CN103154243A - 糖链的非还原末端为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法 - Google Patents

糖链的非还原末端为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了使用哺乳动物细胞的N-糖苷键糖链的非还原末端全部或一部分为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法。该制造方法为导入β-N-乙酰葡糖胺酶基因并使其表达的转化哺乳动物细胞及使用该细胞的糖蛋白的制造方法。

Description

糖链的非还原末端为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法
技术领域
本发明涉及使用哺乳动物细胞的糖链的非还原末端为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法。
背景技术
哺乳动物细胞中，糖蛋白的N-糖苷键糖链在自RNA翻译出蛋白质并经内质网内腔运送至高尔基体的过程中经由各种酶参与的复杂路径被附加于蛋白质的天冬酰胺残基。N-糖苷键糖链的主体为复合型糖链和高甘露糖型糖链。高甘露糖型糖链大体具有以下述结构式1表示的结构。此外，复合型糖链有各种类型，其特征是非还原末端为唾液酸残基。其一例以下述结构式2表示。此外，复合型糖链和高甘露糖型糖链共通的以下述结构式3表示的区域称为核心区域。
[化1]
高甘露糖型糖链和复合型糖链如下进行生物合成。即，首先，包含2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、9个甘露糖(Man)和3个葡萄糖(Glc)残基的多萜醇-P-P-GlcNAc2Man9Glc3中间体通过寡糖转移酶复合体转移至在内质网内腔进行翻译中的蛋白质的天冬酰胺残基，形成附加有下述结构式4的糖链的状态。
[化2]
Figure BDA00003043481400021
接着，在内质网内腔，从该结构式4的糖链通过葡糖苷酶从其非还原末端除去3个Glc，再通过ER甘露糖苷酶从其非还原末端除去1个Man，形成下述结构式5的糖链结构。
[化3]
Figure BDA00003043481400022
接着，该糖蛋白被运送至高尔基体，从该结构式5的糖链通过高尔基体甘露糖苷酶Ⅰ除去3个Man，生成在核心区域结合有2个Man的上述结构式1的高甘露糖型糖链。
复合型糖链是高甘露糖型糖链在高尔基体进一步被修饰而生成。即，上述结构式2的复合型糖链的合成路径如下。首先，在高甘露糖型糖链(结构式1)上通过N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅰ结合1个GlcNAc，形成下述结构式6的糖链结构。接着，通过高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ除去2个Man，形成在核心区域结合有1个GlcNAc的下述结构式7的糖链结构。
[化4]
接着，结合2个GlcNAc、3个半乳糖(Gal)、3个唾液酸(Sia)而形成上述结构式2的复合型糖链。也存在直接与天冬酰胺残基结合的GlcNAc结合有岩藻糖的复合型糖链。
使用哺乳动物细胞、例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)制造重组体糖蛋白的情况下，该蛋白质的糖链结构大多呈复合型糖链，所以这样的重组体糖蛋白的糖链的非还原末端为唾液酸残基。已知如果在重组体糖蛋白上附加非还原末端为唾液酸残基的复合型糖链，则给药至生物体内时血中的稳定性增加(参照专利文献1)。因此，制造在血液中循环而发挥其效果的重组体糖蛋白的情况下，可期待通过延长它们的血中半衰期而提高药效等，所以糖链的非还原末端为唾液酸残基的采用CHO细胞的制造方法被广泛使用。红细胞生成素、促卵泡生成素(FSH)是其良好的例子(参照专利文献2、3)。
但是，重组体糖蛋白中，存在糖链结构为复合型糖链时反而会成为缺点的糖蛋白。例如，葡糖脑苷脂酶等在对于溶酶体病的酶补充疗法中作为药物给予患者的一类酶。这些酶在给药至生物体内后，需要摄入至细胞内来发挥其功能，但向细胞内的摄入通过在靶细胞的细胞膜上表达的甘露糖受体进行(参照非专利文献1)。而且，为了通过甘露糖受体摄入糖蛋白，糖蛋白的糖链结构必须是非还原末端为甘露糖残基的高甘露糖型糖链。因此，在这样的酶补充疗法中，无法使用糖链结构为复合型糖链的糖蛋白。
此外，要求较短的血中半衰期的药品的情况下，非还原末端为复合型糖链会使血中的稳定性增加，所以不理想，在这样的情况下也需要高甘露糖型糖链。
于是，进行了确立具有高甘露糖型糖链的糖蛋白的制造方法的尝试。例如，有使用哺乳动物细胞先制造具有复合型糖链的糖蛋白，将其用唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和己糖胺酶这3种酶进行处理，从非还原末端除去唾液酸、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，使还原末端为甘露糖残基的方法。现在，由健赞公司(ジェンザイム社)作为戈谢病治疗剂销售的葡糖脑苷脂酶制剂(商品名:Cerezyme(注册商标)注200U，参照非专利文献2)通过该方法制造。然而，该方法需要酶处理这一追加工序，所以存在由此产生的工序繁杂和成本的问题等。
此外，通过哺乳动物细胞表达糖蛋白时，已知在Kifunensine的存在下培养细胞的方法(参照专利文献4)。Kifunensine是ER甘露糖苷酶的抑制剂，所以糖链的修饰过程在作为ER甘露糖苷酶的前一阶段的基于葡糖苷酶的葡萄糖除去中止，因而获得呈在非还原末端具有3个甘露糖残基的下述结构式8的糖链结构的糖蛋白。然而，该方法在合成过程中必须添加酶抑制剂，所以有由此产生的对生成物的安全性存在不安的问题等。
[化5]
除此之外，已知使用作为N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅰ活性缺失的CHO细胞突变株的LEC-1细胞的方法(参照非专利文献3)。N-乙酰葡糖胺转移酶是对在高甘露糖型糖链(结构式1)上结合1个GlcNAc而形成上述结构式6的糖链结构的由高甘露糖型糖链合成复合型糖链的路径的初期反应进行催化的酶。由于该酶的缺失，LEC-1细胞中无法由高甘露糖型糖链合成复合型糖链，获得具有高甘露糖型糖链的糖链结构的糖蛋白。然而，作为制造糖蛋白的方法，使用LEC-1细胞的方法未必生产性良好(非专利文献4)。
