CN103181918A - 脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents
脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103181918A CN103181918A CN2013101121386A CN201310112138A CN103181918A CN 103181918 A CN103181918 A CN 103181918A CN 2013101121386 A CN2013101121386 A CN 2013101121386A CN 201310112138 A CN201310112138 A CN 201310112138A CN 103181918 A CN103181918 A CN 103181918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fatty acid
- chemical compound
- compound
- column chromatography
- radix angelicae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,涉及脂肪酸类化合物。提供脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。使用乙醇对白芷进行煮沸回流,过滤,收集滤液,即得白芷提取液;将所得白芷提取液进行萃取,萃取所得溶液进行真空干燥,即得白芷粗提物;将白芷粗提物进行硅胶柱层析,再进行反相硅胶柱层析,分别得化合物1,化合物2,化合物3。所述脂肪酸类化合物可制备成PTP-SHP2的特异性抑制剂,通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶从而发挥抗癌以及预防和治疗与蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-SHP2相关的人类疾病的作用。所述脂肪酸类化合物在制备预防和治疗癌症药物中具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪酸类化合物,特别涉及脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
近年来,伴随着药学和生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞凋亡、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正渐被阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(如蛋白酪氨酸激酶)作为药物筛选靶点,发现选择性作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药,即分子靶向药(moleculartargeted drugs)和抗体靶向药(antibody targeted drugs),已成为当今抗癌药研发的重要方向(1、张石革.肿瘤靶向治疗药物的进展与临床评价.中国医院用药评价与分析.2009;9(1):4-7)。
在癌症的起始和发展过程中,蛋白酪氨酸磷酸化起着非常重要的作用。而蛋白酪氨酸磷酸化水平取决于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)之间的平衡。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是当今公认的肿瘤治疗的重要靶点,在癌症的治疗中起着非常重要的作用。与PTKs的作用相反,PTPs能够促进肿瘤的生长。所以,PTPs抑制剂的发现将对癌症的治疗提供广阔前景(2、Scott LM,Chen LW,Daniel KG,Brooks WH,Guida WC,Lawrence HR,etal.Shp2protein tyrosine phosphatase inhibitor activity of estramustine phosphate and itstriterpenoid analogs.Bioorg Med Chem Lett.2011;21(2):730-733)。
PTP-SHP2,是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶,它由PTPN11基因编码,在人体内多种器官广泛表达。它由N端的2个SH2结构域,中间的PTP结构域及C末端组成。在癌细胞中,SHP2通常会被一些生长因子受体激活,进而调节下游蛋白的磷酸化,促进细胞生长。在原癌基因引起的恶性肿瘤中,PTP-SHP2通常被激活。总之,PTP-SHP2在细胞信号调节中发挥正调控作用,促进细胞生长。随着癌症的靶点治疗越来越得到大家的认可,PTP-SHP2也成为了大家研究的热点。如今,它已经成为人们公认的寻找抗癌药物的重要靶标。一些合成的PTP-SHP2特异性抑制剂也已被发现,如phenylhydrazonopyrazolone sulfonate(3、Hellmuth K,Grosskopf S,Lum CT,Wurtele M,Roder N,von Kries JP,et al.Specific inhibitors of the proteintyrosine phosphatase Shp2identified by high-throughput docking.Proc Natl Acad Sci U S A.2008;105(20):7275-7280)和8-hydroxy-7-(6-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl-quinoline-5-sulfonicacid(NSC-87877)(4、Chen L,Sung SS,Yip ML,Lawrence HR,Ren Y,Guida WC,et al.Discovery ofa novel shp2protein tyrosine phosphatase inhibitor.Mol Pharmacol.2006;70(2):562-570)。中国传统中药(TCM)在已有几千年的药用历史,它具有化学成分多样和结构复杂双重优势,是寻找PTP-SHP2特异性抑制剂的良好资源,这是化学合成药无法匹敌的。
Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,目前已确定至少存在11种caspase,其中,caspase1和caspase11,以及可能还有caspase4被认为不直接参与凋亡信号的转导,它们主要参与白介素前体的活化;而caspase2,caspase8,caspase9和caspase10参与细胞凋亡的起始;参与细胞凋亡执行的则是caspase3,caspase6和caspase7,其中caspase3和7具有相近的底物和抑制剂特异性,它们降解PARP,DFF-45(DNA fragmentationfactor-45),导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。目前认为细胞凋亡的起始者(caspase2,8,9和10)和执行者(caspase3,6,7)之间存在着上下游关系,即起始者活化执行者(5、朱愿,马勇,陈立军.Caspase与细胞凋亡.武警医学院学报.2004;13(4):346-348)。
caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose)polymerase),该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时,116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段,使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离,不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高,裂解核小体间的DNA,引起细胞凋亡。caspase-8具有FADD样DED结构域,并且能够通过DED结构域与FADD结合,所以caspase-8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系,从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。caspase-8在死亡受体介导的细胞凋亡中起着重要作用。而caspase-9在线粒体途径中对细胞凋亡有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。
所述肪酸类化合物包括:
化合物1,化合物1为油状物,化学名为10Z,13Z-十九碳二烯酸,分子式为C19H34O2,分子量为294,结构式为:
化合物2,化合物2为油状物,化学名为8Z,11Z-十七碳二烯酸,分子式为C17H30O2,分子量为266,结构式为:
化合物3,化合物3为油状物,化学名为14Z,17Z-二十一碳二烯酸,分子式为C21H38O2,分子量为322,结构式为:
所述脂肪酸类化合物的制备方法包括以下步骤:
1)使用乙醇对白芷进行煮沸回流,过滤,收集滤液,即得白芷提取液;
2)将所得白芷提取液进行萃取,萃取所得溶液进行真空干燥,即得白芷粗提物;
3)将白芷粗提物进行硅胶柱层析,再进行反相硅胶柱层析,分别得化合物1,化合物2,化合物3。
在步骤1)中,所述乙醇的浓度最好为60%,所述乙醇体积与白芷质量的比例最好为10L∶1kg,其中乙醇以体积计,白芷以质量计;所述煮沸回流的时间可为2~3h。
在步骤2)中,所述萃取的溶剂可为乙酸乙酯等,所述萃取的溶剂与白芷提取液的体积比最好为1∶1。
在步骤3)中,所述硅胶柱层析的具体步骤:将白芷粗提物加入硅胶,干燥得到硅胶层析样品;将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部,以体积比为100∶0,99∶1,98∶2,95∶5,10∶1,5∶1,0∶100的氯仿-甲醇溶液为洗脱剂,进行硅胶柱梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比为99∶1和95∶5的洗脱液,蒸干,即得白芷柱层析样品;所得白芷柱层析样品再经硅胶柱色谱和ODS柱色谱即得化合物1,化合物2和化合物3;所述反相硅胶柱层析的流动相可为甲醇-水或乙腈-水溶液等;所述甲醇-水或乙腈-水的体积比可为(0.25~9)∶1,优选为(0.4~4)∶1,最好为1.85∶1。
本发明所述脂肪酸类化合物可制备成PTP-SHP2的特异性抑制剂,通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶从而发挥抗癌以及预防和治疗与蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-SHP2相关的人类疾病的作用。所述脂肪酸类化合物在制备预防和治疗癌症药物中具有广泛的应用。
所述药物可由本发明所述脂肪酸类化合物和药学上可接受的辅料组成。药物可按照常规方法制成散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、锭剂、膏剂、喷雾剂等中的一种剂型。
本发明的优点如下:
1)本发明中的3个化合物能够特异性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-SHP2的活性,可作为作为蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-SHP2的新型抑制剂。
2)本发明的3个化合物在浓度(17~45.2μmol/L)下即可显著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-SHP2的活性,从而影响它对下游蛋白的调控,说明这3个化合物可以抑制癌细胞增殖,具有成为以PTP-SHP2为靶标的新型抗癌药物的潜力。
3)本发明的3个化合物对PTP-SHP2的活性抑制作用随药物浓度的增大而增强,在有效浓度范围内对PTP-SHP2的活性抑制表现出很好的量效关系。
4)本发明的3个化合物除了能够特异性抑制PTP-SHP2的活性外,还能够激活caspase,引起PARP的切割,促进肝癌细胞HepG2的凋亡。
5)本发明的3个化合物能够激活caspase8和caspase9,进而引起caspase3的活性增强,有效作用浓度为100μM,有效作用时间为10h。。
6)本发明的3个化合物能够引起PARP的切割,并呈现浓度和时间梯度。有效作用浓度为50μM,有效作用时间为12h。。
7)本发明3个化合物的对癌细胞生长抑制效果显著,促使肝癌细胞的死亡,作用明显。
附图说明
图1为化合物1对PTP-SHP2的特异性抑制作用图。在图1中,横坐标为化合物1浓度,纵坐标为蛋白酪氨酸磷酸酶的活性,其中◆代表PTP-SHP2,▲代表VHR,■代表HePTP,以未用化合物处理的蛋白活性为100%。
图2为化合物2对PTP-SHP2的特异性抑制作用图。在图2中,横坐标为化合物2浓度,纵坐标为蛋白酪氨酸磷酸酶的活性,其中◆代表PTP-SHP2,▲代表VHR,■代表HePTP,以未用化合物处理的蛋白活性为100%。
图3为化合物3对PTP-SHP2的特异性抑制作用图。在图3中,横坐标为化合物3浓度,纵坐标为蛋白酪氨酸磷酸酶的活性,其中◆代表PTP-SHP2,▲代表VHR,■代表HePTP,以未用化合物处理的蛋白活性为100%。
图4为不同浓度下化合物3对PARP的切割作用图。在图4中,12.5、25、50和100分别为化合物3的浓度(μM),空白作为对照,化合物3引起了HepG2中PARP的切割,有效浓度为50~100μM,量效关系良好。
