CN103175928A - 一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱（lc-cd）鉴定方法 - Google Patents
一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱（lc-cd）鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及软紫草和硬紫草的鉴定技术，利用软紫草和硬紫草分别含有的卡宁对映异构体，在液相-圆二色谱(LC-CD)中的相反关系，建立了液相-圆二色谱(LC-CD)准确地鉴定软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法，从而，提供了一种准确地鉴定和区分软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法。
Description
技术领域
本发明涉及软紫草和硬紫草的鉴定技术，特别的涉及液相-圆二色谱(LC-CD)准确地鉴定软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法。
背景技术
紫草在我国有悠久的药用历史，其味甘咸，性寒，归心包络肝经，有凉血、活血、清热、解毒等功效，中医临床主要用于湿性斑疹、紫癜、血尿、淋浊和血痢、热结便秘、烧伤、湿疹、丹毒、痈疡等病。
紫草(Radix Arnrbiae，Radix Lithospermi)为紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.或内蒙紫草Arnebiaguttata Bunge的干燥根[1]。其中新疆紫草又名软紫草，紫草或内蒙紫草又称硬紫草，软紫草和硬紫草是药用紫草的主要来源。
文献报道表明[2，3]，紫草中含有多种化学成分，包括紫草萘醌类、酚酸类、生物碱类、苯酚及苯醌类、三萜酸及甾醇类、黄酮类以及多糖类等物质。其中研究最多的是紫草萘醌类化合物，国内外学者从不同种属紫草植物的根中分离得到多种萘醌化合物，如：β-羟基异戊酰紫草素、紫草素、2，3-二甲基戊烯酰紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰紫草素、α-甲基-正丁酰紫草素、异戊酰紫草素、去氢阿卡宁(去氢异紫草素)、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、β-羟基异戊酰阿卡宁等。天然存在的紫草萘醌有两种光学异构体，一种为R型(命名为紫草素类)，一种为S型(命名为阿卡宁类)，它们互为对映体[4，5]。
紫草素类 阿卡宁类
软紫草和硬紫草从外观形态和所含有的萘醌类成分的比例等方面均很难鉴别，一般很难准确地区分软紫草和硬紫草。软紫草和硬紫草功效和作用不同，如果不加以准确区分，市场流通和临床应用过程中将产生混乱，可严重影响药物的疗效和安全性，因此，找到一种准确区分和鉴定软紫草和硬紫草药材，尤其是软紫草和硬紫草提取物(包括含有紫草的复方中药、 萘醌类成分单体)，将具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明分别从软紫草和硬紫草中分离纯化了7对萘醌对映异构体：阿卡宁(1)、乙酰阿卡宁(2)、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(3)、去氧阿卡宁(4)、异丁酰阿卡宁(5)、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(6)、异戊酰阿卡宁(7)、α-甲基-正丁酰阿卡宁(8)、紫草素(10)、β-羟基异戊酰紫草素(11)、乙酰紫草素(12)、去氧紫草素(4)、异丁酰紫草素(14)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素(15)、异戊酰紫草素(16)、α-甲基-正丁酰紫草素(17)。分别测定了它们的圆二色谱(CD)，发现它们均具有如下的特征：软紫草中的阿卡宁类萘醌类似物的CD图谱(部分光谱见图1-7)在210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm分别给出负的Cotton效应，在200-210nm，240-250nm，300-325nm，400-450nm分别给出正的Cotton效应；硬紫草中的紫草素类萘醌类似物的CD图谱在210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm分别给出正的Cotton效应，在200-210nm，240-250nm，300-325nm，400-450nm分别给出负的Cotton效应，两者成分的CD吸收曲线恰好相反。
我们发现，如果利用HPLC等液相色谱技术，分离分析出紫草中的萘醌类衍生物，再利用圆二色谱(CD)检测它们的圆二色性，就可以很好地区分和鉴定软紫草和硬紫草药材，尤其是软紫草和硬紫草提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)。
为此，我们研究发现了良好分离分析紫草中的萘醌类衍生物的液相-圆二色谱(LC-CD)条件，发现了检测软紫草和硬紫草的圆二色谱(CD)几个最佳的波长范围(210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm，200-210nm，240-250nm，300-325nm，400-450nm)和最佳波长(220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm)。从而，提供了一种准确地鉴定和区分软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法。
本发明涉及利用液相-圆二色谱(LC-CD)技术区分软紫草和硬紫草的鉴定方法，以期准确地鉴定软紫草和硬紫草。以避免由于软紫草和硬紫草从外观形态和所含有的萘醌类成分的比例等方面均很难鉴别所导致的市场流通和临床应用过程中的混乱，保证临床中紫草的疗效和安全性。
