CN103153344A - 用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒 - Google Patents

用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN103153344A
CN103153344A CN201180032899XA CN201180032899A CN103153344A CN 103153344 A CN103153344 A CN 103153344A CN 201180032899X A CN201180032899X A CN 201180032899XA CN 201180032899 A CN201180032899 A CN 201180032899A CN 103153344 A CN103153344 A CN 103153344A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
amino acid
salp
aminoacid sequence
acid residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201180032899XA
Other languages
English (en)
Inventor
菲利普·克里内
皮埃尔·莱昂纳多
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Credit Holdings Pte. Ltd.
UPS Pharmaceutical Holdings Ltd.
Original Assignee
Alexion Pharma International SARL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alexion Pharma International SARL filed Critical Alexion Pharma International SARL
Publication of CN103153344A publication Critical patent/CN103153344A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了用于治疗基质矿化障碍如低磷酸酯酶症的方法、组合物、和试剂盒。具体地，本发明提供了具有融合于免疫球蛋白的Fc域的可溶性碱性磷酸酶的多肽。例如，可以将上述多肽皮下给予患者，以利用酶替代疗法来治疗低磷酸酯酶症。本发明还涉及编码上述多肽的核酸以及上述核酸用于治疗基质矿化障碍的应用。

Description

用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒
背景技术
本发明涉及基质矿化障碍如低磷酸酯酶症(HPP)的治疗。HPP是由在ALPL基因中的一个或多个功能缺去突变所引起的罕见的遗传性疾病，上述基因编码组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP；a.k.a骨/肝/肾型ALP)。在成骨细胞和软骨细胞中的碱性磷酸酶缺乏会损害骨骼矿化，从而导致佝偻病或骨软化。HPP的严重性取决于它的发作年龄。围产期HPP，HPP的最严重形式，导致在子宫内几乎完全没有骨矿化并且可以引起死产(死胎)。婴儿HPP，在6个月的年龄以前诊断的，导致骨骼矿化的受损，其可以导致骨折和畸形。童年期HPP可以引起乳牙的过早缺失和佝偻病。最后，成年HPP可以引起应力骨折以及关节炎和焦磷酸盐关节病的发作。
鉴于基质矿化障碍如HPP对受影响患者，尤其是婴儿和儿童的可怕的近期和长期影响，所以需要开发用于治疗基质矿化障碍的方法和组合物。
发明内容
在本发明中，已经令人惊奇地发现，在HPP小鼠模型中，缺乏聚天冬氨酸或聚谷氨酸区的碱性磷酸酶-Fc融合蛋白可以有效地治疗HPP。因此，本发明提供了包含sALP-Fc或Fc-sALP多肽的组合物和包含编码sALP-Fc或Fc-sALP多肽的核酸的组合物。本发明还提供了方法和试剂盒，用于利用上述多肽和核酸来治疗基质矿化障碍如HPP和它的相关的表型。
因此，在一个方面，本发明提供了用于治疗主体的基质矿化障碍的方法，该方法包括给予主体治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：(a)多肽，其包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；以及(b)药用赋形剂，其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及多肽并不包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含：(a)多肽，该多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；和(b)药用赋形剂，其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及多肽并不包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
在又一个方面，本发明提供了用于治疗主体的基质矿化障碍的方法，该方法包括给予主体治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：(a)编码多肽的分离的核酸，上述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；和(b)药用赋形剂，其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及分离的核酸并不编码包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其配制用于治疗主体的基质矿化障碍，上述药物组合物包含：(a)编码多肽的分离的核酸，上述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；和(b)药用赋形剂，其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及分离的核酸并不编码包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区的氨基酸序列。
在本发明的任何实施方式中，多肽可以可选地包含结构Z-sALP-Y-Fc-X。
在任何实施方式中，多肽可选地并不包含长于两个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
在任何实施方式中，多肽可选地并不包含骨靶向部分。
在任何实施方式中，sALP的氨基酸序列可选地包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸残基23-508组成。例如，sALP的氨基酸序列可选地包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸残基23-512组成。
在任何实施方式中，sALP的氨基酸序列可选地包括或由SEQ ID NO：16的氨基酸残基18-498组成。例如，sALP的氨基酸序列可以可选地包括或由SEQ ID NO：16的氨基酸残基18-502组成。
在任何实施方式中，sALP的氨基酸序列可选地包括与SEQ ID NO：5具有至少85％(例如，至少95％或99％)序列同一性的氨基酸序列。例如，sALP的氨基酸序列可选地包括SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5组成。
在任何实施方式中，Fc可以可选地包括CH2域、CH3域和铰链区。例如，Fc可选地是免疫球蛋白的恒定域，和述免疫球蛋白选自由IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3和IgG-4组成的组。在特定的实施方式中，免疫球蛋白是IgG-1。在其它特定的实施方式中，Fc包括与SEQ ID NO：3具有至少85％(例如，至少95％或99％)序列同一性的氨基酸序列。例如，Fc的氨基酸序列可选地包括SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成。
在任何实施方式中，Z可选地不存在。
在任何实施方式中，Y可选地为两个氨基酸残基(例如，亮氨酸-赖氨酸)。
在任何实施方式中，X可选地不存在。
在任何实施方式中，Z和X可以均不存在，以及Y可以不存在或可以是至少一个氨基酸的氨基酸序列。例如，多肽可以由结构sALP-Y-Fc或结构Fc-Y-sALP组成。在多肽由结构sALP-Y-Fc或Fc-Y-sALP组成的一些实施方式中，Y可以由两个氨基酸残基(例如，亮氨酸-赖氨酸)组成。例如，多肽可以由结构sALP-Y-Fc组成。可选地，sALP的氨基酸序列是SEQ ID NO：5的氨基酸序列，Y的氨基酸序列是亮氨酸-赖氨酸，和/或Fc的氨基酸序列是SEQ ID NO：3的氨基酸序列。例如，多肽的氨基酸序列可以由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
在任何实施方式中，多肽的氨基酸序列可选地包括与SEQ ID NO：4具有至少85％(例如，至少95％或99％)序列同一性的氨基酸序列。例如，多肽的氨基酸序列可以可选地包括SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成。
在任何实施方式中，多肽可选地被聚乙二醇化或糖基化。
在任何实施方式中，药物组合物可选地包括多肽的二聚物。
在任何实施方式中，药用赋形剂可选地包括盐水。
在任何实施方式中，可选地冷冻干燥药物组合物。
在本发明的任何方法中，可选地通过皮下、静脉内、口服、鼻、肌内、舌下、鞘内、或皮内途径来给予药物组合物。在某些实施方式中，皮下给予药物组合物。例如，本发明的方法可以可选地包括以约0.5mg/kg/天至约10mg/kg/天(例如，约2mg/kg/天至约3mg/kg/天)的剂量将包含本发明的多肽的药物组合物给予主体。在其它实施例中，上述方法包括将药物组合物给予主体，一周一次至七次(例如，一周三次)。
在本发明的任何方法中，基质矿化障碍可选地为低磷酸酯酶症(例如，婴儿HPP、童年期HPP、围产期HPP、成年HPP、或牙齿型低碱性磷酸酯酶症)。
在本发明的任何方法中，可选地以治疗有效量给予药物组合物以治疗HPP表型，其选自由HPP相关的癫痫发作、乳牙的过早缺失、不完全骨矿化、无机焦磷酸盐(PPi)的升高的血和/或尿水平、磷酸乙醇胺(PEA)的升高的血和/或尿水平、吡哆醛5′-磷酸(PLP)的升高的血和/或尿水平、不适当的体重增加、佝偻病、骨痛、焦磷酸钙二水合物晶体沉积、不发育、发育不全、和牙骨质的发育不良组成的组。在一些实施方式中，不完全骨矿化是不完全股骨矿化、不完全胫骨矿化、不完全跖骨矿化、或不完全肋骨矿化。
在任何实施方式中，主体可以是人。
可以可选地配制本发明的任何药物组合物，用于治疗主体的基质矿化障碍。
在本发明的特点为给予分离的核酸的任何方法中，可选地用慢病毒载体将分离的核酸给予主体。在一些实施方式中，可选地以约0.1mg至约10mg的剂量将分离的核酸给予主体。
本发明的特点在于分离的核酸的任何药物组合物可以可选地包括包含分离的核酸的重组表达载体(例如，慢病毒载体)。
本发明还提供了用上述载体转化或转染的分离的重组宿主细胞。
本发明还提供了用于产生本发明的任何多肽的方法，该方法包括在培养基中在适合于进行多肽的表示的条件下培养上述宿主细胞以及从培养基回收多肽。例如，宿主细胞可选地为L细胞、C127细胞、3T3细胞、CHO细胞、BHK细胞、或COS-7细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是CHO细胞(例如，CHO-DG44细胞)。
本发明还提供了试剂盒。例如，本发明提供了一种试剂盒，其包括：(a)本发明的任何药物组合物和(b)将所述药物组合物给予主体以治疗基质矿化障碍的说明书。
“约”是指列举值的±10％。
“骨靶向部分”是指长度为6至20个氨基酸残基的氨基酸序列，其对于骨基质具有足够的亲和力以致骨靶向部分与骨基质具有至少10-6M或更好(例如，10-7M、10-8M、10-9M、或更好)的体内结合亲和力。
“Fc”是指免疫球蛋白(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3或IgG-4)的片段可结晶区，包括免疫球蛋白重链的CH2和CH3域。Fc还可以包括连接Fab和Fc区的铰链区的任何部分。Fc可以来自任何哺乳动物(包括人)，并且可以是翻译后修饰的(例如，通过糖基化)。在一个非限制性的实施例中，Fc可以是人IgG-1的片段可结晶区，其具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