图5为不同时间下化合物3对PARP的切割作用图。在图5中,3h,6h和12h分别为化合物3作用于HepG2的时间,空白作为对照,化合物3引起HepG2中PARP切割的有效作用时间为12h。
图6为不同浓度下化合物3对caspase-3,caspase-8,caspase-9的活性影响图。在图6中,横坐标为药物浓度(μM),纵坐标为活性增强倍数。其中a为caspase-3,b为caspase-8,c为caspase-9;用化合物3处理HepG2细胞,浓度0、50和100μM,处理时间均为10h;*P<0.05,表明与空白对照组相比,100μM浓度组caspase-3和caspase-9的活性明显增强,差异显著。
具体实施方式
实施例1脂肪酸类化合物的制备
1、制备白芷醇提物
1)称取3kg干燥白芷根,加入30L60%乙醇,搅拌,于提取罐中煮沸回流2h后过滤,收集滤液;
2)滤渣再用60%乙醇煮沸回流提取2次,过滤,收集滤液,60%乙醇用量为30L/次;
3)合并3次的滤液,用乙酸乙酯进行萃取,每次萃取剂用量为30L,收集上层萃取液;
4)下层部分再用乙酸乙酯进行萃取2次,合并3次上层萃取液,真空干燥得到48.3g白芷醇提物(编号记为:AD)。
2、硅胶柱层析、ODS柱层析,制备单体化合物
1)用氯仿浸泡200~300目硅胶,搅拌混匀,装柱,备用;
2)向48.3g白芷醇提物中加入氯仿-甲醇混合溶液,超声使其溶解;用60~100目硅胶拌样,研磨均匀,干燥,即得硅胶柱层析样品;
3)将上述硅胶柱层析样品均匀装在硅胶柱顶部,用氯仿-甲醇***(100∶0,99∶1,98∶2,95∶5,10∶1,5∶1,0∶100)进行梯度洗脱,每个梯度洗脱3600ml。其中,吸附剂硅胶与白芷醇提物AD的重量之比为15∶1,硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶10;根据TLC分析合并得到11个馏分(AD-A1,AD-A2,AD-B,AD-C1,AD-C2,AD-C3,AD-D,AD-E1,AD-E2,AD-F,AD-G);
4)对馏分AD-A2进行硅胶柱层析,流动相为环己烷-乙酸乙酯***(98∶2,19∶1,10∶1,5∶1,1∶1),每个梯度洗脱1500ml。其中,吸附剂硅胶与馏分AD-A2的重量之比为20∶1,硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶15;根据TLC分析合并得到12个馏分(AD-A2-A,AD-A2-B,AD-A2-C,AD-A2-D,AD-A2-E,AD-A2-F,AD-A2-G,AD-A2-H,AD-A2-I,AD-A2-J,AD-A2-K,AD-A2-L)。
对馏分AD-A2-E进行ODS柱层析,流动相为甲醇-水***(1∶1,13∶7,4∶1,19∶1,100∶0),每个梯度洗脱200ml。其中,吸附剂ODS与馏分AD-A2-E的重量之比为25∶1,硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶16。根据ODS点板分析,合并得到单体化合物1(120mg)。
经质谱鉴定,化合物1为10Z,13Z-十九碳二烯酸,分子式为C19H34O2,分子量为294,油状物。ESI-MS,m/z:295[M+H]+,317[M+Na]+,333[M+K]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.44(4H,m,H-10,11,13,14),2.81(2H,t,J=6.4Hz,H-12),2.39(2H,t,J=7.6Hz,H-2),2.10(4H,t,J=6.8Hz,H-9,15),1.69(2H,t,J=6.8Hz,H-3),1.28~1.34(16H,m,H-4~8,16,17,18),0.92(3H,t,J=6.8Hz,H-19).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:180.1(C-1),130.1(C-10),130.0(C-14),128.1(C-11),127.9(C-13),34.1(C-2),31.8(C-17),29.6(C-12),29.3(C-20),29.0~29.6(C-4~8,16),27.2(C-9,15),25.6(C-12),24.6(C-3),22.6(C-18),14.0(C-19).以上数据与文献中报道的已知化合物数据一致,确定为同一化合物。
对馏分AD-A2-F进行ODS柱层析,流动相为甲醇-水***(1∶1,3∶2,7∶3,17∶1,100∶0),每个梯度洗脱200ml。其中,吸附剂ODS与馏分AD-A2-F的重量之比为23∶1,硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶16。根据ODS点板分析,合并得到单体化合物2(258mg)。
经质谱鉴定,化合物2为8Z,11Z-十七碳二烯酸,分子式为C17H30O2,分子量为266,油状物。ESI-MS,m/z:265[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.42(4H,m,H-8,9,11,12),2.80(2H,t,J=6.4Hz,H-10),2.37(2H,t,J=7.6Hz,H-2),2.09(4H,t,J=6.8Hz,H-7,13),1.64(2H,t,J=6.8Hz,H-3),1.27~1.32(12H,m,H-4~6,14,15,16),0.92(3H,t,J=6.8Hz,H-23).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:179.5(C-1),130.2(C-9),130.0(C-12),128.0(C-8),127.9(C-11),34.0(C-2),31.5(C-15),28.9~29.6(C-4~6,14),27.2(C-7,13),25.6(C-10),24.7(C-3),22.6(C-16),14.0(C-17).以上数据与文献中报道的已知化合物数据一致,确定为同一化合物。
对馏分AD-A2-G进行ODS柱层析,流动相为甲醇-水***(2∶3,3∶2,4∶1,100∶0),每个梯度洗脱200ml。其中,吸附剂ODS与馏分AD-A2-F的重量之比为15∶1,硅胶柱的柱直径与柱高之比为1∶16。根据ODS点板分析,合并得到单体化合物3(266mg)。
经质谱鉴定化合物3为14Z,17Z-二十一碳二烯酸,分子式为C21H38O2,分子量为322,油状物。ESI-MS,m/z:351[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.43(4H,m,H-14,15,17,18),2.80(2H,t,J=6.4Hz,H-16),2.38(2H,t,J=7.6Hz,H-2),2.09(4H,t,J=6.8Hz,H-13,19),1.66(2H,t,J=6.8Hz,H-3),1.27~1.33(24H,m,H-4~12,20,21,22),0.92(3H,t,J=6.8Hz,H-23).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:179.9(C-1),130.2(C-14),130.0(C-18),128.0(C-15),127.9(C-17),34.1(C-2),31.5(C-21),29.0~29.6(C-4~12,20),27.2(C-13,19),25.6(C-16),24.7(C-3),22.6(C-22),14.0(C-23).以上数据与文献中报道的已知化合物数据一致,确定为同一化合物。