本发明建立了利用液相-圆二色谱(LC-CD)技术区分软紫草和硬紫草的鉴定的分析方法：以HPLC为代表的液相分析分离紫草所含有的萘醌类成分，以圆二色谱(CD)为检测，结合紫外检测，分析软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)，分析所得到的色谱图，与标准药材一致，或者与本发明建立的软紫草和硬紫草各自的液相-圆二色谱(LC-CD)特征一致，均可准确地鉴别。
对照品溶液的配置：取萘醌类成分对照品精密称取适量，用甲醇配制成适量的对照品溶液。
样品溶液的配置方法1：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填ODS(十二烷基键合硅胶)的SPE小色谱柱预处理，水(或者低浓度有机溶剂)洗脱除杂，继用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得。
样品溶液的配置方法2：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，过滤，即得。
样品溶液的配置方法3：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，过滤，即得。
测试方法：进行HPLC分析，以圆二色谱(CD)为检测，结合紫外(UV)检测，记录色谱图。由于萘醌类成分在紫外光谱中在200-300nm或者400-600nm有吸收峰，可以在这两个范围内测定；而在圆二色谱中，各对映异构体的在200-600nm范围内cotton效应不同(见图8、9)，可以在200-600nm范围，任意选定波长测定(210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm，200-210nm，240-250nm，300-325nm，400-450nm)。
本发明考虑到同时测定的方便和灵敏度等因素，最佳的测定波长选择为220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm，其中，320nm，360nm两个波长处紫外吸收较弱，430nm波长处圆二色谱较弱，不太利于同时测定紫外光谱和圆二色谱。因此，最优为220nm，245nm，260nm和550nm。
测定后，软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-紫外(LC-UV)色谱图均为正峰。
软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图中色谱峰的符号不同，具体特征如下：
在220nm，260nm，360nm和550nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图
软紫草中各个色谱峰为负峰，硬紫草中各个色谱峰为正峰。
在245nm，310nm和430nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图
软紫草中各个色谱峰为正峰，硬紫草中各个色谱峰为负峰。
1)以样品中各化合物的LC-UV色谱峰面积，与标准对照样品相应色谱峰面积相比较，按照标准曲线法(或外标1点法、外标2点法等)，进行定量分析，计算，即得样品中各萘醌类成分的两个对映异构体的总含量。
2)以样品中各化合物的LC-UV色谱峰面积和色谱峰的正负，与标准对照样品相应色谱峰面积和色谱峰的正负相比较，按照标准曲线法(或外标1点法、外标2点法等)，进行定量分析，计算，即得样品中各萘醌类成分的两个对映异构体的比例。
也可根据上述测试方法中的色谱峰正负规则，鉴定软紫草和硬紫草。(图10、11分别为274nm处测定的软紫草和硬紫草液相-紫外色谱(LC-UV)图和液相-圆二色谱(LC-CD)图)。由图中可知：根据液相-圆二色谱(LC-CD)图可以很清楚地区分软紫草和硬紫草。
本发明还包括软紫草和硬紫草中分离纯化了7对萘醌对映异构体的方法：
1)软紫草中的阿卡宁(1)、乙酰阿卡宁(2)、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(3)、去氧紫草素(4)、异丁酰阿卡宁(5)、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(6)、异戊酰阿卡宁(7)、α-甲基-正丁酰阿卡宁(8)的制备方法如下：
根据我们的研究发现紫草中的萘醌类成分极性较小，易溶于乙醇、石油醚等有机溶剂，尤其发现该类成分对光、热不稳定，所以，筛选确定以95％乙醇冷浸提取紫草萘醌类成分。
软紫草浸膏经薄层色谱分析和硅胶柱色谱试验，发现以石油醚∶乙酸乙酯进行柱层析梯度洗脱，可以较好地分离紫草萘醌类成分。各化合物的分离方法如下：
石油醚洗脱的前部分合并流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(100∶1)，可以得到异戊酰阿卡宁(7)和α-甲基-正丁酰阿卡宁(8)；
石油醚洗脱的后部分合并流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(100∶0.5)，可得到去氧阿卡宁(4)和β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(6)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱的前部分合并流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，100∶0.5，可得到乙酰阿卡宁(2)和β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(6)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱的后部分合并流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，收集100∶2流份，利用制备液相(ODS，甲醇-水(65∶35)洗脱)，可分离得到异丁酰阿卡宁(5)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶1)洗脱的合并流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，收集100∶2的流份，反复硅胶柱层析，可得到阿卡宁(1)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶2)洗脱的合并流份，以甲醇-水为洗脱液，利用ODS进行分离纯 化，甲醇-水(60∶40)洗脱，可得到β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(3)。