此外，作为在非还原末端具有甘露糖残基的糖蛋白的制造方法，已知使用昆虫细胞的表达体系(参照专利文献5)。已知在昆虫细胞中，可以产生具有由2个GlcNAc和3个Man构成的以上述结构式3表示的N-糖苷键型糖链(寡甘露糖型糖链)的糖蛋白(参照非专利文献5)。即，昆虫细胞的话，从上述结构式7通过β-N-乙酰葡糖胺酶除去非还原末端的GlcNAc而形成寡甘露糖型糖链的路径占据优势，因而获得在非还原末端具有甘露糖残基的糖蛋白(参照非专利文献6)。
使用昆虫细胞的表达体系一般采用来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞(Sf-9等)(参照专利文献6)。已知作为具有从糖链的非还原末端除去GlcNAc的活性的酶，草地夜蛾具有β-N-乙酰葡糖胺酶1、β-N-乙酰葡糖胺酶3(参照非专利文献7、8)和SfFDL这3种β-N-乙酰葡糖胺酶(参照专利文献7)。从蚕蛾(Bombyx mori)也分离出具有同样活性的酶(例如BmFDL)(非专利文献9)。然而，昆虫细胞和哺乳动物细胞(特别是人细胞)之间存在明显的种间差异，因此医药品等的制造中使用昆虫细胞时，会担心其生成物在昆虫细胞内的生物合成过程中受到的各种影响，因而被认为不理想。
除此之外，作为使用哺乳动物细胞以外的细胞的在非还原末端具有甘露糖残基的糖蛋白的制造方法，已知使用来源于植物的细胞的表达体系(参照专利文献8)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特开平8-027181公报
专利文献2:日本专利特表2001-525342公报
专利文献3:WO2009/127826
专利文献4:日本专利特表2004-506438公报
专利文献5:日本专利特开2009-225781公报
专利文献6:日本专利特开平2-291270公报
专利文献7:WO2009/079376
专利文献8:日本专利特表2006-524506公报
非专利文献
非专利文献1:Sato Y.等,J Clin Invest.(1993)91,1909-17
非专利文献2:Cerezyme注200U所附文献
非专利文献3:Ripka J.等,J Cell Biochem.(1990)42,117-22
非专利文献4:Van Patten SM.等,Glycobiology(2007)17,467-78
非专利文献5:Watanabe S.等,J Biol Chem.(2002)277,5090-3
非专利文献6:Altmann F.等,J Biol Chem.(1995)270,17344-9
非专利文献7:Tomiya N.等,J Biol Chem.(2006)281,19545-60
非专利文献8:Aumiller JJ.等,Prot.Expr.Purif.(2006)47,571-90
非专利文献9:Nomura T.等,J Biosci Bioeng.(2010)110,386-91
发明概述
发明所要解决的技术问题
在上述背景下，本发明的目的在于提供使用哺乳动物细胞、特别是CHO细胞制造在N-糖苷键糖链的非还原末端具有甘露糖残基的重组体糖蛋白的新方法。
解决技术问题所采用的技术方案
上述目的的研究中，本发明人对高甘露糖型糖链的合成占优势的昆虫细胞内的机理向哺乳动物细胞的导入进行了研究。结果意外地发现通过使用向哺乳动物细胞导入β-N-乙酰葡糖胺酶基因使其表达的转化哺乳动物细胞，可获得在N-糖苷键糖链的非还原末端具有甘露糖残基的重组体糖蛋白，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的发明。
[1]转化哺乳动物细胞，其中，导入有外源的β-N-乙酰葡糖胺酶基因并表达。
[2]如上述[1]的转化哺乳动物细胞，其中，通过导入该β-N-乙酰葡糖胺酶基因而表达的β-N-乙酰葡糖胺酶在高尔基体中显示其活性。
[3]如上述[1]或[2]的转化哺乳动物细胞，其中，该β-N-乙酰葡糖胺酶基因来源于昆虫。
[4]如上述[3]的转化哺乳动物细胞，其中，该昆虫是属于鳞翅目的昆虫。
[5]如上述[4]的转化哺乳动物细胞，其中，属于鳞翅目的该昆虫为草地夜蛾或蚕蛾。
[6]如上述[5]的转化哺乳动物细胞，其中，该β-N-乙酰葡糖胺酶基因为选自β-N-乙酰葡糖胺酶1基因、β-N-乙酰葡糖胺酶3基因、SfFDL基因和BmFDL基因的1种或2种以上。
[7]如上述[1]～[6]中的任一项的转化哺乳动物细胞，其中，进一步导入编码规定的糖蛋白的外源基因并表达，从而产生该规定的糖蛋白。
[8]如上述[7]的转化哺乳动物细胞，其中，编码该规定的糖蛋白的外源基因为来源于人的基因。
[9]如上述[8]的转化哺乳动物细胞，其中，来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。
[10]如上述[9]的转化哺乳动物细胞，其中，该溶酶体酶为选自葡糖脑苷脂酶、酸性神经鞘磷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性α-葡糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-甘露糖苷酶、唾液酸酶的酶。
[11]如上述[9]的转化哺乳动物细胞，其中，该溶酶体酶为葡糖脑苷脂酶。
[12]位于N-糖苷键糖链的非还原末端的残基全部或一部分为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法，其中，包括：
(a)将上述[1]～[6]中的任一项的哺乳动物细胞在培养液中培养，使其表达糖蛋白的步骤；以及
(b)对通过上述步骤(a)表达的糖蛋白进行纯化的步骤。
[13]如上述[12]的制造方法，其中，使用上述[7]的哺乳动物细胞代替上述[1]～[6]中的任一项的哺乳动物细胞。
[14]如上述[13]的制造方法，其中，编码该糖蛋白的外源基因为来源于人的基因。
[15]如上述[14]的制造方法，其中，来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。
[16]如上述[15]的制造方法，其中，该溶酶体酶为选自葡糖脑苷脂酶、酸性神经鞘磷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性α-葡糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-甘露糖苷酶、唾液酸酶的酶。