实施例2脂肪酸类化合物药效学实验
1.实验材料与试剂
(1)实验细胞:人肝癌细胞HepG2
(2)菌株
pGEX4T1-PTP-SHP2 E.coli BL21
pGEX4T1-VHR E.coli BL21
pGEX4T1-HEPTP E.coli BL21
(3)药材浙江产杭白芷
(4)主要试剂
(5)培养基
LB液体培养基:
1%(g/ml)Tryptone,0.5%(g/ml)Yeast Extract,1%(g/ml)NaCl
(6)GST纯化蛋白所需缓冲液及试剂
PBS Bμffer:137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4
100mg/ml氨苄青霉素
蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂贮存液:
IPTG贮存液(0.8M)
Buffer W:25mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇,1mM EDTA
Buffer W1:25mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl,Trion X-1001%,10mMβ-巯基乙醇
Buffer W2:50mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇
Buffer E:50mM Tris-HCl pH8.0,10mM谷胱甘肽
(7)药物筛选反应液:
50mM Bis-Tris,2mM EDTA,50mM NaCl,2mM DTT pH6.5,1M NaOH,1M DTT
(8)Western blot及其他实验所用用溶液配制:
PBS缓冲液:137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4用盐酸调pH至7.4。
Giemsa染液:
吉姆萨粉(Giemsa stain) l.0g
甘油(AR) 66ml
甲醇(AR) 66ml
将Giemsa粉放入研钵中,先加入少量甘油,研磨至无颗粒为止,然后再将全部甘油倒入,放56℃温箱中2h后,加入甲醇,将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。
RIPA细胞裂解液:50mM Tris-HCl(pH7.4);150mM NaCl;1mM EDTA;1%Triton;1%脱氧胆酸钠;0.1%SDS;1mM PMSF;5μg/ml Aprotenin;5μg/ml Leupeptasin。
2.实验方法及结果
(1)脂肪酸类化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶shp2的特异性抑制作用
体外蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的高通量模型筛选为:SHP2水解对硝基苯磷酸(pNPP),生成可溶性的黄色化合物,其在405nm处有光吸收,所以,通过检测水解底物的光吸收即可测定蛋白酪氨酸磷酸酶的活性。基于此机理,申请人建立了体外蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂高通量筛选模型,用于寻找天然产物中shp2的新型特异性抑制剂。为了观察化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶的选择性,申请人对VHR和HePTP也进行了活性测定。具体的操作步骤如下:
a.GST4B的活化
1)从四度冰箱内取出GST4B轻轻摇晃均匀,取1.33ml混合液放入2ml离心管内离心,1500rpm,5min;小心去掉上清。
2)用10mlPBS洗涤GST4B珠子,离心,1500rpm,5min;去上清。
3)重复步骤2)。
4)每1.33ml原GST4B加1mlPBS摇匀4℃备用。
b.蛋白分离与纯化实验方法及蛋白浓度的测定
1)从培养皿中挑取单克隆菌落转移至50ml LB(50mg/ml AMP)的三角瓶中37℃,250rpm摇床中过夜培养。
2)从上述溶液中取出10ml菌液转移到另一新的含200ml LB(50mg/ml AMP)的三角瓶中于37℃,250rpm摇床中至菌液OD600值大约达到0.8。
3)待菌液冷却至室温加入IPTG诱导剂,使之终浓度达到0.1mM,于25℃,225rpm摇床中培养16h。
4)收集菌液,离心,6000g,4℃,10min;去掉上清。
5)加入10ml Buffer W重悬菌液沉淀,反复冻融3次,每次15-30min。
6)测量并调菌液pH至8.0后加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,室温静置20min。
7)冰上超生破碎60次,每次8s。加入EDTA至终浓度20mM,Triton X-100至含量0.5%,冰浴20min。
8)离心,20000g,4℃,30min。取上清至一新50ml离心管中,加入已经活化好的glutathione-Sepharose4B,4℃冰箱内垂直混合1h。
9)离心上述混合液,收集beads,分别用8ml BufferW14℃垂直混合洗涤4次,每次10min;离心,1000rpm1min;收集beads;8ml BufferW24℃垂直混合洗涤1次,每次10min。离心,1,000rpm1min;收集beads。
10)向离心管中加入1ml Buffer E4℃垂直混合洗涤3次,每次30min;离心,1000rpm1min;收集上清至新的离心管内储存。
11)考马斯亮蓝法测定提取的蛋白浓度后分装储存在-70℃冰箱内,备用。
c.纯度鉴定
纯化得到的目的蛋白通过SDS-PAGE鉴定其大小和纯度。
d.抑制剂筛选实验方法
1)高通量筛选模型:
25μl蛋白样品,(含DTT final=1mM)
45μl反应液(50mM Bis-Tris,50mM NaCl,2mM EDTA PH6.9)
10μl100mM化合物(化合物final=10mM,DMSO final=1%)
20μl7.5mM p-NPP(final concentration=1.5mM)
具体步骤为:待测化合物和蛋白混合后,室温下反应30分钟,再加入p-NPP,混匀,室温下反应60分钟,最后加入100μl1M的NaOH终止反应,酶标仪,405nm处读数。
2)特异性效果的测定