“基质矿化障碍”是指影响骨基质的矿化的病症或与病症相关的任何表型。基质矿化障碍和它们的相关的表型包括，例如，佝偻病(生长板软骨的缺损)、骨软化、成骨不全、严重的骨质疏松症、和低磷酸酯酶症(HPP)(例如，婴儿HPP、童年期HPP、围产期HPP、成年HPP、或牙齿型低碱性磷酸酯酶症)、HPP相关的癫痫发作、乳牙的过早缺失、不完全骨矿化、无机焦磷酸盐(PPi)的升高的血和/或尿水平、磷酸乙醇胺(PEA)的升高的血和/或尿水平、吡哆醛5′-磷酸(PLP)的升高的血和/或尿水平、不适当的体重增加、骨痛、焦磷酸钙二水合物(CPPD)晶体沉积、和牙骨质的不发育、发育不全或发育不良。例如，通过生长迟缓，如长骨长度(如股骨、胫骨、肱骨、桡骨、尺骨)的减小、总骨的平均密度的减小和在骨如股骨、胫骨、肋骨和跖骨、以及指骨中骨矿化的减少、牙矿化的减少、和乳牙的过早缺失(例如，牙骨质的不发育、发育不全或发育不良)，可以诊断基质矿化障碍。没有被如此限制，可以通过以下一种或多种来观测基质矿化障碍的治疗：长骨长度的增加、在骨和/或牙中矿化的增加、弓形腿的矫正、骨痛的降低和在关节中CPPD晶体沉积的减少。
“药物组合物”是指这样的组合物，其包含本文描述的多肽或核酸，用药用赋形剂加以配制，并在得到政府监管机构的批准的情况下加以制造或出售，作为用于治疗哺乳动物的疾病的治疗方案的一部分。可以配制药物组合物，例如，用于单位剂型的口服给予(例如，片剂、胶囊剂、胶囊形片剂、软胶囊、或糖浆剂)；用于外用(例如，作为乳膏剂、凝胶剂、洗剂、或软膏剂)；用于静脉内给予(例如，作为没有颗粒栓塞并在适用于静脉内使用的溶剂***中的无菌溶液)；用于皮下给予；或配方描述的任何其它剂型。
“药用赋形剂”是指这样的载体，其对于接受治疗的主体来说是生理上可接受的，同时保留和它一起给予的化合物的治疗性能。一种示例性的药用赋形剂是生理盐水。其它生理上可接受的赋形剂和其它剂型是本领域技术人员已知的并且描述于，例如，“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”(20th ed.，ed.A.R.Gennaro，2000，Lippincott Williams &Wilkins)。
“多肽”是指长度为至少两个氨基酸的氨基酸的任何天然或合成链，并且包括那些具有翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的氨基酸的任何天然或合成链。如在本文中所使用的，当多肽或核酸序列被称作相对于参比序列具有“至少X％序列同一性”时，它是指，当最佳对齐序列时，在多肽或核酸中的至少X％的氨基酸或核苷酸相同于参比序列的那些氨基酸或核苷酸。可以用本领域中已知的各种方式来确定最佳序列对比，例如，SmithWaterman序列对比算法(Smith et al.，J.Mol.Biol.147：195-7，1981)和BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-10，1990)。利用公开可用的计算机软件可以访问这些和其它序列对比算法，如“Best Fit”(Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics，482-489，1981)，如合并到GeneMatcher PlusTM(Schwarz and Dayhof，Atlas ofProtein Sequence and Structure，Dayhoff，M.O.，Ed pp 353-358，1979)、BLAST、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、或Megalign(DNASTAR)。另外，本领域技术人员可以确定用于测量序列对比的适当参数，包括为在待比较的序列长度上实现最佳序列对比所需要的任何算法。通常，对于多肽，比较序列的长度可以为至少5个氨基酸，优选10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、或更多个氨基酸，高达多肽的整个长度。对于核酸，比较序列的长度可以通常为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、或更多个核苷酸，高达核酸分子的整个长度。应当明了，当比较DNA序列与RNA序列时，为了确定序列同一性，胸腺嘧啶核苷酸相当于尿嘧啶核苷酸。
术语“sALP”、“可溶性碱性磷酸酶”、和“碱性磷酸酶的胞外域”可互换使用并且是指可溶性的、非膜结合的碱性磷酸酶，或其域、生物活性片段、或生物活性变体。sALP包括，例如，缺乏C端GPI信号序列的碱性磷酸酶，例如，包括或由人TNALP(SEQ ID NO：6)的氨基酸18-502组成的多肽。sALP进一步包括，例如，人TNALP的哺乳动物直系同源物的可溶性的、非膜结合形式(例如，这样的多肽，其包括或组成自SEQ ID NO：7的氨基酸16-502或18-502、SEQ ID NO：8的氨基酸18-502、SEQ ID NO：9的氨基酸18-502、SEQ ID NO：10的氨基酸18-502、或SEQ ID NO：11的氨基酸)、人IALP、GCALP、和PLALP的可溶性的、非膜结合形式(例如，这样的多肽，其包括或组成自SEQ ID NO：12的氨基酸20-503、SEQ ID NO：13的氨基酸20-503、或SEQ ID NO：14的氨基酸23-506)、以及其另外的变体和类似物，其保留碱性磷酸酶活性，例如，水解PPi的能力。
“主体”是指任何哺乳动物，例如，人。
“治疗有效量”是指本发明的核酸或多肽的量，其足以显著治疗、预防、延缓、抑制、或阻止基质矿化障碍的任何症状。本发明的化合物的治疗有效量可以取决于基质矿化障碍的严重性以及主体的条件、体重和一般状态，并且可以由普通技术人员考虑到上述因素来确定。可以以单剂量或以在一段时间内给予的多剂量，将本发明的化合物的治疗有效量给予哺乳动物。
“治疗”是指为了预防和/或治疗的目的给予药物组合物。“预防疾病”是指主体的预防性治疗，其中主体尚未生病，但易患、或具有特定疾病的风险。“治疗疾病”或用于“治疗性治疗”是指对已患有疾病的主体进行治疗以改善或稳定主体的病症。因此，在权利要求和实施方式中，用于治疗或预防的目的，对主体进行治疗。
附图说明
图1示出本发明的多肽的示意图。(a)人组织非特异性碱性磷酸酶基因(hTNALP)的完全初级翻译产物，包括N端信号肽和用于GPI加成的瞬时膜锚定信号。(b)hsTNALP-Fc融合蛋白的初级翻译产物。(c)分泌的hsTNALP-Fc，其缺乏N端信号肽。
图2示出hsTNALP-Fc(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，包括N端信号肽(开始的17个氨基酸残基，下划线和斜体的；位置2，缬氨酸，不同于在上述位置处的野生型残基，异亮氨酸)。多肽(SEQ ID NO：2)的hsTNALP部分的氨基酸，其对应于hTNALP(SEQ ID NO：6)的氨基酸1-502，除了如上所述的位置2以外，是斜体。此多肽(SEQ ID NO：3)的Fc部分带下划线。以粗体示出在hsTNALP和Fc部分之间的两个氨基酸亮氨酸-赖氨酸接头。
图3示出分泌的hsTNALP-Fc(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列，其缺乏N端信号肽。多肽(SEQ ID NO：5)的hsTNALP部分的氨基酸，其对应于hTNALP的氨基酸18-502，为斜体。此多肽(SEQ ID NO：3)的Fc部分带下划线。以粗体示出在hsTNALP和Fc部分之间的两个氨基酸亮氨酸-赖氨酸接头。
图4(a)-(d)示出哺乳动物TNALP直系同源物和人ALP同工酶的CLUSTALTM W(1.82)多序列对比。哺乳动物TNALP直系同源物包括人TNALP(“sp|P05186|TNALP_HUMAN”；登录号P05186；SEQ ID NO：6)、牛TNALP(“sp|P09487|TNALP_BOVINE”；登录号P09487；SEQ ID NO：7)；猫TNALP(“sp|Q29486|TNALP_FELCA”；登录号Q29486；SEQ ID NO：8)、小鼠TNALP(“sp|P09242|TNALP_MOUSE”；登录号P09242；SEQ ID NO：9)、大鼠TNALP(“sp|P08289|TNALP_RAT”；登录号P08289；SEQ ID NO：10)、和狗TNALP(“tr|Q9N0V0|TNALP_CANFA”；登录号Q9N0V0；SEQ IDNO：11)的部分序列。人ALP同工酶包括人IALP(“sp|P09923|IALP_HUMAN”；登录号P09923；SEQ ID NO：12)、人GCALP(“sp|P10696|GCALP_HUMAN”；登录号P10696；SEQ ID NO：13)、和人PLALP(“sp|P05187|PLALP_HUMAN”；登录号05187；SEQ ID NO：14)。″*″表示在该列中的残基在对比的所有序列中是相同的，″：″表示观测到保守替代，以及″.″则表示观测到半保守替代。共有序列源自此对比(“Consensus”；SEQ ID NO：15)，其中X表示简并位置。
图5(a)-(c)示出哺乳动物TNALP直系同源物的CLUSTALTM W(1.82)多序列对比，包括人TNALP(“sp|P05186|TNALP_HUMAN”；登录号P05186；SEQ ID NO：6)、牛TNALP(“sp|P09487|TNALP_BOVINE”；登录号P09487；SEQ ID NO：7)；猫TNALP(“sp|Q29486|TNALP_FELCA”；登录号Q29486；SEQ ID NO：8)、小鼠TNALP(“sp|P09242|TNALP_MOUSE”；登录号P09242；SEQ ID NO：9)、大鼠TNALP(“sp|P08289|TNALP_RAT”；登录号P08289；SEQ ID NO：10)、和狗TNALP(“tr|Q9N0V0|TNALP_CANFA”；登录号Q9N0V0；SEQ ID NO：11)的部分序列。″*″表示在该列中的残基在对比的所有序列中是相同的，″：″表示观测到保守替代，以及″.″则表示观测到半保守替代。共有序列源自此对比(“Consensus”；SEQ ID NO：16)，其中X表示简并位置。
图6示出编码图2所示的hsTNALP-Fc多肽的核酸序列(SEQ ID NO：17)。
图7示出在单剂量IV和SC给予(a)sALP和(b)sALP-Fc以后在血清中的平均(±SD)浓度分布。
图8示出接受载体或不断提高剂量的sALP-Fc(即，Tx-1、Tx-3、和Tx-6)的Akp2-/-小鼠的(a)百分比生存和(b)中位生存。
图9示出体重随年龄的变化，作为治疗剂量的函数。从研究的第一天至结束，用载体、Tx-1、Tx-3、Tx-6治疗的Akp2-/-小鼠或未经处理的WT小鼠的平均每天体重。
图10示出作为治疗剂量的函数的胫骨/股骨长度。和WT相比，在研究结束时，使用两种治疗剂量的左胫骨和股骨的个体长度。
图11示出在Akp2-/-和正常小鼠中代表性的左脚(放射造影放大3X)、肋廓(放射造影放大(2X)、和右下肢样品(放射造影放大2X)的放射照片。
图12示出相对于脚的矿化改善，作为sALP-Fc剂量的函数的正常个体的百分比。
具体实施方式
本发明涉及融合于Fc的可溶性碱性磷酸酶(sALP)，编码上述酶的核酸，以及它们应用于治疗基质矿化障碍如低磷酸酯酶症。下文提供了本发明的另外的细节。
碱性磷酸酶
碱性磷酸酶包括一组酶，其共享在多种情况下能够切割磷酸盐的能力(例如，焦磷酸盐，PPi，的水解)。存在四种已知的哺乳动物碱性磷酸酶(ALP)同工酶：组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP；下文进一步描述)、胎盘碱性磷酸酶(PLALP)(例如，登录号P05187、NP_112603、和NP_001623)、生殖细胞碱性磷酸酶(GCALP)(例如，登录号P10696)、和肠碱性磷酸酶(IALP)(例如，登录号P09923和NP_001622)。这些同工酶具有非常类似的三维结构。它们的催化部位各自包含四个金属结合域，其结合于酶活性所必要的金属离子，包括两个锌离子和一个镁离子。在有高浓度磷酸盐受体存在的条件下，这些酶催化磷酸的单酯的水解并且还催化磷酸根转移反应。已表明，相对于磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)、和吡哆醛5′-磷酸(PLP)，PALP是生理活性的，所有上述三种是TNALP的天然底物(Whyte，1995)。这些同工酶之间的序列对比示于图4(a)-4(d)。另外的碱性磷酸酶描述于，例如，WO 2008/138131和美国公开号2006/0014687，其以引用方式结合于本文。