[17]如上述[15]的制造方法，其中，该溶酶体酶为葡糖脑苷脂酶。
发明的效果
通过本发明以昆虫的β-N-乙酰葡糖胺酶基因转化的哺乳类细胞的性状发生变化，位于其产生的糖蛋白的N-糖苷键糖链的非还原末端的残基为甘露糖的比例增加。因此，该细胞以位于其N-糖苷键糖链的非还原末端的残基的至少一部分或全部为甘露糖残基的方式产生原来所具有的内源性的糖蛋白。此外，导入外源的糖蛋白基因而使其表达的情况下，如果使用该转化哺乳类细胞代替天然的哺乳类细胞，则可获得或获得更多使用天然的哺乳类细胞时未能获得的位于糖链的非还原末端的残基的一部分为甘露糖残基的糖蛋白，较好是可获得全部为甘露糖残基的糖蛋白。
因此，如果采用本发明，则可在不使用昆虫细胞等的情况下制造位于N-糖苷键糖链的非还原末端的残基的比例增大了的糖蛋白。以往，使用哺乳动物细胞制成的糖蛋白具有复合型糖链作为N-糖苷键糖链，因此为了使位于其非还原末端的残基为甘露糖残基，需要进一步进行酶处理等，而如果采用本发明，可直接获得位于N-糖苷键糖链的非还原末端的残基全部或一部分为甘露糖残基的糖蛋白。因此，如果采用本发明的方法，可比以往更高效、更容易地获得具有甘露糖残基作为N-糖苷键糖链的非还原末端残基的糖蛋白。此外，通过本发明得到的糖蛋白作为例如需介以存在于靶细胞表面的甘露糖受体摄入至细胞的医药品或血中半衰期应较短的医药品等有用。
附图简要说明
图1-1表示pE-neo载体的构建方法的流程图。
图1-2表示pE-neo载体的构建方法的流程图。
图2-1表示pE-hygr载体的构建方法的流程图。
图2-2表示pE-hygr载体的构建方法的流程图。
图2-3表示pE-hygr载体的构建方法的流程图。
图3是表示葡糖脑苷脂酶(GBA)的电泳图案的图。泳道1添加有GBA表达细胞的培养上清，泳道2～4依次添加有对GBA表达细胞的培养上清用唾液酸酶、β-1,4-半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺酶进行了处理的试样，泳道5添加有GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清。
图4是表示由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的葡糖脑苷脂酶(GBA)的巨噬细胞内摄入量的测定结果的图。曲线1表示由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量，曲线2表示由GBA表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量，曲线3表示由GBA表达细胞得到且通过酶对糖链进行了修剪的GBA的细胞内摄入量。曲线4～6分别表示甘露聚糖的存在下的由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量、由GBA表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量以及由GBA表达细胞得到且通过酶对糖链进行了修剪的GBA的细胞内摄入量。纵轴表示摄入细胞内的GBA的量(相对于对照的％)，横轴表示GBA的浓度(mU/mL)。
图5是表示由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的葡糖脑苷脂酶(GBA)的电泳图案的图。箭头表示来源于GBA的条带。（泳道M添加有分子量标记物，泳道1添加有GBA表达细胞的培养上清，泳道2添加有GBA/Sf-FDL表达细胞的培养上清，泳道3添加有GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清。）
图6是表示由GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清得到的葡糖脑苷脂酶(GBA)的细胞内摄入量的测定结果的图。曲线1表示由GBA/Sf-FDL表达细胞得到的GBA的细胞摄入量，曲线2表示由GBA/Bm-FDL表达细胞得到的GBA的细胞摄入量，曲线3表示由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的GBA的细胞摄入量。曲线4～6分别表示甘露聚糖的存在下的由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量、由GBA/Sf-FDL表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量、由GBA/Bm-FDL表达细胞得到的GBA的细胞内摄入量。纵轴表示摄入细胞内的GBA的量(相对于对照的％)，横轴表示GBA的浓度(mU/mL)。
本发明优选实施方式
本发明中，提及哺乳动物时无特别限定，包含任何哺乳动物，较好是人，非洲绿猴等灵长类，小鼠、大鼠、中国仓鼠等啮齿类，兔，狗。此外，提及哺乳动物细胞时，只要是来源于哺乳动物的细胞即可，无特别限定，可以是从取自生物体的脏器、肌肉组织、皮肤组织、***、神经组织、血液、骨髓等采集的细胞的初代培养细胞、继代培养细胞和继代培养后也形成细胞株而性状稳定的细胞中的任一种。此外，细胞可以是正常细胞、癌细胞中的任一种。可特别优选使用的细胞是来源于中国仓鼠的卵巢的CHO细胞、来源于人的成纤维细胞和非洲绿猴的肾成纤维细胞的COS细胞。
本发明中，提及β-N-乙酰葡糖胺酶时，是指具有使位于糖链的非还原末端的形成β-糖苷键的N-乙酰葡糖胺(例如位于上述结构式6、结构式7等的非还原末端的N-乙酰葡糖胺)游离的活性的酶。此外，编码β-N-乙酰葡糖胺酶基因只要所编码的β-N-乙酰葡糖胺酶具有上述酶活性，可以是任意的基因。例如，还可以使用直接来源于生物的野生型的基因，对野生型的基因实施了碱基对的置换、***、缺失等突变的突变型的基因，人工设计的基因中的任一种。此外，对于生物的种类也无特别限定，可使用来源于包括哺乳动物在内的任何生物的基因，可使用来源于例如属于鳞翅目(Lepidoptera)的蚕蛾(Bombyx mori)、草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、尺蠖(Geometridae)等和属于双翅目(Diptera)的果蝇(Drosophila)等昆虫，芽孢杆菌属等的原核生物，线虫、酵母、放线菌、丝状菌、子囊菌、担子菌以及来源于植物的基因。其中，较好是来源于昆虫、更好是属于鳞翅目的昆虫、特别好是草地夜蛾或蚕蛾的基因。