筛出的有抑制作用的化合物对四种PTPs蛋白的特异性抑制效果进行测定:以p-NPP为底物,反应体系为50mM Bis-Tris,2mM EDTA,50mM NaCl,2mM DTT pH6.5缓冲液,四种蛋白的用量相同,以mol为单位,药物浓度按梯度进行稀释,405nm读数。最后做出药物对3种蛋白的抑制曲线(参见图1~3)。3个化合物对PTP-SHP2都具有抑制作用,其IC50为17.2~45.2μM。
3)半数抑制浓度(IC50)的测定
IC50,即半数抑制浓度,是使酶活性降至原活性一半时的抑制剂浓度。可以用来做抑制剂抑制能力大小的评判标准。以不同浓度的抑制剂与相同条件下的酶-底物反应体系相互作用,在单位时间内将产物的增加量与未加抑制剂的反应体系对比,可以得到抑制剂对酶的抑制能力的曲线,选择合适的抑制剂浓度,就可以得到IC50的数值。
表1脂肪酸类化合物对PTP-SHP2的选择性抑制作用
实验结果表明(参见表1)3个化合物对PTP-SHP2都具有抑制作用,其IC50为17.2~45.2μM。但相同浓度下,对PTP-SHP2的抑制作用明显大于对VHR和HePTP的抑制。这说明,这3个化合物对PTP-SHP2的抑制具有特异性。
(2)化合物3通过PARP切割诱导肝癌细胞凋亡
采用蛋白质印迹(Western Blotting)方法进行蛋白水平分析,蛋白质印迹(western blot),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹(western blot)常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。具体的操作步骤如下:
a.细胞培养
1)将HepG2人肝癌细胞孵育于含10%胎牛血清,100Μ/ml青霉素,100Μ/ml链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。
2)吸去培养液,PBS洗1次,加适量胰酶消化液,在培养箱中静置2-3min;显微镜下观察细胞变圆时,用含血清的DMEM培养基终止胰酶的消化作用,用移液器吹打细胞培养皿,并将细胞悬液吸入15ml离心管中,离心800rpm,2min;吸去上清液后,加入含10%胎牛血清DMEM培养液,用移液枪吹成单细胞悬液,将HepG2单细胞悬液分传至6孔板,放于37℃培养箱中培养。
b.细胞处理
细胞长到大约占孔板底面积的80%时,吸去培养液,加入2ml新鲜的含有无血清的DMEM培养基,分别加入化合物3或DMSO(空白对照组),混匀,使其终浓度为0,12.5,25,50,100μM/L,于培养箱中培养12h;或者终浓度为100μM/L,于培养箱中分别培养3h,6h,12h。
c.细胞收集:
吸去含药物的细胞培养液,用4℃预冷的PBS洗2次,每孔加入1ml PBS,用细胞刮将细胞刮下,并收集到1.5ml离心管中。离心4℃,12000rpm,25s。
d.细胞裂解:
去掉上清液,向每个离心管中加入40μL RIPA细胞裂解液,冰上裂解30min,其间,在振荡器上每隔5min振荡10s,然后离心4℃,12000rpm,10min。收集上清液,即得蛋白样品。
e.根据实验室常规蛋白浓度测定方法测定蛋白样品的浓度:
f.SDS-PAGE电泳:
1)清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2)灌胶与上样:
A.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
B.配8%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层无水乙醇,液封后的胶凝的更快。
C.15~20min后,当乙醇和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层乙醇并用滤纸将乙醇吸干。
D.按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子***浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
E.用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。
F.测完蛋白含量后,计算含40μg蛋白的溶液体积即为上样量。
将配好的上样样品于110℃煮沸10min。放-20℃保存。
G.加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
3)电泳:
开始在浓缩胶时用80V,待蛋白Marker有分离后将电压加大至120V,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
4)转膜:
A.滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。转膜之前,将PVDF膜浸于甲醇中10s,用镊子拿出,放在电转液中洗几次。将2份5~6层滤纸、1份单层滤纸浸泡于电转液中,待用。
B.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫5层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
C.小心撬去制胶外层玻璃板,将单层滤纸平铺于胶面上,轻轻去掉另外一块玻璃板,将胶平放在多层滤纸上,用刚才浸湿的PVDF膜从胶面的一边开始缓缓盖上,注意不要有气泡。然后用一支浸湿的滴管从膜的一边开始赶气泡。再将浸好的多层滤纸平放在膜上面,最后将一层黑色海绵盖上,擀几下就可合起夹子。
D.将夹子放入转移槽槽中,要使夹子的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。倒入约1L转膜液,然后将这个转膜槽放在一个装满冰的盆中,100v,90min。
5)免疫反应:
A.封闭:将电转移后的PVDF膜于含5%的脱脂牛奶的TBST缓冲液中室温封闭1h;
B.一抗反应:将封闭后的PVDF膜封于杂交袋中,加入兔抗anti-PARP(Sigma公司,浓度1:1000),于4℃摇床上过夜;
C.二抗反应:将PVDF膜于TBST缓冲液中摇洗3次,每次5min。加入IgG(H+L)(山羊抗兔二抗,浓度1:10000,Sigma公司),室温孵育1h。
6)化学发光,显影,定影
去除二抗,用TBST缓冲液洗膜,室温摇洗三次,每次5min,蛋白面朝上,置于保鲜膜中,将ECL化学发光检测试剂盒的A液和B液以1:1(V/V)混合,于暗室中,按0.05-0.1mL/cm2的量滴加于膜表面,孵育1min,用滤纸吸去多余液体,封好膜后,立即于暗室中曝光,显影。
实验结果表明:化合物3处理HepG2人肝癌细胞12h后,引起了PARP的切割;而且在100μmol/L浓度下,PARP切割程度明显大于50μmol/L时。所以,化合物3能够诱导HepG2中PARP的切割,并呈现很好的量效关系(参见图4)。终浓度为100μmol/L的化合物3处理HepG2人肝癌细胞后,6h时,PARP切割并不明显;而在12h时,表现出明显的PARP切割作用。这说明,化合物3对肝癌细胞HepG2中PARP的作用具有时间依赖性(参见图5)。因此,化合物3能够通过PARP切割途径诱导细胞凋亡,并具有很好的浓度和时间依赖性,具备良好的抗癌药物开发潜力。