组织非特异性磷酸酶是蛋白质的家族，由单基因加以编码，其彼此不同于翻译后修饰。TNALP主要存在于肝脏、肾脏、和骨中，但可以出现在整个身体中。在哺乳动物中，除本文提供的其它实例以外，已知的TNALP还包括，例如，人TNALP(登录号NP-000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289、和AAI26166)；恒河猴TNALP(登录号XP-001109717)；大鼠TNALP(登录号NP_037191)；狗TNALP(登录号AAF64516)；猪TNALP(登录号AAN64273)、小鼠(登录号NP_031457)、牛TNALP(登录号NP_789828、NP_776412、AAM 8209、AAC33858)、和猫TNALP(登录号NP_001036028)。
可溶性碱性磷酸酶
本发明的可溶性碱性磷酸酶(sALP)包括，例如，本文描述的任何碱性磷酸酶的可溶性(例如，胞外或非膜结合)形式。本发明的可溶性碱性磷酸酶可以是，例如，人TNALP的可溶性形式。图1示出人TNALP(hTNALP)的域的示意图。TNALP是通过结合于它的C端的糖脂锚定的膜结合蛋白(Swiss-Prot，P05186)。在除去疏水性C端以后，翻译后添加这种糖脂锚(GPI)，其用作临时膜锚和用作用于GPI的添加的信号。这种GPI锚被隐蔽在细胞膜中，而蛋白质的其余部分则是在胞外。TNALP，包括hTNALP，可以加以设计，以用终止密码子替换疏水性C端序列的第一氨基酸(丙氨酸)。如此形成的工程hTNALP包含TNALP的天然锚定形式的所有氨基酸，但缺乏GPI膜锚。可溶性的hTNALP在本文中称作“hsTNALP”。本领域技术人员将明了，GPI膜锚的位置在不同的碱性磷酸酶中将不同，并且在多肽的C端可以包括，例如，最后的10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、45、50、或更多氨基酸残基。例如，SEQ ID NO：6的hTNALP的GPI膜锚是氨基酸503-524。图2示出这种hsTNALP的氨基酸序列(在位置2处具有一种变异)，作为融合于Fc。图6示出编码这种hsTNALP-Fc融合多肽的核酸的序列。
除C端GPI锚以外，TNALP还具有N端信号肽序列。当被合成时，N端信号肽最初出现在蛋白质上，但在易位到ER以后被切割。因此，在TNALP的分泌形式中未见到N端信号肽。本发明的sALP包括其分泌的(即，缺乏N端信号)和非分泌的(即，具有N端信号)形式。本领域技术人员将明了，在不同的碱性磷酸酶中，N端信号肽的位置将不同，并且在多肽的N端上可以包括，例如，最初的5、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、或更多氨基酸残基。例如，SEQ ID NO：6的hTNALP的N端信号肽是它的最初的17个氨基酸。因此，这种hTNALP的分泌的、可溶性形式是SEQ ID NO：6(SEQ ID NO：5)的氨基酸18-502。图3示出这种分泌的hsTNALP的氨基酸序列，作为融合于Fc。本发明的sALP包括其分泌的和非分泌的形式。本领域技术人员可以预测信号序列切割位点的位置，例如，通过适当的计算机算法如描述于Bendtsen et al.(J.Mol.Biol.340(4)：783-795，2004)并可获自网址http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的计算机算法。
本发明的sALP还包括，例如，多肽序列，其满足源自人ALP同工酶和哺乳动物TNALP直系同源物(人、小鼠、大鼠、牛、猫、和狗)的ALP胞外域的共有序列(SEQ ID NO：15)、或只源自人ALP同工酶的ALP胞外域的共有序列(SEQ ID NO：16)。本发明的sALP还包括那些多肽序列，其满足源自这些TNALP直系同源物或人ALP同工酶的各种组合的类似的共有序列。这样的共有序列可以参见，例如，WO 2008/138131，其以引用方式结合于本文。
另外，已表明，保留原有的氨基酸1至501(18至501，当为分泌的时)(Oda et al.，J.Biochem 126：694-699，1999)、氨基酸1至502(18至502，当为分泌的时)(WO 2008/138131)、氨基酸1至504(18至504，当为分泌的时)(US 6,905,689，其以引用方式结合于本文)和氨基酸1至505(18-505，当为分泌的时)(US 2007/0081984，其以引用方式结合于本文)的重组hsTNALP是酶促活性的。这表明，某些氨基酸残基可以截短自可溶性hsTNALP多肽和C端而不影响它的酶活性。这还表明，GPI膜锚的某些氨基酸残基，当存在时，并不显著影响多肽的可溶性。因此，本发明的sALP还包括那些sALP，其中，在其C端，例如，多达5个(例如，1、2、3、4、或5个)氨基酸残基被截短，和那些sALP，其中，例如，GPI膜锚的多达5个(例如，1、2、3、4、或5个)氨基酸残基是存在的。例如，本发明的非分泌的sALP包括那些sALP，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸残基1-497、1-498、1-499、1-500、1-501、1-502、1-503、1-504、1-505、1-506或1-507，以及其变体，其中在位置2处的氨基酸是缬氨酸，以及本发明的分泌的sALP包括那些sALP，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸残基18-497、18-498、18-499、18-500、18-501、18-502、18-503、18-504、18-505、18-506、或18-507。
本领域技术人员将明了，在酶的氨基酸序列中的许多突变将不会显著破坏酶的催化功能。在一些情况下，在治疗基质矿化障碍的范围内，某种突变甚至可以有利于酶的催化功能。因此，本发明的sALP不仅包括上述碱性磷酸酶的野生型序列，而且包括相对于这些碱性磷酸酶具有至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大)序列同一性的任何多肽。然而，已知，在TNALP中的特定突变会引起HPP。上述致病突变优选不存在于本发明的sALP中。以下列出上述突变的实例。
尤其是，本发明的sALP，利用SEQ ID NO：15的共有序列的编号，在位置处22的氨基酸不是苯丙氨酸残基；在位置33(在没有信号肽的序列中的位置11)处的氨基酸不是半胱氨酸残基；在位置38(在没有信号肽的序列中的位置16)处的氨基酸不是缬氨酸残基；在位置42(在没有信号肽的序列中的位置20)处的氨基酸不是脯氨酸残基；在位置45(在没有信号肽的序列中的位置23)处的氨基酸不是缬氨酸残基；在位置56(在没有信号肽的序列中的位置34)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置67(在没有信号肽的序列中的位置45)处的氨基酸残基不是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸残基；在位置68(在没有信号肽的序列中的位置46)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置73(在没有信号肽的序列中的位置51)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置76(在没有信号肽的序列中的位置54)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸或组氨酸残基；在位置77(在没有信号肽的序列中的位置55)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置80(在没有信号肽的序列中的位置58)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置81(在没有信号肽的序列中的位置59)处的氨基酸残基不是天冬酰胺残基；在位置105(在没有信号肽的序列中的位置83)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置113(在没有信号肽的序列中的位置89)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置116(在没有信号肽的序列中的位置94)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置117(在没有信号肽的序列中的位置95)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置119(在没有信号肽的序列中的位置97)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置121(在没有信号肽的序列中的位置99)处的氨基酸残基不是丝氨酸或苏氨酸残基；在位置125(在没有信号肽的序列中的位置103)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置128(在没有信号肽的序列中的位置106)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置133(在没有信号肽的序列中的位置111)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置134(在没有信号肽的序列中的位置112)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置137(在没有信号肽的序列中的位置115)处的氨基酸残基不是苏氨酸或缬氨酸残基；在位置139(在没有信号肽的序列中的位置117)处的氨基酸残基不是组氨酸或天冬酰胺残基；在位置141(在没有信号肽的序列中的位置119)处的氨基酸残基不是组氨酸残基；在位置153(在没有信号肽的序列中的位置131)处的氨基酸残基不是丙氨酸或异亮氨酸残基；在位置167(在没有信号肽的序列中的位置145)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置172(在没有信号肽的序列中的位置150)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置175(在没有信号肽的序列中的位置153)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置176(在没有信号肽的序列中的位置154)处的氨基酸残基不是酪氨酸或精氨酸残基；在位置181(在没有信号肽的序列中的位置159)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置182(在没有信号肽的序列中的位置160)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置184(在没有信号肽的序列中的位置162)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置186(在没有信号肽的序列中的位置164)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置189(在没有信号肽的序列中的位置167)处的氨基酸残基不是色氨酸残基；在位置194(在没有信号肽的序列中的位置172)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置196(在没有信号肽的序列中的位置174)处的氨基酸残基不是赖氨酸或甘氨酸残基；在位置197(在没有信号肽的序列中的位置175)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置198(在没有信号肽的序列中的位置176)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置206(在没有信号肽的序列中的位置184)处的氨基酸残基不是酪氨酸残基；在位置208(在没有信号肽的序列中的位置186)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置207(在没有信号肽的序列中的位置190)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置216(在没有信号肽的序列中的位置194)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置217(在没有信号肽的序列中的位置