作为可使用的来源于生物的β-N-乙酰葡糖胺酶基因的例子，有来源于草地夜蛾的β-N-乙酰葡糖胺酶1、β-N-乙酰葡糖胺酶3基因、SfFDL基因和来源于蚕蛾的BmFDL基因等。此外，还可以使用使来源于多种生物的β-N-乙酰葡糖胺酶基因片断融合而构建的β-N-乙酰葡糖胺酶基因。
本发明中，通过哺乳动物细胞表达的β-N-乙酰葡糖胺酶在该细胞内的N-糖苷键糖链的合成路径中起到使位于例如上述结构式6、结构式7的非还原末端的N-乙酰葡糖胺酶游离的酶的作用。因此，理想的是该酶在作为哺乳动物细胞内进行N-糖苷键糖链的合成的细胞器的高尔基体显示其活性。
已知哺乳动物细胞内定位于这些细胞器中的蛋白质通常在其氨基酸序列中具有定位信号。因此，作为本发明中导入的β-N-乙酰葡糖胺酶基因，为了更积极地使其定位于这些细胞器，还可以使用使编码β-N-乙酰葡糖胺酶的酶活性部位的基因片段与编码其它蛋白质的上述定位信号的基因片段融合而构建的嵌合体型的β-N-乙酰葡糖胺酶基因。
本发明中，基于β-N-乙酰葡糖胺酶基因的哺乳动物细胞的转化是为了通过哺乳动物细胞使β-N-乙酰葡糖胺酶表达而进行，只要可实现该目的，可使用任何方法。通常，该转化可通过将整合有β-N-乙酰葡糖胺酶基因的表达载体的导入哺乳动物细胞来进行。这样的表达载体只要可在哺乳动物细胞内使β-N-乙酰葡糖胺酶基因表达即可，无特别限定。表达载体一般为环状的质粒，将其直接以环状的状态导入或用限制酶切断后导入细胞。β-N-乙酰葡糖胺酶基因整合至控制基因表达的表达载体内的启动子下游而使其在哺乳动物细胞内表达。这时，作为启动子，可使用来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子、SV40初期启动子、延伸因子1(EF-1)启动子等。
或者，该转化例如可通过使哺乳动物细胞与表达β-N-乙酰葡糖胺酶的昆虫细胞等细胞融合来进行。本说明书中，这样融合了的哺乳动物细胞也包括在本发明的通过β-N-乙酰葡糖胺酶基因转化了的哺乳动物细胞内。此外，这时不仅限于1种，也可以通过多种β-N-乙酰葡糖胺酶基因使哺乳动物细胞转化。
本发明中，基于编码糖蛋白的外源基因的哺乳动物细胞的转化为了在哺乳动物细胞中产生该糖蛋白而进行，只要可实现该目的，可使用任何方法进行。该转化可通过上述基于β-N-乙酰葡糖胺酶基因的哺乳动物细胞的转化同样地实施。
本发明中，对于整合于表达载体的编码糖蛋白的外源基因无特别限定，较好是编码在给药至生物体内时需要介以甘露糖受体摄入细胞的糖蛋白的基因，特别好是编码葡糖脑苷脂酶、酸性神经鞘磷酸酯(神经鞘磷脂磷酸二脂酶)等溶酶体酶的基因。通过本发明的制造方法得到的葡糖脑苷脂酶可用于戈谢病患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的酸性神经鞘磷酸酯可用于尼-皮病患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的溶酶体酸性脂肪酶可用于沃尔曼病患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的酸性α-葡糖苷酶(酸性麦芽糖酶)可用于庞贝氏病患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶可用于马-拉综合征患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可用于亨特氏综合征患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的α-L-艾杜糖醛酸酶可用于赫勒氏综合征患者的酶补充疗法，通过本发明的制造方法得到的α-半乳糖苷酶A可用于法布里病患者的酶补充疗法。除此之外，本发明的制造方法还可用于己糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、α-甘露糖苷酶、唾液酸酶等酶的制造。
此外，本发明中，基于哺乳动物细胞的糖蛋白的产生可不源自外源基因，而在具有作为目标的糖蛋白的产生能力的哺乳动物细胞中诱导编码该糖蛋白的内源性基因的表达量增大来进行。该情况下的内源性基因是指原本存在于使用的哺乳动物细胞的基因组上的基因。对于诱导细胞而使内源性基因的表达量增大的方法无特别限定，可使用周知的方法进行。例如，有通过同源重组将来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子等导入至内源性基因的表达控制位点的方法(WO94/12650)，向培养液中添加作用于特定的内源性基因的表达控制位点而使该基因的表达量增大的激素、生长因子、维生素、细胞因子、白细胞介素等的方法。例如类固醇激素、甲状腺激素、视黄酸、维生素B等可介以它们的受体使在表达控制部位具有激素应答序列的内源性基因活化，使其表达量增大。
通过本发明的制造方法得到的糖蛋白中，位于N-糖苷键糖链的非还原末端的残基的至少一部分或全部为甘露糖残基，所以不仅介以甘露糖受体摄入细胞内，而且与N-糖苷键糖链为复合型糖链的情况相比，给药至生物体内时的稳定性、血液动态变化。因此，本发明也可以为了糖蛋白的生物体内的稳定性、血液动态变化而使用。即，复合型糖链的非还原末端的唾液酸具有提高生物体内的糖蛋白的稳定性的效果，而本发明可为了获得例如在给药至生物体内时血中半衰期短的糖蛋白而使用。推测有副作用的医药品在生物体内长期存在可能会促进该副作用的产生。这样的情况下，通过使用本发明，可制造由半衰期较短的糖蛋白形成的医药品。
以下，参照实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于实施例。
[pE-neo载体和pE-hygr载体的构建]
将pEF/myc/nuc载体(英杰公司(インビトロジェン社))用KpnⅠ和NcoⅠ进行消化，切出包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域，将其用T4DNA聚合酶进行平端化处理。将pCI-neo(英杰公司)用BglⅡ和EcoRⅠ进行消化，切除包含CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4DNA聚合酶进行平端化处理。向其中***上述的包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体(图1-1和图1-2)。