(3)化合物3对caspase-3,caspase-8,caspase-9的激活作用
Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在,经活化方能执行其功能。caspase8,caspase9参与细胞凋亡的起始;caspase3参与细胞凋亡执行。这3种蛋白在细胞凋亡过程中具有非常重要的作用,因此也是细胞凋亡检测的重要指标。
Caspase3/CPP32可剪切procaspase-2,procaspase-6,procaspase-7与procaspase-9,PARP,gelsolin等。底物DEVD-pNA是caspase-3序列特异性多肽(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp)与pNA(即p-nitroaniline)的偶联,当底物被激活的caspase-3剪切后,黄色基团pNA游离出来。pNA在405nm处有最大吸收值,通过检测pNA,间接考察caspase-3的活性。Caspase-8和Caspase-9的底物分别是IETD-pNA或LEHD-pNA,其活性的测定原理同Caspase-3。具体操作步骤如下:
1)细胞培养
A.将HepG2人肝癌细胞孵育于含10%胎牛血清,100Μ/ml青霉素,100Μ/ml链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。
B.时吸去培养液,PBS洗1次,加适量胰酶消化液,在培养箱中静置2-3min;显微镜下观察细胞变圆时,用含血清的DMEM培养基终止胰酶的消化作用,用移液器吹打细胞培养皿,并将细胞悬液吸入15mL离心管中,离心800rpm,2min;吸去上清液后,加入含10%胎牛血清DMEM培养液,用移液枪吹成单细胞悬液,将上述HepG2单细胞悬液分传至直径为10cm的细胞培养皿,放于培养箱中培养。
2)细胞处理
待细胞长到大约占孔板底面积的80%时,吸去培养液,加入10ml新鲜的无血清的DMEM培养基,分别加入化合物3或DMSO(空白对照组),混匀,使其终浓度为0,50,100μM/L,于培养箱中培养10h。
3)细胞计数:
吸去含药物的细胞培养液,用PBS洗2次,用胰酶消化(消化方法同步骤1)。用细胞计数板计数,取1-5×106个细胞于1.5ml Ep管中,离心(4℃,12000rpm,25s),细胞沉淀用于下面的实验。
4)细胞裂解:
向每个Ep管中加入50μL Cell Lysis Buffer(Caspase-3,-8,-9Colorimetric Assay Kits内),涡旋以混匀,冰上裂解10min。离心4℃,10000g,1min。收集上清液于一个新Ep管中,放在冰上(或放-80℃备用)。
5)按实验室常规蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度:
6)取50~200μg蛋白于96孔板中,用Cell Lysis Buffer稀释到50μl。
7)加入50μl2×Reaction Buffer(含10mM DTT),混匀。
8)加入5μl4mM DEVD-pNA(caspase-3的底物)或IETD-pNA(caspase-8的底物)或LEHD-pNA(caspase-9的底物),使其终浓度为200μM,混匀,放37℃孵育1~2h。
9)用酶标仪,400或405nm处,读取OD值。
化合物3处理HepG2人肝癌细胞10h后,100μmol/L浓度时,caspase-8和caspase-9的活性都增强了,且caspase-9增强程度明显大于caspase-8;caspase-8和caspase-9的增强引起了caspase-3的激活(参见图6)。在50μmol/L时,caspase的活性无明显增强。这说明,化合物3诱导的细胞凋亡依赖caspase的激活,且主要是通过caspase-9所在的线粒体途径来发挥作用的。本实验明确了此类化合物通过细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的作用通路。
(4)化合物3抑制肝癌细胞的克隆形成
通过Giemsa染色测定化合物3对HepG2细胞的生长抑制作用。Giemsa染液由天青和伊红组成。Giemsa的染色原理:既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。细胞核内染色体呈酸性,易被染液染成蓝色,细胞质则染色较浅。用Giemsa染色法可以观察细胞团簇的大小及多少,从而反映出化合物对癌细胞的生长抑制作用。具体操作步骤如下:
1)细胞培养
A.将HepG2人肝癌细胞孵育于含10%胎牛血清,100Μ/ml青霉素,100Μ/ml链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。
B.吸去培养液,PBS洗1次,加适量胰酶消化液,在培养箱中静置2-3min;显微镜下观察细胞变圆时,用含血清的DMEM培养基终止胰酶的消化作用,用移液器吹打细胞培养皿,并将细胞悬液吸入15mL离心管中,离心800rpm,2min;吸去上清液后,加入含10%胎牛血清DMEM培养液,用移液枪吹成单细胞悬液。将HepG2单细胞悬液分传至6孔板,约1×103/孔。放于培养箱中培养。
2)细胞处理
4~5天后,当细胞团簇形成时,吸去培养液,加入2ml新鲜的含有无血清的DMEM培养基,分别加入化合物3或DMSO(空白对照组),混匀,使其终浓度为0,25,50μM/L,于培养箱中培养20h。
3)细胞固定
吸去培养液,用PBS洗1次,然后用4%多聚甲醛(PFA)固定15min。
4)Giemsa染色
弃去4%多聚甲醛,用PBS洗3次。加入Giemsa染色10min。
5)图像采集
弃去Giemsa染色10min,用PBS洗1次。Canon相机采集图像。
化合物3能够抑制HepG2细胞的生长。在25μM浓度下,化合物3对HepG2细胞有一定的生长抑制作用;在50μM下,这种抑制作用非常明显。这说明,在有效的浓度范围内,化合物3对HepG2细胞的生长抑制呈现量效关系。该结果提示,以化合物3为代表的此类化合物可以明显地抑制癌细胞生长而达到抗癌作用。
实施例314Z,17Z-二十一碳二烯酸片剂的制备
取14Z,17Z-二十一碳二烯酸1g、微晶纤维素27g与硬脂酸镁2g混合,混合物用单冲压片机压成直径为6mm,重量为300mg的片,本片剂中每片含14Z,17Z-二十一碳二烯酸10mg。
实施例4制备颗粒剂
取14Z,17Z-二十一碳二烯酸1g与玉米淀粉29g混合,加水制成软材,过12目筛进行造粒,干燥后得到颗粒剂。本实施例制备的颗粒剂中每300mg中含14Z,17Z-二十一碳二烯酸10mg。
实施例5制备胶囊剂
取14Z,17Z-二十一碳二烯酸1g与乳糖27g、硬脂酸镁2g混合,以每300mg填充肠溶胶囊。本实施例制备的胶囊剂中,每个胶囊含14Z,17Z-二十一碳二烯酸10mg。