195)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；在位置223(在没有信号肽的序列中的位置201)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置225(在没有信号肽的序列中的位置203)处的氨基酸残基不是缬氨酸或丙氨酸残基；在位置226(在没有信号肽的序列中的位置204)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置228(在没有信号肽的序列中的位置206)处的氨基酸残基不是色氨酸或谷氨酰胺残基；在位置229(在没有信号肽的序列中的位置207)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置231(在没有信号肽的序列中的位置209)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置240(在没有信号肽的序列中的位置218)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置251(在没有信号肽的序列中的位置229)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置254(在没有信号肽的序列中的位置232)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置269(在没有信号肽的序列中的位置247)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置277(在没有信号肽的序列中的位置255)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、亮氨酸或组氨酸残基；在位置280(在没有信号肽的序列中的位置258)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置295(在没有信号肽的序列中的位置273)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；在位置297(在没有信号肽的序列中的位置275)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置298(在没有信号肽的序列中位置276的)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置300(在没有信号肽的序列中的位置278)处的氨基酸残基不是酪氨酸或丙氨酸残基；在位置301(在没有信号肽的序列中的位置279)处的氨基酸残基不是缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸残基；在位置303(在没有信号肽的序列中的位置281)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置304(在没有信号肽的序列中的位置282)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置305(在没有信号肽的序列中的位置283)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置312(在没有信号肽的序列中的位置290)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置313(在没有信号肽的序列中的位置291)处的氨基酸残基不是丝氨酸或亮氨酸残基；在位置317(在没有信号肽的序列中的位置295)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置332(在没有信号肽的序列中的位置310)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置333(在没有信号肽的序列中的位置311)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、甘氨酸或亮氨酸残基；在位置334(在没有信号肽的序列中的位置312)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置340(在没有信号肽的序列中的位置318)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置345(在没有信号肽的序列中的位置323)处的氨基酸残基不是精氨酸或谷氨酸残基；在位置354(在没有信号肽的序列中的位置332)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置360(在没有信号肽的序列中的位置338)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置361(在没有信号肽的序列中的位置339)处的氨基酸残基不是苏氨酸或异亮氨酸残基；在位置377(在没有信号肽的序列中的位置355)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置380(在没有信号肽的序列中的位置358)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置383(在没有信号肽的序列中的位置361)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置384(在没有信号肽的序列中的位置362)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置387(在没有信号肽的序列中的位置365)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置388(在没有信号肽的序列中的位置366)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置395(在没有信号肽的序列中的位置373)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置397(在没有信号肽的序列中的位置375)处的氨基酸残基不是半胱氨酸或组氨酸残基；在位置398(在没有信号肽的序列中的位置376)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置401(在没有信号肽的序列中的位置379)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置405(在没有信号肽的序列中的位置383)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置406(在没有信号肽的序列中的位置384)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置412(在没有信号肽的序列中的位置390)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置416(在没有信号肽的序列中的位置394)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置417(在没有信号肽的序列中的位置395)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置420(在没有信号肽的序列中的位置398)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置423(在没有信号肽的序列中的位置401)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置426(在没有信号肽的序列中的位置404)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置429(在没有信号肽的序列中的位置407)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置430(在没有信号肽的序列中的位置408)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置432(在没有信号肽的序列中的位置410)处的氨基酸残基不是半胱氨酸或天冬氨酸残基；在位置434(在没有信号肽的序列中的位置412)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置435(在没有信号肽的序列中的位置413)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置442(在没有信号肽的序列中的位置420)处的氨基酸残基不是组氨酸残基；在位置451(在没有信号肽的序列中的位置429)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置456(在没有信号肽的序列中的位置434)处的氨基酸残基不是组氨酸或半胱氨酸残基；在位置458(在没有信号肽的序列中的位置436)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置460(在没有信号肽的序列中的位置438)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置461(在没有信号肽的序列中的位置439)处的氨基酸残基不是丝氨酸或天冬氨酸残基；在位置462(在没有信号肽的序列中的位置440)处的氨基酸残基不是色氨酸或精氨酸残基；在位置465(在没有信号肽的序列中的位置443)处的氨基酸残基不是蛋氨酸或亮氨酸残基；在位置472(在没有信号肽的序列中的位置450)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置473(在没有信号肽的序列中的位置451)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置474(在没有信号肽的序列中的位置452)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置479(在没有信号肽的序列中的位置457)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置482(在没有信号肽的序列中的位置460)处的氨基酸残基不是赖氨酸或甘氨酸残基；在位置484(在没有信号肽的序列中的位置462)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置495(在没有信号肽的序列中的位置473)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置496(在没有信号肽的序列中的位置474)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；以及在位置497(在没有信号肽的序列中的位置475)处的氨基酸残基不是精氨酸残基。