将pE-neo载体用SfiⅠ和BstXⅠ进行消化，切除包含新霉素抗性基因的约1kbp的区域(图2-1)。将pcDNA3.1/Hygro(+)(英杰公司)作为模板用引物Hyg-Sfi(5'-GAGGCCGCCTCGGCCTCTGA-3'，序列编号1)和引物Hyg-BstX(5'-AACCATCGTGATGGGTGCTATTCCTTTGC-3'，序列编号2)，通过PCR反应扩增潮霉素基因(图2-2)。将扩增得到的潮霉素基因用Sfi Ⅰ和BstX Ⅰ进行消化，***上述的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体(图2-3)。
[葡糖脑苷脂酶表达细胞的构建]
将人胎盘cDNA文库A(宝生物株式会社(TAKARA社))，使用引物GBA-Mlu(5’-GCAATACGCGTCCGCCACCATGGAGTTTTCAAGTCCTTCCAGAGAGG-3’，序列编号3)和引物GBA-Not(5’-GGACGCGGCCGCGAGCTCTCACTGGCGACGCCACAGGTAGG-3’，序列编号4)，通过PCR使葡糖脑苷脂酶基因(GBA基因)扩增。将该扩增而得的基因用限制酶(MluⅠ和NotⅠ)进行消化，***至pCI-neo(普洛麦格公司(Promega社))的MluⅠ与NotⅠ之间，将其称为pCI-neo(GBA)。使用DNA测序仪(ABI公司(ABI社))确认***至pCI-neo的GBA基因的碱基序列中没有突变后，将pCI-neo(GBA)用限制酶(MluⅠ和NotⅠ)进行消化，切出GBA基因。接着，将切出的GBA基因***如上构建的表达载体pE-neo的MluⅠ与NotⅠ之间，将其称为GBA表达载体[pE-neo(GBA)]。将CHO-K1细胞使用Lipofectamine2000试剂(英杰公司(Invitrogen社))以pE-neo(GBA)进行转化后，用含G418的CD Opti CHO培养基(英杰公司)进行选择培养，选择葡糖脑苷脂酶表达细胞(GBA表达细胞)。
[β-N-乙酰葡糖胺酶3表达质粒的构建]
使用QuickPrep总RNA提取试剂盒(安法玛西亚公司(Amersham Pharmacia社))从来源于草地夜蛾的Sf9细胞(英杰公司)提取纯化总RNA，使用SuperScript的cDNA合成选择***(吉伯科BRL公司(GIBCO BRL社))实施将低聚dT作为引物的逆转录反应。将逆转录反应物作为模板，分别使用引物N-AGase5’-Sal(5’-CCGGTCGACCATGTTACGGCACGTAATATTGTTATTCG-3’，序列编号5)与引物N-AGase5’-Mlu(5’-ACCAATCAGTTTATAGGTGAT-3’，序列编号6)以及引物N-AGase3’-Mlu(5’-GAAGTACACCCACAGAGGTC-3’，序列编号7)与引物N-AGase3’-Not(5’-GCTTGCGGCCGCCTAAAAGTAATTCCCTGTTACGCAAAATCC-3’，序列编号8)的引物对实施PCR，将β-N-乙酰葡糖胺酶3基因等分至5’侧和3’侧分别扩增。将5’侧DNA片断用限制酶(SalⅠ和MluⅠ)进行消化，将3’侧DNA片断用限制酶(MluⅠ和NotⅠ)进行消化，将5’侧DNA片断***至pCI-neo的SalⅠ与MluⅠ之间，将3’侧DNA片断***至pCI-neo的MluⅠ与NotⅠ之间，分别称为pCI-neo(N-AGase5’)、pCI-neo(N-AGase3’)。使用DNA测序仪(ABI公司)确认***至pCI-neo的β-N-乙酰葡糖胺酶3基因的各片断的碱基序列中没有突变后，将pCI-neo(N-AGase5’)用SalⅠ和MluⅠ切断，将pCI-neo(N-AGase3’)用MluⅠ和NotⅠ切断，切出5’侧DNA片断和3’侧DNA片断。接着，向pBluescript SK(-)(东洋纺织株式会社(東洋紡社))的SalⅠ与NotⅠ之间整合5’侧DNA片断和3’侧DNA片断，从而构建全长的β-N-乙酰葡糖胺酶3基因。将其称为pBSK(N-AGase)。将pBSK(N-AGase)用SalⅠ和NotⅠ进行消化，切出β-N-乙酰葡糖胺酶3基因，将其***如上构建的表达载体pE-hygr的SalⅠ与NotⅠ之间，将其称为β-N-乙酰葡糖胺酶3表达质粒[pE-hygr(N-AGase)]。
[向GBA表达细胞的β-N-乙酰葡糖胺酶3基因的导入]
向GBA表达细胞中通过电穿孔法导入pE-hygr(N-AGase)后，将该细胞用含200μM潮霉素和500μg/mL G418的CD Opti CHO培养基进行选择培养，获得通过β-N-乙酰葡糖胺酶3基因转化的GBA表达细胞。
[基于菜豆凝集素(PHA-L4和PHA-E4)的选择培养]
菜豆凝集素存在L型和E型这2种亚基，L型识别4条链复合型糖链，E识别平分的2条链复合型糖链结构。PHA-L4为仅由L型进行四聚体的同工凝集素，PHA-E4为仅由E型进行四聚体的同工凝集素。如果用高浓度的这些凝集素处理细胞，则介以具有位于非还原末端的残基为唾液酸残基的复合型糖链结构的膜蛋白，凝集素与细胞结合，因而细胞死亡。此外，细胞通过凝集素交联，细胞凝集。另一方面，膜蛋白的糖链结构变成非还原末端具有甘露糖残基的结构时，凝集素无法与细胞结合，细胞可增殖。将向GBA表达细胞通过电穿孔法导入pE-hygr(N-AGase)后进行选择培养得到的上述转化细胞用添加有12μg/mL的PHA-L4(日本油磨株式会社(J Oil Mills社))和12μg/mL的PHA-E4(日本油磨株式会社)的培养基、CD Opti CHO培养基进行培养，从而使该转化细胞中表达复合型糖链的细胞死亡的同时使其凝集，回收非凝集细胞。将回收的非凝集细胞作为GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞。
[基于蛋白质印迹的糖链结构的分析]