Claims (10)
2.如权利要求1所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于所述脂肪酸类化合物的制备方法,包括以下步骤:
1)使用乙醇对白芷进行煮沸回流,过滤,收集滤液,即得白芷提取液;
2)将所得白芷提取液进行萃取,萃取所得溶液进行真空干燥,即得白芷粗提物;
3)将白芷粗提物进行硅胶柱层析,再进行反相硅胶柱层析,分别得化合物1,化合物2,化合物3。
3.如权利要求2所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于在步骤1)中,所述乙醇的浓度为60%,所述乙醇体积与白芷质量的比例为10L∶1kg,其中乙醇以体积计,白芷以质量计。
4.如权利要求2所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于在步骤1)中,所述煮沸回流的时间为2~3h。
5.如权利要求2所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于在步骤2)中,所述萃取的溶剂为乙酸乙酯。
6.如权利要求5所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于所述萃取的溶剂与白芷提取液的体积之比为1∶1。
7.如权利要求2所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于在步骤3)中,所述硅胶柱层析的具体步骤:将白芷粗提物,加入硅胶,干燥得到硅胶层析样品;将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部,以体积之比为100∶0,99∶1,98∶2,95∶5,10∶1,5∶1,0∶100的氯仿-甲醇溶液为洗脱剂,进行硅胶柱梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比为99∶1和95∶5的洗脱液,蒸干,即得白芷柱层析样品;所得白芷柱层析样品再经硅胶柱色谱和ODS柱色谱即得化合物1,化合物2和化合物3。
8.如权利要求2所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于在步骤2)中,所述反相硅胶柱层析的流动相为甲醇-水或乙腈-水溶液。
9.如权利要求8所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于所述甲醇-水或乙腈-水的体积比为(0.25~9)∶1。
10.如权利要求9所述的脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用,其特征在于所述甲醇-水或乙腈-水的体积比为(0.4~4)∶1,最好为1.85∶1。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310112138.6A CN103181918B (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310112138.6A CN103181918B (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110113979 Division CN102276444B (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 脂肪酸类化合物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103181918A true CN103181918A (zh) | 2013-07-03 |
CN103181918B CN103181918B (zh) | 2014-10-29 |
Family
ID=48673535
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310112138.6A Expired - Fee Related CN103181918B (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103181918B (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111344017A (zh) * | 2017-09-07 | 2020-06-26 | 锐新医药公司 | 治疗癌症的shp2抑制剂组合物和方法 |
US11661401B2 (en) | 2016-07-12 | 2023-05-30 | Revolution Medicines, Inc. | 2,5-disubstituted 3-methyl pyrazines and 2,5,6-trisubstituted 3-methyl pyrazines as allosteric SHP2 inhibitors |
US11673896B2 (en) | 2017-01-23 | 2023-06-13 | Revolution Medicines, Inc. | Pyridine compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
US11673901B2 (en) | 2017-12-15 | 2023-06-13 | Revolution Medicines, Inc. | Polycyclic compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
US11702411B2 (en) | 2017-10-12 | 2023-07-18 | Revolution Medicines, Inc. | Pyridine, pyrazine, and triazine compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
US11739093B2 (en) | 2017-01-23 | 2023-08-29 | Revolution Medicines, Inc. | Substituted pyrazolopyrazines, imidazopyrazines and [1,2,4]triazolopyrazines as allosteric SHP2 inhibitors |
-
2011
- 2011-05-04 CN CN201310112138.6A patent/CN103181918B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KAREL STRANSKY, TOMAS JURSIK, ANTONIN VITEK: "Standard Equivalent Chain Length Values of Monoenic and Polyenic (Methylene Interrupted) Fatty Acids", 《JOURNAL OF HIGH RESOLUTION CHROMATOGRAPHY》 * |