另外更具体地，当sTNALP用于本发明的骨靶向sALP中时，利用人TNALP序列的编号，在位置17处的氨基酸不是苯丙氨酸残基；在位置28(在没有信号肽的序列中的位置11)处的氨基酸不是半胱氨酸残基；在位置33(在没有信号肽的序列中的位置16)处的氨基酸不是缬氨酸残基；在位置37(在没有信号肽的序列中的位置20)处的氨基酸不是脯氨酸残基；在位置40(在没有信号肽的序列中的位置23)处的氨基酸不是缬氨酸残基；在位置51(在没有信号肽的序列中的位置34)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置62(在没有信号肽的序列中的位置45)处的氨基酸残基不是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸残基；在位置63(在没有信号肽的序列中的位置46)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置68(在没有信号肽的序列中的位置51)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置71(在没有信号肽的序列中的位置54)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸或组氨酸残基；在位置72(在没有信号肽的序列中的位置55)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置75(在没有信号肽的序列中的位置58)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置76(在没有信号肽的序列中的位置59)处的氨基酸残基不是天冬酰胺残基；在位置100(在没有信号肽的序列中的位置83)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置108(在没有信号肽的序列中的位置89)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置111(在没有信号肽的序列中的位置94)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置112(在没有信号肽的序列中的位置95)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置114(在没有信号肽的序列中的位置97)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置116(在没有信号肽的序列中的位置99)处的氨基酸残基不是丝氨酸或苏氨酸残基；在位置120(在没有信号肽的序列中的位置103)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置123(在没有信号肽的序列中的位置106)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置128(在没有信号肽的序列中的位置111)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置129(在没有信号肽的序列中的位置112)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置132(在没有信号肽的序列中的位置115)处的氨基酸残基不是苏氨酸或缬氨酸残基；在位置134(在没有信号肽的序列中的位置117)处的氨基酸残基不是组氨酸或天冬酰胺残基；在位置136(在没有信号肽的序列中的位置119)处的氨基酸残基不是组氨酸残基；在位置148(在没有信号肽的序列中的位置131)处的氨基酸残基不是丙氨酸或异亮氨酸残基；在位置162(在没有信号肽的序列中的位置145)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置167(在没有信号肽的序列中的位置150)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置170(在没有信号肽的序列中的位置153)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置171(在没有信号肽的序列中的位置154)处的氨基酸残基不是酪氨酸或精氨酸残基；在位置176(在没有信号肽的序列中的位置159)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置177(在没有信号肽的序列中的位置160)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置179(在没有信号肽的序列中的位置162)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置181(在没有信号肽的序列中的位置164)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置184(在没有信号肽的序列中的位置167)处的氨基酸残基不是色氨酸残基；在位置189(在没有信号肽的序列中的位置172)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置191(在没有信号肽的序列中的位置174)处的氨基酸残基不是赖氨酸或甘氨酸残基；在位置192(在没有信号肽的序列中的位置175)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置193(在没有信号肽的序列中的位置176)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置201(在没有信号肽的序列中的位置184)处的氨基酸残基不是酪氨酸残基；在位置203(在没有信号肽的序列中的位置186)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置207(在没有信号肽的序列中的位置190)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置211(在没有信号肽的序列中的位置194)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置212(在没有信号肽的序列中的位置195)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；在位置218(在没有信号肽的序列中的位置201)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置220(在没有信号肽的序列中的位置203)处的氨基酸残基不是缬氨酸或丙氨酸残基；在位置221(在没有信号肽的序列中的位置204)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置223(在没有信号肽的序列中的位置206)处的氨基酸残基不是色氨酸或谷氨酰胺残基；在位置224(在没有信号肽的序列中的位置207)处的氨基酸残基不是谷氨酸残基；在位置226(在没有信号肽的序列中的位置209)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置235(在没有信号肽的序列中的位置218)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置246(在没有信号肽的序列中的位置229)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置249(在没有信号肽的序列中的位置232)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置264(在没有信号肽的序列中的位置247)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置272(在没有信号肽的序列中的位置255)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、亮氨酸或组氨酸残基；在位置275(在没有信号肽的序列中的位置258)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置289(在没有信号肽的序列中的位置272)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；在位置291(在没有信号肽的序列中的位置274)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置292(在没有信号肽的序列中的位置275)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置294(在没有信号肽的序列中的位置277)处的氨基酸残基不是酪氨酸或丙氨酸残基；在位置295(在没有信号肽的序列中的位置278)处的氨基酸残基不是缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸残基；在位置297(在没有信号肽的序列中的位置280)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置298(在没有信号肽的序列中的位置281)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置299(在没有信号肽的序列中的位置282)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置306(在没有信号肽的序列中的位置289)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置307(在没有信号肽的序列中的位置290)处的氨基酸残基不是丝氨酸或亮氨酸残基；在位置311(在没有信号肽的序列中的位置294)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置326(在没有信号肽的序列中的位置309)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置327(在没有信号肽的序列中的位置310)处的氨基酸残基不是半胱氨酸、甘氨酸或亮氨酸残基；在位置328(在没有信号肽的序列中的位置311)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置334(在没有信号肽的序列中的位置317)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置339(在没有信号肽的序列中的位置322)处的氨基酸残基不是精氨酸或谷氨酸残基；在位置348(在没有信号肽的序列中的位置331)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置354(在没有信号肽的序列中的位置337)处的氨基酸残基不是天冬氨酸残基；在位置355(在没有信号肽的序列中的位置338)处的氨基酸残基不是苏氨酸或异亮氨酸残基；在位置371(在没有信号肽的序列中的位置354)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置374(在没有信号肽的序列中的位置357)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置377(在没有信号肽的序列中的位置360)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置378(在没有信号肽的序列中的位置361)处的氨基酸残基不是缬氨酸残基；在位置381(在没有信号肽的序列中的位置364)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置382(在没有信号肽的序列中的位置365)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置389(在没有信号肽的序列中的位置372)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置391(在没有信号肽的序列中的位置374)处的氨基酸残基不是半胱氨酸或组氨酸残基；在位置392(在没有信号肽的序列中的位置375)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置395(在没有信号肽的序列中的位置378)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置399(在没有信号肽的序列中的位置382)处的氨基酸残基不是丝氨酸或缬氨酸残基；在位置400(在没有信号肽的序列中的位置383)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置406(在没有信号肽的序列中的位置389)处的氨基酸残基不是甘氨酸残基；在位置410(在没有信号肽的序列中的位置393)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置411(在没有信号肽的序列中的位置394)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置414(在没有信号肽的序列中的位置397)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置417(在没有信号肽的序列中的位置400)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置420(在没有信号肽的序列中的位置403)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置423(在没有信号肽的序列中的位置406)处的氨基酸残基不是丙氨酸残基；在位置424(在没有信号肽的序列中的位置407)处的氨基酸残基