CN103159665A - 对sars冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用的靛红-5-酰胺类抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，所述化合物具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性，可以用作SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，在SARS治疗中发挥作用，式(1)化合物结构式如下：

Description

对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用的靛红-5-酰胺类抑制剂

技术领域

本发明涉及一类对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用的靛红-5-酰胺类抑制剂，属于药物化学领域。

背景技术

传染性非典型肺炎是一种传染性强的呼吸***疾病，世界卫生组织将其称为严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes)，简称SARS。SARS主要通过近距离空气飞沫和密切接触等传染，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。2003年，非典型肺炎席卷了全世界的32个国家，引起人们的极大恐慌，而这场风暴的始作俑者便是SARS冠状病毒。

目前对人类和动物都还没有经过临床证明治疗有特效的药物。在2003年SARS暴发期间，临床上只是使用经验性治疗、支持疗法和控制并发症的治疗方法。其中抗病毒药物、糖皮质激素、抗生素和免疫调节剂等大量应用于临床，虽在一定的阶段起到了重要的作用，但这几种药物本身都具有自身的缺陷，也给SARS病人的各项体征研究以及该病的正常发病历程的观测带来了一定的干扰。总体而言，目前无专一性的针对SARS病人的药物通过临床实验。虽然SARS在世界范围内已经得到了有效的控制，但人类无法保证SARS风暴不会卷土重来，为了减少生命和财产的损失，针对现有的研究成果研制高效的抗SARS药物具有重大的意义。

饶子和院士实验室于2003年成功解析出了SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS CoV M^PRO，又称为SARS 3CL)在不同pH值与单一抑制剂(hexapeptidyl CMK)的共晶结构，该酶是以Cys-His为活性位点的广义丝氨酸蛋白酶，其通过水解复制酶多聚蛋白释放复制酶PP1a和PP1ab，来调控病毒的复制和转录，这为研制专一有效的抗SARS病毒药物提供了更大的可能。

Li Rung Chen等合成了一系列的靛红衍生物(Bioorg.Med.Chem.Lett.15(2005)，3058-3062)，其中有两个衍生物对SARS 3CL的IC₅₀分别达到了0.98μM和0.95μM，这两个衍生物的结构如下：

IC₅₀＝0.98μM

IC₅₀＝0.95μM

Lu Zhou等合成了一系列靛红酰胺衍生物(J.Med.Chem.2006，49，3440-3443)，其中活性最好的化合物的IC₅₀达到了0.37μM，该化合物结构如下：

IC₅₀＝0.37μM。

以上两篇文献都没有记载本发明的化合物，并且也没有任何关于5位酰氨基的氨基被取代后，得到的化合物是否还具有SARS 3CL抑制作用的提示。

发明内容

本发明设计合成了一系列未见文献报道的靛红酰胺类化合物，并对其进行了SARS CoV M^PRO活性抑制实验，实验数据证明这些化合物对于SARS CoVM^PRO活性具有抑制作用，可以用于SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。Nsp5即为SARS冠状病毒主蛋白酶。

一种式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，结构式如下：

其中，

R₁选自C_1-6烷基，芳环基-甲基，芳杂环基-甲基；所述烷基、芳环基、芳杂环基任选被一个或多个以下基团取代：卤素、C_1-4烷基、羟基、硝基；

R₂是至少含有一个N原子的杂环基，该杂环基通过环上的N与5位酰基相连，所述杂环基任选被一个或多个以下基团取代：卤素、C_1-4烷基、芳环基、杂芳环基、杂环基、芳环基-C_1-4烷基；或者R₂是被芳环基取代的氨基，该芳环基任选被一个或多个卤素取代；

以上所述的芳环基为单环或双环的、6-10元芳环基，

芳杂环基为单环或双环、6-10元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的芳杂环基，

杂环基为单环或双环、5-9元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的饱和杂环基。

本发明一个优选的技术方案为：

一种式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，结构式如前所述，

其中，

R₁选自C_1-6烷基，苯基-甲基，萘基-甲基；所述烷基、苯基、萘基任选被一个或多个以下基团取代：卤素、C_1-4烷基、羟基、硝基；

R₂选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基，上述基团通过环上的N与5位酰基相连，且任选被一个或多个以下基团取代：卤素、C_1-4烷基、吡咯烷基、吡咯基、吡啶基、苯基、苯基-C_1-4烷基；或者R₂是被苯基取代的氨基，该苯基任选被一个或多个卤素取代。

本发明进一步优选的技术方案为：

一种式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，结构式如前所述，

其中，

R₁选自：

n是0-4的整数；

R₂选自：

本发明进一步优选的技术方案为：

一种式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，结构式如前所述，

其中：R₁选自甲基、苄基、2-萘基甲基；R₂选自吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、4-甲基哌啶基。

