条进行水培催芽后，包括以下步骤：
（1）无菌化处理
摘取灰楸枝条水培催芽后的萌发芽，去掉所有叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上用10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，经无菌水冲洗4～5次后用无菌滤纸吸干表面水分，将芽截成1.5cm长的茎段（保证茎段上至少有一个腋芽）接种于诱导培养基：DKW基本培养基＋1.1mg·L-16-BA＋0.13mg·L-1IBA+25g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂（pH5.8）上。
（2）芽的诱导分化和增殖
茎段接种于诱导培养基3d后，茎段腋芽处芽开始膨大，8d左右茎段基部愈伤组织开始膨大，培养45d后分化芽芽数1.143个，芽长0.131cm；取分化芽截成1.0cm的茎段，转接于增殖培养基（成分与诱导培养基相同）上，培养10d后开始增殖分化形成不定芽，50d后增殖分化芽数4.37个，分化芽长2.437cm，增殖系数为10.7。
（3）不定芽的生根培养
取增殖分化芽（长度大于1.5cm），截成长度为1.5cm带一叶片茎段，转接入生根培养基：1/2MS基本培养基＋0.28mg·L-1IBA＋0.029mg·L-1NAA+10g·L-1蔗糖+5.0g·L-1琼脂（pH5.8），5d后茎段基部开始膨大发绿，并有淡绿色针眼大小颗粒产生，9d后开始生根，30d后幼苗发根数为0.867个，根长0.679cm，幼苗新芽长0.706cm。
（4）炼苗与移栽是
生根培养40d后，将生根瓶苗置于温室，适应环境7d左右松开封瓶绳，隔天将瓶膜松开，10d左右移栽，移栽时洗净根部培养基，移栽后及时覆膜（每天喷水3次），遮阴，7d后松膜，10d后揭膜，40d后移栽室外，进入田间管理，移栽成活率为95%。其他条件同实施例1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出部分改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种灰楸组织培养方法，包括：采集灰楸母树一年生萌生枝条依次进行枝条水培催芽、无菌化处理、芽的诱导和增殖、不定芽生根培养、炼苗与移栽，得到灰楸组培苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枝条水培催芽包括：采集灰楸母树一年生萌生枝条，在室内水培催芽后，摘取萌发芽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述无菌化处理包括：将水培催芽后的萌发芽用自来水冲洗30min，之后用质量浓度为10%的次氯酸钠溶液浸泡6～7min，之后再经无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述芽的诱导分化和增殖包括：将无菌化处理过的萌发芽截成茎段，然后接种于诱导培养基上，培养35～50天，得到分化芽；然后再将该分化芽截成茎段接种于增殖培养基上，培养30～45天后形成不定芽。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述芽的诱导和增殖培养所用培养基为DKW基本培养基，还包括：0.6～1.4mg·L-16-BA，0.1～0.3mg·L-1IBA，25g·L-1蔗糖和4.5g·L-1琼脂；优选为：DKW基本培养基，还包括：0.75～1.2mg·L-16-BA，0.13～0.23mg·L-1IBA，25g·L-1蔗糖和4.5g·L-1琼脂；所述芽的诱导分化和增殖培养基的pH为5.8。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述不定芽生根培养包括：将增殖分化得到的不定芽截成茎段，转接入生根培养基中诱导生根，28～40天后长成生根苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述不定芽生根培养所用的培养基为1/2MS基本培养基，还包括：0.25～0.35mg·L-1IBA，0.025～0.035mg·L-1NAA，10g·L-1蔗糖和5.0g·L-1琼脂；优选为：1/2MS基本培养基，还包括：0.28～0.32mg·L-1IBA，0.029～0.032mg·L-1NAA，10g·L-1蔗糖和5.0g·L-1琼脂；所述不定芽生根培养基的pH为5.8。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，所述炼苗与移栽包括：将不定芽生根培养出的生根苗置于温室中炼苗后移栽，移栽后遮阴；生根苗移栽的基质为泥炭土：珍珠岩=3～5:1，优选4:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，生根苗移栽的基质还可包含多菌灵，用量为200g/m3。
10.根据权利要求4～9任意一项所述的方法，其特征在于，所述的芽的诱导分化和增殖、不定芽生根培养的温度均为22～26℃，光照强度均为1800～2200勒克斯，光照时间均为12～15小时/每天。
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