不是蛋氨酸残基；在位置426(在没有信号肽的序列中的位置409)处的氨基酸残基不是半胱氨酸或天冬氨酸残基；在位置428(在没有信号肽的序列中的位置411)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置429(在没有信号肽的序列中的位置412)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置436(在没有信号肽的序列中的位置419)处的氨基酸残基不是组氨酸残基；在位置445(在没有信号肽的序列中的位置428)处的氨基酸残基不是脯氨酸残基；在位置450(在没有信号肽的序列中的位置433)处的氨基酸残基不是组氨酸或半胱氨酸残基；在位置452(在没有信号肽的序列中的位置435)处的氨基酸残基不是赖氨酸残基；在位置454(在没有信号肽的序列中的位置437)处的氨基酸残基不是精氨酸残基；在位置455(在没有信号肽的序列中的位置438)处的氨基酸残基不是丝氨酸或天冬氨酸残基；在位置456(在没有信号肽的序列中的位置439)处的氨基酸残基不是色氨酸或精氨酸残基；在位置459(在没有信号肽的序列中的位置442)处的氨基酸残基不是蛋氨酸或亮氨酸残基；在位置466(在没有信号肽的序列中的位置449)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置467(在没有信号肽的序列中的位置450)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置468(在没有信号肽的序列中的位置451)处的氨基酸残基不是苏氨酸残基；在位置473(在没有信号肽的序列中的位置456)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置476(在没有信号肽的序列中的位置459)处的氨基酸残基不是赖氨酸或甘氨酸残基；在位置478(在没有信号肽的序列中的位置461)处的氨基酸残基不是亮氨酸残基；在位置489(在没有信号肽的序列中的位置472)处的氨基酸残基不是丝氨酸残基；在位置490(在没有信号肽的序列中的位置473)处的氨基酸残基不是苯丙氨酸残基；以及在位置491(在没有信号肽的序列中的位置474)处的氨基酸残基不是精氨酸残基。在其它具体实施方式中，一个或多个X被定义为在对比的序列或残基中构成任何这些氨基酸的保守或半保守替代的位置处发现的任何氨基酸。在其它具体实施方式中，X被定义为在对比的序列中的所述位置处发现的任何氨基酸。例如，在位置51(在没有信号肽的序列中的位置34)处的氨基酸残基是丙氨酸或缬氨酸残基；在位置177(在没有信号肽的序列中的位置160)处的氨基酸残基是丙氨酸或丝氨酸残基；在位置212(在没有信号肽的序列中的位置195)处的氨基酸残基是异亮氨酸或缬氨酸残基；在位置291(在没有信号肽的序列中的位置274)处的氨基酸残基是谷氨酸或天冬氨酸残基；以及在位置374(在没有信号肽的序列中的位置357)处的氨基酸残基是缬氨酸或异亮氨酸残基。
片段可结晶区(Fc)片段
本发明的融合多肽可以包括C端域如Fc，免疫球蛋白的片段可结晶区。免疫球蛋白分子具有本领域中众所周知的结构。它包括通过链间二硫键连接的两个轻链(各自～23kD)和两个重链(各自～50-70kD)。容易将免疫球蛋白蛋白酶切割(例如，通过木瓜蛋白酶切割)成Fab(包含轻链以及重链的VH和CH1域)和Fc(包含重链的CH2和CH3域，连同邻接序列)。切割通常发生在连接Fab和Fc区的柔性铰链区。例如，木瓜蛋白酶切割紧接着在连接两个重链的二硫键以前的铰链区。
本发明的有用的Fc片段包括任何免疫球蛋白分子的Fc片段，包括IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE，以及它们的各种子类(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4、IgA-1、IgA-2)，其获自任何哺乳动物(包括，人)。本发明的Fc片段包括，例如，重链的CH2和CH3域，以及铰链区的任何部分。另外，可以在本领域技术人员已知的各种氨基酸残基处糖基化Fc区。在一些实施方式中，Fc片段是人IgG-1。在特定的实施方式中，融合多肽的Fc片段具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3具有至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大)的序列同一性。
另外的多肽特点
本发明的多肽可选地包括一个或多个另外的氨基酸：1)在多肽的N端，2)在多肽的sALP和Fc区之间，以及3)在多肽的C端。因此，本发明包括，例如，形式为Z-sALP-Y-Fc-X或Z-Fc-Y-sALP-X，的多肽，其中Z是在多肽的N端的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25、30、35、40、45、50、或更多)另外的氨基酸，Y是在多肽的sALP和Fc区之间的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25、30、35、40、45、50、或更多)另外的氨基酸(即，接头)，以及X是在多肽的C端的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25、30、35、40、45、50、或更多)另外的氨基酸。在特定的实例中，Y是二肽亮氨酸-赖氨酸。可替换地，X、Y、和Z的任何组合可以存在或不存在。例如，在一些实施方式中，Z和X是均不存在，以及Y不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列。例如，多肽可以由结构sALP-Y-Fc或结构Fc-Y-sALP组成。在多肽由结构sALP-Y-Fc或Fc-Y-sALP组成的一些实施方式中，Y可以由两个氨基酸残基组成，例如，亮氨酸-赖氨酸。例如，多肽可以由结构sALP-Y-Fc组成。可选地，sALP的氨基酸序列是SEQID NO：5的氨基酸序列，Y的氨基酸序列是亮氨酸-赖氨酸，和/或Fc的氨基酸序列是SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，可以按照用来产生融合多肽的克隆策略将另外的氨基酸引入多肽。在一些实施方式中，另外的氨基酸并不提供另外的GPI锚定信号，以将多肽保持在可溶性形式。另外，在一些实施方式中，任何这样的另外的氨基酸，当被加入本发明的多肽时，并不为宿主细胞的内切蛋白酶提供切割位点。可以预测设计序列将被宿主细胞的内切蛋白酶切割的可能性，如例如由Ikezawa(Biol.Pharm.Bull.25：409-417，2002)所描述的。
本发明的多肽还包括任何多肽，其具有一个或多个翻译后修饰如糖基化(例如，甘露糖化和本文讨论的其它形式的糖基化)、乙酰化、酰胺化、阻断、甲酰化、γ-羧基谷氨酸羟基化、甲基化、泛素化、磷酸化、吡咯烷酮羧酸修饰、和硫酸盐化。
在某些实施方式中，将本发明的多肽缔合成二聚物或四聚体。例如，可以通过位于Fc片段的铰链区中的两个二硫键来共价连结两个sALP-Fc单体。
核酸和多肽的生产
可以通过本领域已知的任何方法来产生本发明的核酸和多肽。通常，利用分子克隆方法来产生编码所期望的融合蛋白的核酸，并通常将其放置在载体内，如质粒或病毒。载体用来将核酸转化到适合于融合蛋白的表达的宿主细胞。代表性的方法，例如，披露于Maniatis，et al.(Cold SpringsHarbor Laboratory，1989)。许多细胞类型可以用作适当的宿主细胞，虽然哺乳动物细胞是优选的，因为它们能够赋予适当的翻译后修饰。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已用作用于表达本发明的融合蛋白的宿主，如在以下实施例中更详细描述的。可用于表达本发明的融合蛋白的其它宿主细胞包括，例如，L细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、或COS-7细胞。用于表达本发明的融合蛋白的感兴趣的特定CHO细胞包括CHO-DG44和CHO/dhfr-。后者细胞系可通过American Type Culture Collection(ATCCnumber CRL-9096)来获得。
可以在适合于在宿主细胞中表达多肽的任何条件下来产生本发明的多肽。上述条件包括适当选择培养基，其制备自多种成分如缓冲剂、碳酸氢盐和/或HEPES、离子如氯化物、磷酸盐、钙、钠、钾、镁、铁、碳源如单糖、氨基酸、潜在的脂质、核苷酸、维生素和生长因子如胰岛素；正规商业上可获得的培养基如α-MEM、DMEM、Ham′s-F12和IMDM，其补充有2-4mM L-谷氨酰胺和5％小牛血清；正规商业上可获得的没有动物性蛋白质的培养基如HycloneTM SFM4CHO、Sigma CHO DHFR-、CambrexPOWERTM CHO CD，其补充有2-4mM L-谷氨酰胺。期望在没有胸苷、次黄嘌呤和L-甘氨酸的条件下制备这些培养基以保持选择压力，从而允许稳定的蛋白产物的表达。
在实施例中给出本发明的多肽和核酸的生产的另外的细节。
治疗应用
本发明的核酸和多肽可以具有各种各样的治疗应用，例如，在先天性骨疾病、骨折修复、骨和牙种植体、椎骨融合等领域。尤其是，本发明的核酸和多肽可用于治疗基质矿化障碍，如本文描述的，如HPP。
低磷酸酯酶症(HPP)
HPP历史上是诊断时的年龄按照加以分类，并且包括(以从最严重至最不严重的次序)围产期、婴儿、儿童、成年、和牙齿型低碱性磷酸酯酶症形式。最严重形式，围产期(致死)HPP，表现为在子宫内几乎完全没有骨矿化并且可以引起死产。患有围产期HPP的一些新生儿可以存活数天，但患有增加的呼吸损害，这是由于胸部的发育不良和佝偻病。在婴儿HPP中，在6个月龄以前诊断的，出生后发育似乎正常，直到喂哺困难的开始、不适当的体重增加、和佝偻病的出现。婴儿HPP具有特征性的放射学特点，其显示受损的骨骼矿化，有时具有渐进式骨骼去矿化，从而导致肋骨骨折和胸廓畸形。童年期HPP具有高度可变的临床表现。童年期HPP的一种症状是乳牙的过早缺失，其来自连接牙根和牙周韧带的牙骨质的不发育、发育不全或发育不良。童年期HPP的另一种症状是佝偻病，其引起身材矮小症和骨骼畸形如弓形腿和放大的腕关节、膝和踝(由于喇叭形干骺端的结果)。成年HPP通常存在于中年期间，但经常之前出现佝偻病病史和/或早期牙齿脱落，接着在青少年期和年轻成年生活期间的健康。在成年HPP中，复发性跖骨应力骨折是常见的，并且焦磷酸钙二水合物沉积可以引起关节炎和焦磷酸盐关节病的发作。最后，当仅有的临床异常是牙疾病并且放射性研究以及甚至骨活检并没有揭示佝偻病或骨软化的征兆时，则，诊断为牙齿型低碱性磷酸酯酶症。
HPP的更严重的临床形式通常遗传为常染色体隐性性状，其中上述患者的双亲显示低于正常水平的血清AP活性。对于HPP的温和形式，即，成年HPP和牙齿型低碱性磷酸酯酶症，也已文件说明了遗传的常染色体显性模式。
在健康骨骼中，TNALP是胞外酶，其存在于成骨细胞和软骨细胞的质膜的表面上，以及存在于它们的脱落基质小泡(MV)的膜上，其中上述酶是特别丰富的。在骨矿化期间，羟磷灰石的沉积通常开始于这些MV的腔内。电子显微镜术已表明，来自严重患有HPP的患者和Akp2-/-小鼠(TNALP裸鼠模型，参见下文)的TNALP缺乏MV包含羟磷灰石晶体，但小泡外晶体生长出现迟缓。这种缺损归因于PPi的胞外积累，上述PPi是钙化的有效的抑制剂(由于缺乏TNALP活性)。
在生理浓度(0.01-0.1mM)下，PPi具有刺激矿化的活性。这已用器官培养的鸡股骨和分离的大鼠MV得到证明。然而，在高于1mM的浓度下，PPi会抑制磷酸钙矿物形成(通过涂布羟磷灰石晶体)，因而防止矿物晶体生长和增生性自我核化。因此，PPi具有双重生理作用：在较低浓度下它作为矿化的促进剂，但在较高浓度下则作为矿化的抑制剂。TNALP已表明会水解矿化抑制剂PPi以促进矿物沉淀和生长。利用Akp2-/-小鼠进行的最近的研究已表明，TNALP体内的主要作是限制胞外PPi库的大小以允许适当的骨骼矿化。
低磷酸酯酶症的严重性取决于TNALP突变的特性。已发现在TNALP中的各种位置(包括酶的活性位点附近、同源二聚体界面、冠域、氨基末端臂、和钙结合位点)的错义突变会影响它的催化活性。另外，错义、无义、移码、和剪接位点突变也已表明会导致异常突变蛋白或细胞内转运缺损，其导致在细胞表面上低于正常的活性。引起HPP的大量的突变、和在HPP中化合物杂合性是经常发生的事实，解释了在此疾病中经常观测到的可变表达度和不完全外显率。
HPP的人形式的进展已大大受益于TNALP裸鼠(Akp2-/-)(HPP的一种动物模型)的存在。Akp2-/-小鼠非常好地表型模拟婴儿HPP：它们天生具有正常矿化骨骼但在约6天龄时发展放射造影上明显的佝偻病，并在第12-16天之间死亡，其患有严重的骨骼矿质过少和呼吸暂停的发作以及癫痫发作，它们可归因于PLP(维生素B6)代谢的失调。