2)因为硬紫草中的萘醌类成分与软紫草中仅为对映异构体，所以其理化性质和色谱行为一致。因此，硬紫草中的紫草素(10)、β-羟基异戊酰紫草素(11)、乙酰紫草素(12)、去氧紫草素(4)、异丁酰紫草素(14)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素(15)、异戊酰紫草素(16)、α-甲基-正丁酰紫草素(17)的制备方法与软紫草中其对映异构体的制备方法一致，具体方法如下：
以95％乙醇冷浸提取紫草萘醌类成分。
硬紫草浸膏经薄层色谱分析和硅胶柱色谱试验，发现以石油醚∶乙酸乙酯进行柱层析梯度洗脱，可以较好地分离紫草萘醌类成分。各化合物的分离方法如下：
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱，合并石油醚洗脱的前部分流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱得到去氧紫草素(4)
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱，合并石油醚洗脱的中部分流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)得到异戊酰紫草素(16)和α-甲基-正丁酰紫草素(17)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱，合并石油醚洗脱的后部分流份，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)流份，利用制备液相分离，在乙腈∶水(75∶25)得到异丁酰紫草素(14)和β，β-二甲基丙烯酰紫草素(15)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶1)洗脱，合并流份，重结晶得到乙酰紫草素(12)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶7)洗脱，合并流份，葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇洗脱，收集红色流份，通过制备液相分离得到紫草素(10)；
石油醚∶乙酸乙酯(100∶15)洗脱，合并流份，ODS柱色谱纯化，甲醇水梯度洗脱，分段收集红色流份，通过制备液相分离得到β-羟基异戊酰紫草素(11)。
附图说明
图1：紫草素、阿卡宁的CD图谱。
图2：β，β-二甲基丙烯酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的CD图谱。
图3：乙酰紫草素、乙酰阿卡宁的CD图谱。
图4：异丁酰紫草素、异丁酰阿卡宁的CD图谱。
图5：化合物7+8、化合物16+17的CD图谱。
图6：β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁的CD图谱。
图7：β-羟基异戊酰紫草素的CD图谱。
图8：萘醌类成分的圆二色谱图。
图9：萘醌类成分的紫外光谱。
图10：硬紫草、软紫草的液相-紫外色谱(LC-UV)图。
图11：硬紫草、软紫草的液相-圆二色谱(LC-CD)图。
图12：对照品色谱图。
注：从上到下依次为(a)异戊酰阿卡宁+α-正丁酰阿卡宁、(b)β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、(c)异丁酰阿卡宁、(d)去氧紫草素、(e)β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、(f)乙酰阿卡宁、(g)β-羟基异戊酰紫草素、(h)阿卡宁、(i)混合对照品。
图13：软紫草提取分离流程图。
图14：硬紫草提取分离流程图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：软紫草和硬紫草的鉴定
色谱条件：色谱柱为Scienhome Kromasil C18(4.6mm×200mm，5μm)及预柱，流动相为乙腈(A)-0.3％磷酸水(B)，梯度洗脱过程(A梯度)0-10分钟70％，10-30分钟70％-75％，30-31分钟75％-95％，31-36分钟95％，36-37分钟95％-70％，37-50分钟70％。检测波长274nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，理论板数以萘醌计不低于3000。其紫外光谱的回归方程、线性范围、最低检测限和定量限结果见表1。
表1 九种萘醌化合物回归方程、线性范围、最低检测限和定量限结果
Table 1 Regression equations.correlation coefficients.linear range.LOD and LOQ for nine analytes
对照品溶液的配制：精密配置对照品配制成每毫升(1)阿卡宁12.32μg、(2)乙酰阿卡宁4.20μg、(3)β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁82.5μg、(4)去氧阿卡宁26.4μg、(5)异丁酰阿卡宁2.07μg、(6)β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁40.95μg、(8)α-甲基-正丁酰阿卡宁83.26μg、(9)羟基何帕酮156.00μg的对照品溶液和混合对照品溶液。精密配置对照品配制成每毫升(10)紫草素12.32μg、(11)β-羟基异戊酰紫草素4.20μg、(12)乙酰紫草素82.5μg、(14)异丁酰紫草素2.07 μg、(15)β，β-二甲基丙烯酰紫草素40.95μg、(16)异戊酰紫草素83.26μg、(17)α-甲基-正丁酰紫草素156.00μg的对照品溶液和混合对照品溶液。对照品色谱图见图12(注：各对映异构体出峰时间一致)。
供试品溶液的制备：取紫草粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.22μm)滤过。