TADAHIKO KAJIWARA, HIROSHI YOSHIKAWA, KENJI MATSUI, ET AL.: "Specificity of the enzyme system producing long chain aldehydes in the green alga, Ulva pertusa", 《PHYTOCHEMISTRY》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11661401B2 (en) | 2016-07-12 | 2023-05-30 | Revolution Medicines, Inc. | 2,5-disubstituted 3-methyl pyrazines and 2,5,6-trisubstituted 3-methyl pyrazines as allosteric SHP2 inhibitors |
US11673896B2 (en) | 2017-01-23 | 2023-06-13 | Revolution Medicines, Inc. | Pyridine compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
US11739093B2 (en) | 2017-01-23 | 2023-08-29 | Revolution Medicines, Inc. | Substituted pyrazolopyrazines, imidazopyrazines and [1,2,4]triazolopyrazines as allosteric SHP2 inhibitors |
CN111344017A (zh) * | 2017-09-07 | 2020-06-26 | 锐新医药公司 | 治疗癌症的shp2抑制剂组合物和方法 |
US11596633B2 (en) | 2017-09-07 | 2023-03-07 | Revolution Medicines, Inc. | SHP2 inhibitor compositions and methods for treating cancer |
US11702411B2 (en) | 2017-10-12 | 2023-07-18 | Revolution Medicines, Inc. | Pyridine, pyrazine, and triazine compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
US11673901B2 (en) | 2017-12-15 | 2023-06-13 | Revolution Medicines, Inc. | Polycyclic compounds as allosteric SHP2 inhibitors |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103181918B (zh) | 2014-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103181918B (zh) | 脂肪酸类化合物在制备预防和治疗肝癌药物中的应用 | |
CN102675403B (zh) | 抗乙肝药物lqc-x的合成及其应用 | |
CN104080777B (zh) | 用作mogat-2抑制剂的吗啉基衍生物 | |
Beadle et al. | Synthesis and antiviral evaluation of octadecyloxyethyl benzyl 9-[(2-Phosphonomethoxy) ethyl] guanine (ODE-Bn-PMEG), a potent inhibitor of transient HPV DNA amplification | |
CN106236745B (zh) | 芳香族法尼基类化合物的用途 | |
CN110526881A (zh) | 一种萘胺类化合物及其生物学可接受的盐,其制备方法和应用 | |
CN110330503B (zh) | 一种化合物、其制备方法及应用以及抗类风湿性关节炎的药物 | |
CN102276444B (zh) | 脂肪酸类化合物及其制备方法与应用 | |
CN114907337B (zh) | 靶向cdk4或cdk6的共价抑制剂及其应用 | |
CN109734676A (zh) | 苯并二氮杂卓类衍生物及其制备方法和应用 | |
CN114907386A (zh) | 一种hemtac小分子降解剂及其应用 | |
JP7353500B2 (ja) | アクリル酸トリプトリド、その調製方法および用途 | |
CN112358527A (zh) | 丙烯酸雷公藤甲素酯、其制备方法及其应用 | |
CN108690033A (zh) | 含黄酮类药物活性分子的荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN101972291A (zh) | 沙生蜡菊花提取物及其制备方法和用途 | |
CN101870720A (zh) | 熊果酸的制备方法及其在***疾病药物中的用途 | |
CN107840814B (zh) | 单环二萜化合物cassipourol及其制备方法和在制药中的用途 | |
CN105949262B (zh) | 一种3‑氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用 | |
CN112190579A (zh) | 滨蒿内酯在***药物中应用及***药物 | |
CN110256394B (zh) | 具有抗癌活性的化合物及其制备方法 | |
CN105560261B (zh) | 知母皂苷n在制备防治糖尿病药物中的应用 | |
Reddy et al. | Synthesis of novel 1, 2, 3-triazole hybrids of methyl β-orsellinate with capabilities to arrest cell cycle and induce apoptosis in breast cancer cells (MCF-7) | |
Qian et al. | Inhibitory effect of tetrandrine on angiogenesis | |
CN116199704B (zh) | 一类大田软海绵酸衍生物及其制备方法和制备hiv潜伏激活药物的应用 | |
CN102600175A (zh) | 熊果酸在***疾病药物中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141029 |