证实了PPi和PLP均是TNALP的天然底物，并且一些TNALP活性位点突变已表明对上述酶代谢PPi和PLP的能力具有不同影响。在PLP代谢中的异常解释了在Akp2-/-小鼠中观测到的癫痫发作，而在PPi代谢中的异常则解释了在HPP的这种小鼠模型中的骨骼表型。
剂型
剂型将取决于给予途径、以及取决于其它治疗目标。可以通过本领域已知的任何途径来给予本发明的核酸和多肽，例如，皮下途径(例如，通过皮下注射)、静脉内途径、口服、鼻途径、肌内途径、舌下途径、鞘内途径、或皮内途径。通过实例方式，本发明的药物组合物可以具有以下形式：液体、溶液、混悬剂、丸剂、胶囊剂、片剂、软胶囊、散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、合剂、雾化蒸汽、气雾剂、或磷脂复合物。
在本发明的一些实施方式中，可以皮下给予本发明的组合物。皮下给予是有利的，因为它是相对非侵入性的并提供所期望的药代动力学类型。适宜的体积是本领域技术人员已知的，并且通常为5mL或更少(例如，4mL、3.5mL、3mL、2.7mL、2.5mL、2.3mL、2.2mL、2.1mL、2.0mL、1.9mL、1.8mL、1.7mL、1.5mL、1.3mL、1.0mL、0.7mL、0.5mL、0.3mL、0.1mL、0.05mL、0.01mL、或更少)。皮下给予所需要的较小体积需要给予足够高浓度的组合物。因此，并不是所有组合物可以适合于皮下给予，例如，以高浓度聚集的多肽。已发现，可以将本发明的组合物配制成足够高浓度以适合于皮下给予。通常，可以将本发明的组合物配制成例如1mg/mL至500mg/mL的浓度(例如，10mg/mL至300mg/mL、20mg/mL至120mg/mL、40mg/mL至200mg/mL、30mg/mL至150mg/mL、40mg/mL至100mg/mL、50mg/mL和80mg/mL、或60mg/mL至70mg/mL)，用于皮下给予。
对于口服给予，可以常规方式并借助于药用赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、或湿润剂，来制备片剂或胶囊剂。可以通过本领域已知的方法来包衣片剂。用于口服给予的液体制剂可以采用，例如，溶液、糖浆剂、或混悬剂的形式，或可以将它们呈现为干燥产品，用于在使用前用盐水或其它适宜的液体载体加以构建。本发明的用于口服给予的组合物还可以包含药用赋形剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体、防腐剂、缓冲盐、增香剂、着色剂、和甜味剂(视情况而定)。还可以适当配制用于口服给予的制剂，以提供活性组分的控释。
肠溶衣可以另外用于本发明的片剂上，以抵抗与强酸性胃液的长期接触，但在弱酸性或中性肠环境中溶解。没有被如此限制，在本发明的药物组合物的肠溶衣中可以使用邻苯二甲酸乙酸纤维素、EudragitTM和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)。通常使用的邻苯二甲酸乙酸纤维素浓度是核心重量的0.5-9.0％。增塑剂的添加会改善这种包衣材料的耐水性，并且和单独使用邻苯二甲酸乙酸纤维素相比，使用上述增塑剂的配方更加有效。邻苯二甲酸乙酸纤维素相容于许多增塑剂，包括乙酰化甘油单酯；邻苯二甲酰丁基乙醇酸丁酯；酒石酸二丁酯；邻苯二甲酸二乙酯；邻苯二甲酸二甲酯；邻苯二甲酰乙基乙醇酸乙酯；丙三醇；丙二醇；三醋精；三醋精柠檬酸酯；和三丙酸甘油酯。它还连同其它涂布剂如乙基纤维素一起用于药物控释制剂。
可以连同药用、无菌、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳状液一起来给予本发明的化合物。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油、和注射用有机酯。水性载体包括水、水-醇溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲的医疗肠外载体，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、包含乳糖的林格氏液、或固定油。静脉内载体可以包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂，以及类似物。
在一些实施方式中，可以用控释***来递送本发明的药物组合物。在一些实施方式中，可以使用聚合物材料，包括聚乳酸、聚原酸酯、交联两亲嵌段共聚物和水凝胶、聚羟基丁酸和聚二氢吡喃(还参见Smolen and Ball，Controlled Drug Bioavailability，Drug product design and performance，1984，John Wiley & Sons；Ranade and Hollinger，Drug Delivery Systems，pharmacology and toxicology series，2003，2nd edition，CRRC Press)。在另一种实施方式中，可以使用泵(Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。
可以利用适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂，将本发明的组合物配制成冷冻干燥散剂的形式。
另外，细胞(例如，成骨细胞)可以分离自患有基质矿化障碍的个体，用本发明的核酸加以转化，并重新引入受困扰个体(例如，皮下或静脉内注射)。可替换地，可以直接将核酸给予受困扰个体，例如，通过注射。还可以通过载体如脂质体来递送核酸，上述脂质体可以被设计成靶向特定的细胞类型，并设计成通过不同途径来给予。
还可以连同至少一种其它活性组分一起来使用本发明的组合物，以纠正骨矿化缺损或HPP的另一种有害症状。例如，它还可以连同至少一种其它活性组分一起用来纠正牙骨质缺损。
基因治疗
还可以有利地通过基因治疗来递送本发明的融合蛋白，其中将编码蛋白的外源性核酸递送到感兴趣的组织并体内表达。基因治疗方法描述于，例如，Verme et al.(Nature 389：239-242，1997)和Yamamoto et al.(MolecularTherapy 17：S67-S68，2009)，其以引用方式结合于本文。可以使用病毒和非病毒载体***。载体可以是，例如，质粒、人工染色体(例如，细菌、哺乳动物、或酵母人工染色体)、病毒或噬菌体载体，其提供有复制起点，以及可选地，用于表达编码病毒多肽的核酸的启动子，以及可选地，启动子的调节剂。载体可以包含一种或多种可选择的标记基因，例如，氨苄青霉素或卡那徽素抗性基因(在细菌质粒的情况下)或用于真菌载体的抗性基因。可以体外使用载体，例如，用于生产DNA、RNA、或病毒多肽，或可以用来转染或转化宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞，例如，用于生产由载体编码的病毒多肽。还可以使载体适应于体内使用，例如，用于接种或基因治疗的方法。
适宜的病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体，包括单纯疱疹病毒载体、α-病毒载体、痘病毒载体，如基于金丝雀痘和牛痘病毒的***。利用这些病毒的基因转移技术是本领域中已知的。逆转录病毒载体，例如，可以用来将本发明的核酸稳定地整合到宿主基因组。相比之下，复制缺陷型腺病毒载体保持附加型载体，因而允许瞬时表达。可以采用能够在昆虫细胞(例如，杆状病毒载体)、在人细胞、酵母菌、或在细菌中驱动表达的载体，以产生大量的由本发明的核酸编码的病毒多肽，例如，用于亚单位疫苗或用于免疫测定。有用的基因治疗方法包括那些在WO 06/060641、US 7,179,903和WO 01/36620(各自以引用方式结合于本文)中描述的方法，其使用腺病毒载体来将感兴趣的核酸靶向肝细胞作为蛋白生产细胞。
在另外的实例中，复制缺陷型猴腺病毒载体可以用作活载体。这些病毒包含E1缺失并且可以生长在细胞系(其借助于E1基因加以转化)上。这些复制缺陷型猴腺病毒载体的实例描述于美国专利号6,083,716和WO03/046124(各自以引用方式结合于本文)。可以操作这些载体以***本发明的核酸，以致可以表达编码的病毒多肽。
可以选择启动子和其它表达调节信号以相容于设计用于表达的宿主细胞。例如，哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，其可以响应于重金属如镉而被诱导，以及β-肌动蛋白启动子。还可以使用病毒启动子，如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(1E)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子、或HPV启动子，特别是HPV上游调节区(URR)。在本领域中很好描述了所有这些启动子、以及另外的启动子。
还可以利用基于非病毒的***来给予本发明的核酸。例如，这些给予***包括微球体胶囊化、聚(丙交酯-乙交酯)、纳米颗粒、和基于脂质体的***。基于非病毒的***还包括促进“裸”多核苷酸的递送的技术(如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的各种其它技术)。
可以将引入的多核苷酸稳定或瞬时保持在宿主细胞中。稳定维护通常需要引入的多核苷酸包含相容于宿主细胞的复制起点或整合到宿主细胞的复制子如染色体外复制子(例如，质粒)或细胞核或线粒体染色体。
剂量
可以将任何量的本发明的药物组合物给予主体。剂量将取决于许多因素，包括给予模式和主体的年龄。通常，包含在单剂量内的本发明的组合物的量将是这样的量，其有效治疗矿物矿化障碍而没有诱导显著毒性。对于皮下给予，可以以0.01mg/kg至100mg/kg的个体剂量(例如，0.1mg/kg至50mg/kg、0.5mg/kg至25mg/kg、1.0mg/kg至10mg/kg、1.5mg/kg至5mg/kg、或2.0mg/kg至3.0mg/kg)将本发明的多肽给予主体。可以每小时、每两小时、每日、每两天、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周、每两周、每月、每两个月、或每年给予剂量。将由临床医生按照常规因素如疾病的程度和来自主体的不同参数来调整剂量的量和频率。
可以按照本文描述的剂型并以适用于基因治疗的剂量，将本发明的核酸给予患者。给予的核酸量将取决于本领域技术人员已知的若干因素，包括：核酸的长度和特性、使用的载体(例如，病毒或非病毒载体)、编码的多肽的活性、赋形剂的存在、给予的途径和方法、以及主体的一般状况和适合度。给予的示例性剂量和途径例如描述于Melman et al.(Isr.Med.Assoc.J.9：143-146，2007；描述了***内注射0.5mg至7.5mg在质粒中的人cDNA，用于治疗***功能障碍)、Powell et al.(Circulation 118：58-65，2008；描述了肌内注射0.4mg至4.0mg肝细胞生长因子质粒以治疗临界肢体缺血)、Waddill et al.(AJR Am.J.Roentgenol.169：63-67，1997；人啊事业部CT引导下肿瘤内注射0.01mg至0.25mg编码MHC抗原的质粒DNA以治疗黑素瘤)、Kastrup et al.(J.Am.Coll.Cardiol.45：982-988，2005；描述了心肌内注射0.5mg的VEGF质粒以治疗严重心绞痛)、Romero et al.(Hum.Gene.Ther.15：1065-1076，2004；描述了肌内注射0.2mg至0.6mg质粒以治疗Duchenne/Becker肌营养不良)，各自以引用方式结合于本文。
在某些实施方式中，可以以例如0.01mg至100mg的核酸的剂量(例如，0.05mg至50mg、0.1mg至10mg、0.3mg至3mg、或约1mg)将本发明的核酸给予主体。可以给予的核酸的总体积将取决于它的浓度，并且可以为，例如，1μL至10mL(例如，10μL至1mL、50μL至500μL、70μL至200μL、90μL至150μL、或100μL至120μL)。可以以单或多剂量(例如，每小时、每两小时、每日、每两天、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周、每两周、每月、每两个月、或每年)来给予核酸。
这些是指导原则，因为应由主治医生或营养师并基于每位主体特有的临床因素来精心选择和逐步调整实际剂量。最佳的每日剂量将通过本领域中已知的方法来确定并且将受到若干因素的影响，如主体的年龄(如上文所述)，和其它临床相关因素。另外，主体可以服用用于其它疾病或病症的药物。在将本发明的多肽或核酸给予主体期间，可以继续其它药物治疗，但在这样的情况下明智的是，开始于低剂量以确定是否经历不良的副作用。