分别将GBA表达细胞和GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清各约10μL供于SDS-PAGE电泳(10％凝胶)，电泳后转印至硝基纤维素膜。一次抗体使用兔抗人GBA抗体，二次抗体使用标记化抗兔IgG抗体，检测转印至膜上的GBA。如果比较GBA表达细胞和GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞各自的培养上清所含的GBA的电泳图案，相比前者，后者可确认伴随分子量下降的电泳距离的增加(图3，泳道1和5)。GBA表达细胞的培养上清所含的GBA的糖链结构被认为是非还原末端为唾液酸的复合型糖链，所以向GBA表达细胞的培养上清中依次添加唾液酸酶(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs社))、β-1,4-半乳糖苷酶(新英格兰生物实验室公司)和β-N-乙酰葡糖胺酶(新英格兰生物实验室公司)。因而随着将这些酶依次添加至培养上清，可确认到伴随分子量下降的电泳距离的增加(图3，泳道2～4)。唾液酸酶、β-1,4-半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺酶具有从糖链的非还原末端除去唾液酸、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的活性，所以该结构显示GBA表达细胞的培养上清所含的GBA的糖链结构为复合型糖链。此外，用β-N-乙酰葡糖胺酶处理后的GBA的条带(图3，泳道4)显示糖链的非还原末端为甘露糖的GBA的电泳图案。如果比较该用β-N-乙酰葡糖胺酶处理后的GBA的条带(图3，泳道4)和GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清所含的GBA的条带(图3，泳道5)，两者呈现几乎相同的电泳图案。该结果提示通过GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞表达的GBA的糖链不是在非还原末端具有唾液酸的复合型糖链，而是在非还原末端具有甘露糖的糖链。即，该结果表示导入至哺乳动物细胞的来源于昆虫的非哺乳动物的β-N-乙酰葡糖胺酶3在高尔基体中显示其活性，起到在GBA的糖链修饰过程中除去位于非还原末端的N-乙酰葡糖胺而使糖链的非还原末端为甘露糖残基的酶的作用。表示来源于昆虫的非哺乳动物的β-N-乙酰葡糖胺酶3像这样在哺乳动物细胞内也同样起作用的报告至今为止是首次。
[葡糖脑苷脂酶的纯化-第一工序(疏水性柱色谱)]
分别培养GBA表达细胞和GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞，从培养液中按照以下的步骤纯化葡糖脑苷脂酶。首先，将培养液离心而回收培养上清。将培养上清用膜滤器过滤后，向其中添加乙二醇、1M DTT和250mM乙酸钠(pH4.8)，使最终浓度分别为20％乙二醇、5mM DTT和50mM乙酸钠。将培养上清适用于用结合用缓冲液[50mM乙酸钠(pH4.8)，20％乙二醇]平衡的HiTrap苯基琼脂糖凝胶FF5mL柱(GE医疗集团(GEヘルスケア社))后，用10柱容量的结合用缓冲液清洗柱。接着，按照结合用缓冲液与溶出用缓冲液[50mM乙酸钠(pH4.8)，20％乙二醇，50％乙醇]的混合比由100:0至0:100的条件形成6柱容量的线性梯度而溶出葡糖脑苷脂酶。通过下述的方法测定分配后的溶出液的活性，回收具GBA活性的部分。流速全部设为1.5mL/分钟。
[葡糖脑苷脂酶的纯化-第二工序(阳离子交换柱色谱)]
向通过上述第一工序回收的部分加入等量的纯水稀释，再向其中添加乙二醇、1M DTT和250mM乙酸钠(pH4.8)，使最终浓度分别为20％乙二醇、5mM DTT和50mM乙酸钠。将上述部分适用于用清洗用缓冲液[30mM乙酸钠(pH5.6)，0.01％吐温80]平衡的HiTrap CM-琼脂糖凝胶FF1mL柱(GE医疗集团)后，用10柱容量(10mL)的清洗用缓冲液清洗柱。接着，按照缓冲液A[50mM柠檬酸，0.01％吐温80]与缓冲液B[50mM柠檬酸钠，0.01％吐温80]的混合比由75:25至4:96的条件形成8柱容量的线性梯度，再通入5柱容量的缓冲液A与缓冲液B的混合比为4:96的缓冲液而溶出葡糖脑苷脂酶。将溶出液以1mL分割回收，向其中分别加入25μL1M甘露糖醇混合。通过下述的方法测定各部分的GBA活性，回收具GBA活性的部分。流速全部设为1.5mL/分钟。
[GBA活性测定]
GBA活性测定将Pasmanik-Chor M.等,Biochem J317,81-88(1996)中记载的方法作为参考实施。将磷酸-4-甲基伞形酮酯(4-MUF，西格玛化学公司(SigmaChemical Co.)制)溶解于稀释用缓冲液(含0.125％牛磺胆酸钠、0.15％TritonX-100、0.1％牛血清白蛋白的100mM磷酸钾缓冲液(pH5.96))后，进行梯度稀释，制成200、100、50、25、12.5、6.25和3.125mM浓度的标准溶液。将4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(西格玛化学公司制)溶解于稀释用缓冲液使其浓度达到4mM，将其作为底物溶液。检测样本根据需要在测定前用稀释用缓冲液稀释。向Fluoroplate F96中分别加入10μL4MUF标准溶液或检测样本后，加入70μL底物溶液混合。在37℃反应1小时后，向各孔中分别加入200μL作为反应终止液的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.6)后，用Fluoroplate读板机以激发波长355nm、检测波长460nm的条件测定荧光强度。根据4-MUF标准溶液的荧光强度绘制校正曲线，将各检测样本的荧光强度内插至校正曲线中，算出活性(nmol/h/mL)。测定重复进行，将平均值作为测定值。
[使用巨噬细胞细胞株NR8383的GBA的细胞内摄入量测定]