本发明中的烷基是直链或支链饱和烷基，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、正己基；卤素优选氟、氯、溴等；芳环基是单环或双环、6-10元的具有芳香性的环状基团，优选苯基、萘基、菲基等；芳杂环基是单环或双环、6-10元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的具有芳香性的环状基团，优选吡咯基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基等；杂环基是单环或双环、5-9元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的饱和环状基团，优选吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢呋喃基等。

本发明优选的化合物为：

1-甲基-5-(4-吗啉甲酰基)靛红(化合物1)，

1-苄基-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红(化合物2)，

1-(2-萘甲基)-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红(化合物3)，

1-(2-萘甲基)-5-(1-哌啶甲酰基)靛红(化合物4)，

1-(2-萘甲基)-5-[(4-甲基-1-哌啶基)甲酰基]靛红(化合物5)。

本发明的式(1)化合物经活性实验证明其具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制作用，因此可以用于制备治疗SARS的药物组合物，尤其是用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，所述的药物组合物或抑制剂包含治疗有效量的本发明式(1)化合物和药用辅料，并通过抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的活性达到对SARS治疗有益的效果。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

式(1)化合物的通用合成路线如下：

实施例一：

1-甲基-5-(4-吗啉甲酰基)靛红(化合物1)

具体步骤：

1.将水合氯醛21.6g(0.13mol)，无水硫酸钠158g(1.10mol)加至盛有440mL水的烧瓶中，加热升温至40℃，搅拌至澄清，将配置好的对氨基甲酸乙酯盐酸水溶液1(对氨基甲酸乙酯19.8g(0.12mol)溶解于180mL，2.5％盐酸中)滴加至反应液中，10-15min加完。继续反应0.5h，析出大量白色絮状沉淀，加入盐酸羟胺16.7g(0.24mol)。升温至90℃。溶液变为淡黄色，反应4h。冷却至室温，抽滤，得到黄色粉末产物2。

2.将60mL浓硫酸加热到60℃，分批加入产物2共2.0g，搅拌升温至80℃。反应4h。冷却至室温。将反应液缓慢倒入300mL冰水中，搅拌。乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥。旋干溶剂，得到靛红-5-甲酸，红色粉末产物3。

3.氮气保护条件下，将355mg(1.86mmol)产物3溶于干燥的四氢呋喃(10mL)中，加入N，N’-羰基二咪唑300mg(1.86mmol)，室温搅拌至无气泡放出。加入三乙胺0.52mL(3.72mmol)，吗啉323mg(3.72mmol)。室温搅拌10h，加水处理，乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去溶剂。柱层析纯化，二氯甲烷∶甲醇＝150∶1，得到产物4。

4.将260mg(1mmol)产物4溶于5ml无水DMF中，加入36mg(1.5mmol)NaH，反应15min，再将213mg(1.5mmol)碘甲烷溶于1ml DMF，滴入反应液中，室温反应1h，用乙酸乙酯和水萃取，收集有机相，除去溶剂，过柱纯化，二氯甲烷∶甲醇＝100∶1，得黄色固体5。收率73％，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：3.17(s，3H)，3.65(t，J＝4.8Hz，4H)，3.51(t，J＝4.8Hz，4H)，7.21(d，J＝8.8Hz，1H)，7.44(s，1H)，8.18(d，J＝8.8Hz，1H)；ESI-MS m/z 275.10([M+H⁺])。

采用与合成化合物1相同的方法，选择对应的原料合成以下化合物：

1-苄基-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红(化合物2)

黄色固体，收率81％。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：1.98(t，J＝5.6Hz，2H)，3.49(t，J＝5.6Hz，2H)，4.94(s，2H)，7.03(d，J＝8.8Hz，1H)，7.27-7.45(m，6H)，8.10(d，J＝8.8Hz，1H)；ESI-MS m/z 335.13([M+H⁺])。

1-(2-萘甲基)-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红(化合物3)

橙色固体，收率78％。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：1.96(t，J＝5.6Hz，2H)，3.43(t，J＝5.6Hz，2H)，5.14(s，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，1H)，7.27-7.45(m，8H)，8.15(d，J＝8.4Hz，1H)；ESI-MS m/z 385.13([M+H⁺])。

1-(2-萘甲基)-5-(1-哌啶甲酰基)靛红(化合物4)

橙色固体，收率78％。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：1.80(m，4H)，1.66(m，2H)，3.43(t，J＝5.6Hz，4H)，5.04(s，2H)，6.87(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24-7.48(m，8H)，8.13(d，J＝8.4Hz，1H)；；ESI-MS m/z 399.16([M+H⁺])。

1-(2-萘甲基)-5-[(4-甲基-1-哌啶基)甲酰基]靛红(化合物5)

黄色固体，收率76％。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：0.98(d，J＝7.2Hz，3H)，1.67(m，1H)，1.33-1.58(m，4H)，3.28-3.42(m，4H)5.07(s，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，1H)，7.31-7.65(m，8H)，8.24(d，J＝8.4Hz，1H)；ESI-MS m/z 413.18([M+H⁺])。