测试方法：进行HPLC分析，以圆二色谱(CD)为检测，结合紫外(UV)检测，记录色谱图。
也可根据上述测试方法中的色谱峰正负规则，鉴定软紫草和硬紫草。(图10、11分别为274nm处测定的软紫草和硬紫草液相-紫外色谱(LC-UV)图和液相-圆二色谱(LC-CD)图)。由图中可知：根据液相-圆二色谱(LC-CD)图可以很清楚地区分软紫草和硬紫草。
实施例2：软紫草中萘醌衍生物的制备
软紫草粗粉1.8kg，95％乙醇冷浸提取，10倍量提取三次，每次24h，合并提取液，利用旋转蒸发仪回收溶剂得到软紫草浸膏105g。
取软紫草浸膏95g，硅胶400g，以石油醚∶乙酸乙酯进行柱层析梯度洗脱，每700mL为一流份，通过硅胶薄层色谱鉴定，合并相同流份。
石油醚洗脱合并流份12-13(2.7g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(100∶1)，得到化合物7(1g)和8(1g)；流份17(0.97g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(100∶0.5)，得到化合物4(15mg)、6(300mg)；流份20(2.98g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，100∶0.5得到化合物2(2g)、6(100mg)；流份21(2.9g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，收集100∶2流份0.5g，利用制备液相分离得到化合物5(150mg)；流份26(1.1g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，收集100∶2的流份0.21g，反复硅胶柱层析，得到化合物1(20mg)；合并100∶2流份29(1.8g)，以甲醇-水为洗脱液，利用ODS进行分离纯化，得到化合物3(20mg)、9(10mg)。利用NMR、MS等化合物结构鉴定技术，分别鉴定为：阿卡宁(1)，乙酰阿卡宁(2)，β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(3)，去氧阿卡宁(4)，异丁酰阿卡宁(5)，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(6)，异戊酰阿卡宁(7)，α-甲基-正丁酰阿卡宁(8)，羟基何帕酮(9)。
软紫草提取分离流程见图13，软紫草化学成分的结构和鉴定方法见表2。
表2 软紫草化学成分的结构和鉴定方法
Table2 The compounds isolated from Arnebia enchroma(Royle)Johnst.dry root
实施例3：硬紫草中萘醌衍生物的制备
硬紫草粗粉1.0kg，95％乙醇冷浸提取，10倍量提取三次，每次24h，合并提取液，利用旋转蒸发仪回收溶剂得到硬紫草浸膏18g，浸膏用1L水分散成混悬液，用等体积石油醚萃取三次，每次12h，回收石油醚部分萃取液，回收溶剂浓缩得石油醚部分浸膏5.7g。
取硬紫草石油醚部分浸膏5g，柱层析硅胶100g，以石油醚∶乙酸乙酯进行柱层析梯度洗脱，每300mL为一流份，通过硅胶薄层色谱鉴定，合并相同流份。
石油醚∶乙酸乙酯(100∶0.5)洗脱，合并流份2-4(0.3g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，100∶0.5得到化合物13(5mg)；合并流份5-10(0.5g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，100∶0.5得到化合物16+17(25mg)；合并流份17-25(1.2g)，进行硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，收集100∶0.5流份，利用制备液相，在乙腈∶水(75∶ 25)得到化合物14(5mg)、15(25mg)；石油醚∶乙酸乙酯(100∶1)洗脱，合并流份55-70(1.8g)，重结晶得到化合物12(1.7g)；石油醚∶乙酸乙酯(100∶7)洗脱，合并流份86-95(0.4g)，葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇洗脱，收集红色流份，通过制备液相分离得到化合物10(15mg)；石油醚∶乙酸乙酯(100∶15)洗脱，合并流份99-105(0.6g)，ODS柱色谱纯化，甲醇水梯度洗脱，分段收集红色流份，通过制备液相分离得到化合物11(15mg)。利用NMR、MS等化合物结构鉴定技术，分别鉴定为：紫草素(10)，β-羟基异戊酰紫草素(11)，乙酰紫草素(12)，去氧紫草素(4)，异丁酰紫草素(14)，β，β-二甲基丙烯酰紫草素(15)，异戊酰紫草素(16)，α-甲基-正丁酰紫草素(17)。
硬紫草提取分离流程见图14，硬紫草化学成分的结构和鉴定方法见表3。
表3 硬紫草化学成分的结构和鉴定方法
Table.3 The compounds isolated from Lithos-permum erythrorhizon Sieb.dry root
Claims (10)
1.一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱(LC-CD)鉴定方法，其特征是利用高效液相色谱(HPLC)技术，分离出紫草中的萘醌类衍生物，再利用圆二色谱(CD)检测它们的圆二色性，利用圆二色色谱图中的峰的正负特性鉴定软紫草和硬紫草。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征为圆二色谱(CD)检测波长范围为：210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm，200-210nm，240-240nm，300-325nm，400-450nm。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为：220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为：220nm，245nm，260nm和550nm。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征是