使用巨噬细胞细胞株NR8383的GBA的细胞内摄入量测定将Zhu Y.等,JPharmacol Exp Ther.308,705-11(2004)中记载的方法作为参考实施。将NR8383细胞(来源于大鼠肺泡巨噬细胞的细胞株，ATCC编号:CRL-2192)在含15％胎牛血清(FBS)的Kaighn改良Ham’s F12(F12K)培养基(英杰公司)中培养。NR8383细胞达到近汇合状态时，将培养基换为含32μM Conduritol B Epoxide(CBE)(卡尔生物化学公司(Calbiochem社))的F12K培养基，培养一晚(18小时以内)，使NR8383细胞的内源性的GBA失活。将细胞离心回收，用含15％FBS的F12K培养基清洗3次后，悬浮于20mL的测定用培养基(含25mM HEPES、4mg/mL牛血清白蛋白的pH6.8的F12K培养基)，通过CO2培养箱培养2.5小时。将细胞分成2份离心回收，一份重新悬浮于5mL的测定用培养基，另一份重新悬浮于5mL的含50mg/mL甘露糖的测定用培养基。这时的细胞密度均按照1×107细胞/mL的条件制备。将各细胞悬浮液分别注入190μL至培养试管中，向其中分别按照GBA的最终浓度为规定浓度(mU/mL)的条件加入各10μL的GBA样品并混合，在37℃实施2小时的振荡培养。这时，将加入10μL测定用培养基代替GBA样品的试样作为对照。培养后，将细胞通过离心回收，用含1mg/mL甘露聚糖(半井泰斯科株式会社(ナカライテスク))的PBS清洗3次。然后，用PBS清洗2次后，用150μL的细胞溶解液[50mM磷酸钾，pH6.5，0.25％Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(ロシュ社))]使细胞溶解。通过上述的GBA活性测定方法测定所得的细胞溶解液中的GBA活性。将从用不含甘露糖的测定用培养基培养的细胞的GBA活性测定值减去用含甘露糖的测定用培养基培养的细胞的GBA活性测定值而得的值作为摄入至巨噬细胞内的GBA的量，结果可知GBA表达细胞的培养上清所得的GBA几乎未摄入NR8383细胞内，而GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清所得的GBA被摄入NR8383细胞内。
此外，对照中的GBA的活性测定值设为100％，以向巨噬细胞内的GBA的摄入量相对于对照的比来表示活性(相对于对照的％)。其结果是，GBA表达细胞的培养上清所得的GBA几乎未被摄入巨噬细胞内(图4:曲线2)，GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清所得的GBA被摄入巨噬细胞内(图4:曲线1)。此外，将GBA表达细胞的培养上清所得的GBA依次用唾液酸酶(新英格兰生物实验室公司)、β-1,4-半乳糖苷酶(新英格兰生物实验室公司)和β-N-乙酰葡糖胺酶(新英格兰生物实验室公司)进行处理而使糖链的非还原末端为甘露糖的GBA也与GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清所得的GBA同样，被摄入巨噬细胞内(图4:曲线3)。此外，在甘露糖的存在下，GBA向巨噬细胞的摄入被抑制(图4:曲线4～6)。
这些结果表示使用GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞表达的GBA在其糖链的非还原末端具有甘露糖，介以存在于巨噬细胞细胞膜上的甘露糖受体高效地被摄入细胞内。
[SfFDL和BmFDL表达质粒的构建]
分别化学合成为了用于CHO细胞而将编码优化了的来源于草地夜蛾的SfFDL基因和来源于蚕蛾的BmFDL基因。
SfFDL基因的碱基序列示于序列编号9，其编码的氨基酸序列示于序列编号10。序列编号9的碱基序列中，碱基1～6为MluⅠ位点，碱基14～1909为SfFDL编码序列，碱基1910～1917为NotⅠ位点。在这里，序列编号10的氨基酸序列为与序列编号9的碱基序列的编码区域对应的氨基酸序列，与通过天然的SfFDL基因编码的氨基酸序列相同。
此外，BmFDL基因的碱基序列示于序列编号11，其编码的氨基酸序列示于序列编号12。序列编号11的碱基序列中，碱基1～6为MluⅠ位点，碱基14～1909为BmFDL编码序列，碱基1910～1917为NotⅠ位点。在这里，序列编号12的氨基酸序列为与序列编号11的碱基序列的编码区域对应的氨基酸序列，与通过天然的BmFDL基因编码的氨基酸序列相同。
将上述的各基因用MluⅠ和NotⅠ进行消化，分别整合至用MluⅠ和NotⅠ消化了的pUC57载体中。接着，将SfFDL基因和BmFDL基因从pUC57载体用MluⅠ和Not Ⅰ切出，分别整合至如上构建的表达载体pE-hygr的MluⅠ与NotⅠ之间。将整合了SfFDL基因的pE-hygr称为SfFDL基因表达质粒(pE-hygr(Sf-FDL))，整合了BmFDL基因的pE-hygr称为BmFDL基因表达质粒(pE-hygr(Bm-FDL))。
[向GBA表达细胞的SfFDL和BmFDL基因的导入]
向GBA表达细胞中通过电穿孔法分别导入pE-hygr(Sf-FDL)或pE-hygr(Bm-FDL)后，将该细胞用含200μM潮霉素和500μg/mL G418的CD OptiCHO培养基进行选择培养，获得通过SfFDL基因和BmFDL基因转化的GBA表达细胞。
[基于菜豆凝集素(PHA-L4和PHA-E4)的选择培养]
将通过上述的选择培养得到的转化细胞用作为添加有12μg/mL的PHA-L4(日本油磨株式会社)和12μg/mL的PHA-E4(日本油磨株式会社)的培养基的CD OptiCHO培养基进行培养，从而使该转化细胞中表达复合型糖链的细胞死亡的同时使其凝集，回收非凝集细胞。对于回收的非凝集细胞，将通过SfFDL基因转化的细胞称为GBA/Sf-FDL表达细胞，通过BmFDL基因转化的细胞称为GBA/Bm-FDL表达细胞。
[基于SDS-PAGE的糖链结构的分析]
分别供给GBA表达细胞、GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞、GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清各约10μL至SDS-PAGE(10％凝胶)，电泳结束后通过简易蓝色安全染色(Simply Blue Safe Stain)(英杰公司)进行蛋白质染色。此外，菜豆凝集素处理前的基于GBA/AcGlcNAcase-3基因的转化细胞、基于GBA/Sf-FDL基因的转化细胞和基于GBA/Bm-FDL基因的转化细胞的培养上清也同时以相同的条件供于SDS-PAGE。