本发明的药理活性测试方法如下：

1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化

根据文献(Yang H et al.Proc Natl Acad Sci.2003 Nov；100(23)：13190-5)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化。具体方法如下：

1.1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体的构建，具体步骤包括：

a.利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增；

正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′

b.经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；

c.将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；

d.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；

e.将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；

f.将d和e获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片断和目标载体片段按照摩尔数3∶1～6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟～18小时)，转化大肠肝菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。

1.2SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化，具体步骤包括：

a.将上述步骤1.1中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；

b.在a中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；

c.5000～8000rpm离心10～15min收集细胞，然后冰浴超声破菌20～30min；破菌液13000rpm～15000rpm离心20～40min后收集上清液；

d.将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20～30个柱床体积去除杂蛋白。最后加入2mL 0.1mg/mL左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12～20小时，之后收集蛋白；

e.将上一步骤d中获得的蛋白再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化，便可得到纯度较高的SARS冠状病毒主蛋白酶。

2.SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法

本发明所采用的筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法，具体方法如下：

SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的。该荧光底物的氨基酸序列来源于SARS冠状病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。

用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。

在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入化合物的DMSO溶解物(使其终浓度为：500μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。设定阴性对照：不加入化合物，其余条件相同。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每10秒钟记录一次荧光读数，共测定10个点。以时间为X轴，荧光值为Y轴作图得到酶活动力学曲线。通过图上前两个点的数值计算斜率便可得到反应的初速度V，将阴性对照的反应初速度定义为V₀，加入化合物的反应初速度定义为V_i，从而计算出加入相应化合物后主蛋白酶的剩余活性(V_i/V₀)，相应化合物的抑制率则为(1-V_i/V₀)。当主蛋白酶的剩余活性小于20％(或抑制率大于80％)时，将进一步测定该化合物的IC₅₀值。

3.化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的IC₅₀值的测定

将化合物分别用95％的DMSO溶解成50mol/mL的溶液。取10μL的上述溶液用95％的DMSO进行2倍的梯度稀释，共稀释成12个左右的样品溶液。用上述测定方法测试不同化合浓度下主蛋白酶的剩余活性。将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的剩余活性值为Y轴，用GraphPad Prism 5(GraphPad software公司)作图并计算出相应的IC₅₀值。

实施例二：

根据上述药理活性测试方法测定化合物(1)～(5)的IC₅₀值如表2所示。

表2  化合物(1)～(5)的活性数据表

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种式(1)所示的靛红-5-酰胺类化合物，结构式如下：

其中，

R₁选自C_1-6烷基，芳环基-甲基，芳杂环基-甲基；所述烷基、芳环基、芳杂环基任选被一个或多个选自以下基团所取代：卤素、C_1-4烷基；

R₂是至少含有一个N原子的杂环基，该杂环基通过环上的N与5位酰基相连，所述杂环基任选被一个或多个选自以下基团所取代：卤素、C_1-4烷基、芳环基、芳杂环基、杂环基、芳环基-C_1-4烷基；或者R₂是被芳环基取代的氨基，该芳环基任选被一个或多个卤素所取代；

以上所述的芳环基为单环或双环的、6-10元芳环基，

芳杂环基为单环或双环、6-10元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的芳杂环基，

杂环基为单环或双环、5-9元、含有一个或多个任选自N或O或S原子的饱和杂环基。

2.根据权利要求1的式(1)化合物，其特征在于：

R₁选自C_1-6烷基，苯基-甲基，萘基-甲基；所述烷基、苯基、萘基任选被一个或多个选自以下基团所取代：卤素、C_1-4烷基；

R₂选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基，上述基团通过环上的N与5位酰基相连，且任选被一个或多个选自以下基团取代：卤素、C_1-4烷基、吡咯烷基、吡咯基、吡啶基、苯基、苯基-C_1-4烷基；或者R₂是被苯基取代的氨基，该苯基任选被一个或多个卤素取代。

3.根据权利要求2的式(1)化合物，其特征在于：

R₁选自：

n是0-4的整数；

R₂选自：

4.根据权利要求3的式(1)化合物，其特征在于：R₁选自甲基、苄基、2-萘基甲基。

5.根据权利要求3的式(1)化合物，其特征在于：R₂选自吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、4-甲基哌啶基。

6.根据权利要求1-5任一项的式(1)化合物，所述化合物为：

1-甲基-5-(4-吗啉甲酰基)靛红，

1-苄基-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红，

1-(2-萘甲基)-5-(1-吡咯烷甲酰基)靛红，

1-(2-萘甲基)-5-(1-哌啶甲酰基)靛红，

1-(2-萘甲基)-5-[(4-甲基-1-哌啶基)甲酰基]靛红。

7.药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的权利要求1-6任一项的式(1)化合物，以及药用辅料。

8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于该药物组合物是SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。

9.权利要求1-6任一项的式(1)化合物在制备用于治疗SARS的药物组合物中的用途

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述药物组合物是SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。