i.色谱条件：色谱柱为Scienhome Kromasil C18(4.6mm×200mm，5μm)及预柱，流动相为乙腈(A)-0.3％磷酸水(B)，梯度洗脱过程(A梯度)0-10分钟70％，10-30分钟70％-75％，30-31分钟75％-95％，31-36分钟95％，36-37分钟95％-70％，37-50分钟70％；检测波长274nm(或者220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm)，柱温30℃，流速1.0mL/min，理论板数以萘醌计不低于3000；其紫外光谱的回归方程、线性范围、最低检测限和定量限符合检测误差要求；
ii.样品溶液的配置方法1：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填ODS(十二烷基键合硅胶)的SPE小色谱柱预处理，水(或者低浓度有机溶剂)洗脱除杂，继用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得；
iii.样品溶液的配置方法2：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，过滤，即得；
iv.样品溶液的配置方法3：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，过滤，即得；
v.测试方法：进行高效液相色谱(HPLC)分析，以圆二色谱(CD)为检测，记录色谱图；软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图中色谱峰的符号不同，具体特征如下：
在220nm，274nm，360nm和550nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为负峰，硬紫草中各个色谱峰为正峰；
在245nm，310nm和430nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为正峰，硬紫草中各个色谱峰为负峰。
利用圆二色色谱图中的峰的正负特性鉴定软紫草和硬紫草。
6.一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱(LC-CD)鉴定方法，其特征是利用高效液相色谱(HPLC)分离出紫草中的萘醌类衍生物，再利用圆二色谱(CD)和紫外光谱(UV)同时检测，根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，利用圆二色色谱图中的峰的正负，鉴定软紫草和硬紫草。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征为圆二色谱(CD)检测波长范围为：210-240nm，250-300nm，325-400nm和450-600nm，200-210nm，240-240nm，300-325nm，400-450nm；紫外光谱(UV)检测波长范围为200-300nm和400-600nm。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为：220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm，最优选检测波长为：220nm，245nm，260nm和550nm。
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征为：
i.色谱条件：色谱柱为Scienhome Kromasil C18(4.6mm×200mm，5μm)及预柱，流动相为乙腈(A)-0.3％磷酸水(B)，梯度洗脱过程(A梯度)0-10分钟70％，10-30分钟70％-75％，30-31分钟75％-95％，31-36分钟95％，36-37分钟95％-70％，37-50分钟70％；检测波长274nm(或者220nm，245nm，260nm，310nm，360nm，430nm和550nm)，柱温30℃，流速1.0mL/min，理论板数以萘醌计不低于3000；其紫外光谱的回归方程、线性范围、最低检测限和定量限符合检测误差要求；
ii.样品溶液的配置方法1：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填ODS(十二烷基键合硅胶)的SPE小色谱柱预处理，水(或者低浓度有机溶剂)洗脱除杂，继用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得；
iii.样品溶液的配置方法2：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，过滤，即得；
iv.样品溶液的配置方法3：精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，过滤，即得；
v.测试方法：进行高效液相色谱(HPLC)分析，以圆二色谱(CD)为检测，记录色谱图；软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图中色谱峰的符号不同，具体特征如下：
在220nm，274nm，360nm和550nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为负峰，硬紫草中各个色谱峰为正峰；
在245nm，310nm和430nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为正峰，硬紫草中各个色谱峰为负峰；
波长为274nm处进行紫外检测，并记录色谱图；
根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，利用圆二色色谱图中的峰的正负，鉴定软紫草和硬紫草。
10.根据权利要求1-9任一所述的鉴定方法，其特征是该方法还可以用来鉴定软紫草和硬紫草提取物、含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体。
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