如果比较GBA的电泳图案，GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清所含的GBA的电泳图案与GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞一致(图5)。此外，菜豆凝集素处理前的基于GBA/Sf-FDL基因的转化细胞和基于GBA/Bm-FDL基因的转化细胞的培养上清所含的GBA的电泳图案也与GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞部分一致(未示出数据)。这些结果表示通过GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞表达的GBA与GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞同样，在糖链的非还原末端具有甘露糖。此外，这些结果表示导入至哺乳动物细胞的来源于草地夜蛾的SfFDL和来源于蚕蛾的BmFDL与来源于草地夜蛾的β-N-乙酰葡糖胺酶3同样，在高尔基体中显示其活性，起到在GBA的糖链修饰过程中除去位于非还原末端的N-乙酰葡糖胺而使糖链的非还原末端为甘露糖残基的酶的作用。即，该结果表示在哺乳动物细胞内表达的SfFDL和BmFDL在哺乳动物细胞内也定位于高尔基体的规定位置，发挥其酶活性。
[由GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清得到的葡糖脑苷脂酶的细胞内摄入量测定]
通过包括上述第一工序和第二工序的纯化方法，从GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清分别纯化GBA。对于这些经纯化的GBA，通过上述的方法实施使用巨噬细胞细胞株NR8383的GBA的细胞内摄入量测定。如图6所示，由GBA/Sf-FDL表达细胞的培养上清(曲线1)和GBA/Bm-FDL表达细胞的培养上清(曲线2)得到的GBA以与由GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞的培养上清(曲线3)得到的GBA几乎同样的水平被摄入至NR8383细胞内。此外，这些细胞内摄入效果通过向培养基中加入甘露聚糖被抑制(曲线4～6)。这些结果表示使用GBA/Sf-FDL表达细胞和GBA/Bm-FDL表达细胞表达的GBA与使用GBA/AcGlcNAcase-3表达细胞表达的GBA同样，在其糖链的非还原末端具有甘露糖，介以存在于巨噬细胞细胞膜上的甘露糖受体高效地被摄入细胞内。
产业上利用的可能性
如果采用本发明，则可使用哺乳动物细胞提供在N-糖苷键糖链的非还原末端具有甘露糖残基的重组体糖蛋白，所以可高效地、容易地制造例如用于溶酶体病的酶补充疗法的酶。
序列表自由内容
序列编号1:引物Hyg-Sfi
序列编号2:引物Hyg-BstX
序列编号3:引物GBA-Mlu
序列编号4:引物GBA-Not
序列编号5:引物N-AGase5'-Sal
序列编号6:引物N-AGase5'-Mlu
序列编号7:引物N-Agase3'-Mlu
序列编号8:引物N-Agase3'-Not
序列编号9:包含SfFDL编码序列的人工序列。碱基1-6:MluⅠ位点，碱基14-1909:SfFDL编码序列，碱基1910-1917:NotⅠ位点
序列编号10:合成结构
序列编号11:包含BmFDL编码序列的人工序列。碱基1-6:MluⅠ位点，碱基14-1909:BmFDL编码序列，碱基1910-1917:NotⅠ位点
序列编号12:合成结构
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Figure IDA00003043481900111

Claims (17)

1.转化哺乳动物细胞，其特征在于，导入有外源的β-N-乙酰葡糖胺酶基因并表达。
2.如权利要求1的转化哺乳动物细胞，其特征在于，通过导入该β-N-乙酰葡糖胺酶基因而表达的β-N-乙酰葡糖胺酶在高尔基体中显示其活性。
3.如权利要求1或2的转化哺乳动物细胞，其特征在于，该β-N-乙酰葡糖胺酶基因来源于昆虫。
4.如权利要求3的转化哺乳动物细胞，其特征在于，该昆虫是属于鳞翅目的昆虫。
5.如权利要求4的转化哺乳动物细胞，其特征在于，属于鳞翅目的该昆虫为草地夜蛾或蚕蛾。
6.如权利要求5的转化哺乳动物细胞，其特征在于，该β-N-乙酰葡糖胺酶基因为选自β-N-乙酰葡糖胺酶1基因、β-N-乙酰葡糖胺酶3基因、SfFDL基因和BmFDL基因的1种或2种以上。
7.如权利要求1～6中的任一项的转化哺乳动物细胞，其特征在于，进一步导入编码规定的糖蛋白的外源基因并表达，从而产生该规定的糖蛋白。
8.如权利要求7的转化哺乳动物细胞，其特征在于，编码该规定的糖蛋白的外源基因为来源于人的基因。
9.如权利要求8的转化哺乳动物细胞，其特征在于，来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。
10.如权利要求9的转化哺乳动物细胞，其特征在于，该溶酶体酶为选自葡糖脑苷脂酶、酸性神经鞘磷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性α-葡糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-甘露糖苷酶、唾液酸酶的酶。
11.如权利要求9的转化哺乳动物细胞，其特征在于，该溶酶体酶为葡糖脑苷脂酶。
12.位于N-糖苷键糖链的非还原末端的残基全部或一部分为甘露糖残基的糖蛋白的制造方法，其特征在于，包括：
(a)将权利要求1～6中的任一项的哺乳动物细胞在培养液中培养，使其表达糖蛋白的步骤；以及
(b)对通过上述步骤(a)表达的糖蛋白进行纯化的步骤。
13.如权利要求12的制造方法，其特征在于，使用权利要求7的哺乳动物细胞代替权利要求1～6中的任一项的哺乳动物细胞。
14.如权利要求13的制造方法，其特征在于，编码该糖蛋白的外源基因为来源于人的基因。
15.如权利要求14的制造方法，其特征在于，来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。
16.如权利要求15的制造方法，其特征在于，该溶酶体酶为选自葡糖脑苷脂酶、酸性神经鞘磷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性α-葡糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-甘露糖苷酶、唾液酸酶的酶。
17.如权利要求15的制造方法，其特征在于，该溶酶体酶为葡糖脑苷脂酶。
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