实施例
以下提供的实施例描述了利用新的可溶性重组蛋白对Akp2-/-小鼠的成功治疗，上述新的可溶性重组蛋白包括人组织非特异性碱性磷酸酶，其在它的羧基末端融合于人lgG-1的结晶片段(Fc)区。这些实施例用来说明而不是限制本发明。
实施例l：sALP-Fc的表达和生产
通过PCR扩增自pIRES-sALP-FcD10质粒来产生sALP-Fc cDNA，然后克隆到pSV(潮霉素)表达载体(Selexis Inc.)。借助于PvuI-线性化pSV-sALP-Fc质粒并利用制造商的协议，来转染在补充有4mM L-谷氨酰胺(Wisent)的Power CHO2CD培养基(Lonza)中生长的CHO-K1S细胞。在转染以后48小时，用包含200μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的培养基更换培养基。监测生存力并每96小时更换培养基。在生存力达到90％以后，筛选培养物的高表达克隆，其中利用Clonepix FL技术平台(Genetix Inc.)并采用FITC偶联抗sALP抗体。在96孔板中，利用对培养上清的sALP酶法测定来扩增和选择最好的克隆。在25L WAVE生物反应器中扩增和生长选择的克隆。在培养结束时，在用过的培养基中的sALP-Fc的浓度是135mg/L，如通过TNSALP酶活性所评估的。当生存力下降到低于10％时，停止WAVE运动以使细胞可以沉降，然后借助于通过Millistak+Pod(Millipore)和0.22μm 1L无菌过滤装置(Corning)的过滤来收获上清。在利用通过Kvick Lab SCU装置(GE Healthcare，30kDa截止)的切向流动过滤将在PBS中的培养基10倍浓缩和透析至2.5L以后，将培养基加载到Mab Select Sure柱上，上述柱先前用EQ缓冲液(50mM NaPO4，100mM NaCl，pH 7.5)加以平衡。然后用3.5体积的EQ缓冲液、5.5体积的Wash2缓冲液(50mM Tris-Cl，1.5M NaCl，pH 8.0)、和3.5体积的Wash3缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤柱。然后用10体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 11.0)洗脱sALPFc。用Butyl-琼脂糖凝胶柱并利用以下程序来进一步纯化洗脱的蛋白：首先混合蛋白和等体积的2X平衡缓冲液(eq)(40mM Hepes，2.5M硫酸铵，pH 7.5)，然后加载到先前用6体积的1X平衡缓冲液平衡的柱上。在用5体积的EQ缓冲液和3体积的Wash2缓冲液(20mM Hepes，0.95硫酸铵，pH 7.5)洗涤以后，用5体积的洗脱缓冲液(25mM NaPO4，0.5M硫酸铵，pH 7.4)洗脱蛋白。最终浓缩纯化的sALP-Fc，然后利用30kDa截止Vivaspin装置(Sartorius VS2022)并相对于磷酸盐缓冲液(25mM NaPO4，150mM NaCl，pH 7.4)加以透析。纯化程序的总产率是30％，其中纯度超过95％，如通过Sypro ruby染色4-12％SDS-PAGE(Invitrogen Inc.)和尺寸排阻HPLC所评估的。纯化的sALP-Fc制剂被储存在4℃下并保持稳定数月。
实施例2：木瓜蛋白酶消化以产生sALP
利用木瓜蛋白酶消化，自sALP-Fc产生sALP，具体如下：首先相对于消化缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)并利用Vivaspin装置(SartoriusVS2022)来透析sALP-Fc，调节到10mg/mL，然后以600μL/管加入埃彭道夫管。并行地，以在1.5mL中的25个单位，将木瓜蛋白酶-琼脂糖(SigmaP4406)重悬浮于洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，1mM EDTA，pH 6.9)。为了消化1nmol的sALPFc，将42mU木瓜蛋白酶-琼脂糖转移到锥形管，在1000g下离心5分钟，然后用10体积的消化缓冲液洗涤。在另一次旋转减慢以后，将颗粒重悬浮于消化缓冲液并调节到和制备的sALPFc相同的总体积。然后通过添加10mM DTT来激活木瓜蛋白酶以具有0.5mM的终浓度。然后立即将600μL木瓜蛋白酶-琼脂糖加入每个包含在37℃下预加热的sALPFc的埃彭道夫管，接着在37℃和温和搅拌下温育2小时。然后将混合物倾注到空PD-10柱(GE Healthcare 17-0435-01)上并收集流过物。用3体积的消化缓冲液冲洗凝胶并汇集此体积与流过物。然后通过用连接于AKTAfplc***的Hitrap蛋白A Mab Select SuRe柱(GE Healthcare11-0034-9)的纯化来分离Fc区与sALP。简单地说，用10体积的缓冲液A(10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.4)来平衡柱，然后以1mL/分钟来加载蛋白达5mL柱。在一个馏分中收集包含sALP的流过物。然后用缓冲液A洗涤(1mL/分钟)柱，直到280nm处的吸光度返回到基线。在一个馏分中收集洗涤物。然后用至少3柱体积的缓冲液B(50mM Tris-Cl，pH 8.0)并在1.5mL/分钟下洗涤柱，接着用缓冲液C(50mM Tris-Cl，pH 11.0)洗脱，直到280nm处的吸光度返回到基线。汇集流过物和缓冲液A洗涤馏分然后利用Vivaspin装置(Sartorius VS2022)并相对于储存缓冲液(25mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.4)加以透析。利用280nm光密度测定来确定蛋白浓度，并利用SDS-PAGE分析、SEC-HPLC、和sALP酶活性测定来确定消化效率和产率。
实施例3：sALP和sALP-Fc的药物动力学分析
对纯化的sALP和sALP-Fc进行体内药物动力学(PK)研究，其中将sALP和sALP-Fc静脉内(IV)和皮下(SC)给予5-6周龄C57BL/6雄性小鼠。
实验设计
动物接收如表1所列的单IV或SC剂量。
表1：在小鼠中sALP和sALP-Fc的体内PK研究的实验设计
Figure BDA00002691453600321
给予测试物品的给药剂量
在上午7:00和上午10:30之间进行剂量给予。每只小鼠在肩胛区被皮下注射测试物品或被固定在啮齿动物限制器中并经由尾静脉注射作为静脉内大丸剂的测试物品。剂量体积设定为3.33-4.0mL/kg。在预定血液采集和处死以前，动物仅接收一个剂量。在预定测试物品注射以前评估个体体重，并且给予的测试物品的体积是基于上述体重测定。
血液采样和调节
在不同时间点，在异氟醚麻醉下，经由颈静脉来收集血液样品(0.1至0.12mL)。在最后的时间点，在异氟醚麻醉下，通过心脏穿刺来收集血液样品。将血液样品收集到Microvette 200Z/凝胶管(Sarstedt，血清/凝胶凝血激活剂，#20.1291)，在室温下温育30至60分钟，然后在2-8℃和10000g下离心5分钟。将血清转移到新鲜0.5mL管(Sarstedt，#72.699)，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下直到分析。
在血清中的测试物品浓度
在完成处理以后，利用比色酶法测定来评估在血清样品中sALP和sALP-Fc的存在。利用生色底物来确定酶活性，其中吸光度的增加是正比于底物转化到产物。最终体积是200μL。首先，添加20μL标准或20μL的PK血清样品。还重复两次制备空白。在包含1mM底物(pNPP：对硝基苯基磷酸二钠六水合物)的180μL缓冲液(20mM Bis Tris丙烷(HCl)pH 9.0，50mM NaCl，0.5mM MgCl2和50μM ZnCl2)中进行反应。最后添加底物以引发反应。用光谱光度测量读板器(Molecular Devices)，在405nm处每30秒记录吸光度，时间为20分钟。通过拟合用光谱光度测量读板器获得的20个相邻读数的最陡的斜率来评估表示为初始速率的酶活性。
制备已知浓度的sALP或sALP-Fc的标准，然后如上所述来确定酶活性。通过对作为标准量的对数的函数的初始速率的对数进行作图来产生标准曲线。标准曲线用来检验每个测定运行。
通过将它们的各自的最大值转换成单位来确定PK血清样品的sALP或sALP-Fc浓度(U/L)。一个单位被定义为sALP或sALP-Fc的量，在37C下并在1分钟内，其将1μmol对硝基苯基磷酸酯水解成对硝基苯酚。由于在血清中存在sALP或sALP-Fc的内源性形式，所以用在备用动物中测得的基线值来校正测得的浓度。
非区室药物动力学分析
非区室分析(NCA)用来计算试验化合物的药物动力学参数。利用WinNonlinTM Enterprise Edition版本5.2.1来处理所有测得的试验化合物的血清浓度与时间分布。选择NCA模型200用于SC输入或模型201用于IV-大丸剂输入，其中对于两种模型均利用稀疏采样分析模块。
计算以下非区室PK参数：
●从时间零到无限的曲线下面积(AUC∞)，计算为AUClast+Clast/λz(其中λz＝血清浓度的末期与时间曲线的斜率)；
●最大观测血清浓度(Cmax)，最大血清浓度的时间(Tmax)；
●终端消除半衰期(T1/2，计算为0.693/λz)；
●在静脉内给予(CL)和皮下给予(CL_F)以后的全身清除被计算为剂量/AUC∞；
利用以下公式来计算在途径之间的绝对生物利用度(F％)：
[AUC∞(sc)/剂量(sc)]/[AUC∞(iv)/剂量(iv)]x 100。
名义时间用于计算并且相对于开始给予剂量来设定时间。名义剂量用于CL和CL_F的计算。
结果
在单剂量IV和SC给予sALP和sALP-Fc以后，在血清中的平均(±SD)浓度分布分别示于图7(a)和7(b)。计算的PK参数示于表2(a)和2(b)。
表2a：在血清中sALP和sALP-Fc的药物动力学参数(单剂量IV给予)。
PK参数(NCA) 单位 sALP sALP-Fc
剂量 U/kg 10000 2000
Cmax/剂量 U/L/U/kg 4.32 8.54
AUC∞/剂量 U/L*hr/U/kg 16.0 70.6
CL L/hr/kg 0.0627 0.0142
半衰期 hr 17.6 46.9
表2b：在血清中sALP和sALP-Fc的药物动力学参数(单剂量SC给予)。
PK参数(NCA) 单位 sALP sALP-Fc
剂量 U/kg 10000 2000
Cmax/剂量 U/L/U/kg 0.0514 0.413
AUC∞/剂量 U/L*hr/U/kg 0.483 26.2
CL_F L/hr/kg 2.07 0.0382
半衰期 hr 24.5 43.7
生物利用度 ％ 3.02 37.1
结论
根据数据，可以看到，IgG1 Fc域与sALP的融合会增加它的SC生物利用度10倍以上并且在SC给予以后增加它的全身暴露50倍以上。
实施例4：在Akp2-/-小鼠中在大丸剂皮下注射sALP-Fc 43天以后，剂量和反应之间的关系的评估
Akp2-/-敲除小鼠的产生
借助于同源重组，通过将新盒***小鼠TNSALP基因(Akp2)的外显子6来产生Akp2-/-敲除小鼠，婴儿HPP的小鼠模型，其功能上灭活Akp2基因，从而导致不可检测的TNSALP mRNA或蛋白。它们被保持为12.5％C57Bl/6-87.5％129JAkp2-/-。表型上，Akp2-/-小鼠紧密地模仿婴儿HPP。和这些患者一样，Akp2-/-小鼠具有TNSALP活性的全局缺乏，ALP底物PPi、PLP、和磷酸乙醇胺(PEA)的胞外积累，以及产后明显的骨骼基质的矿化的获得性缺损，从而导致放射造影上和组织学上明显的佝偻病或骨软化。它们生长发育迟缓，还发展癫痫发作和呼吸暂停，并在出生后第10-12天死亡。吡哆醇补充会简短地抑制它们的发作并延长它们的寿命，但仅直到出生后第18-22天。因此，在此研究中，使所有动物(中畜、乳母和它们的幼崽、以及断乳的婴儿)可以自由获得改进的实验室啮齿动物饮食5001，其包含增加水平(325ppm)的吡哆醇。
在出生时(第0天)，通过组织活检的PCR来确定Akp2-/-纯合小鼠，其中利用相对于小鼠TNSALP基因的外显子VI而言的特异性引物：GTCCGTGGGCATTGTGACTACCAC(SEQ ID NO：18)和TGCTGCTCCACTCACGTCG(SEQ ID NO：19)。
实验设计
将Akp2-/-小鼠分为4个治疗组：
●第1组(赋形剂)：Akp2-/-小鼠，每日用SC赋形剂治疗(n＝18)；
●第2组(Tx-1)：Akp2-/-小鼠，每日SC用1mg/kg的sALP-Fc进行治疗(n＝17)；
●第3组(Tx-3)：Akp2-/-小鼠，每日SC用3mg/kg的sALP-Fc进行治疗(n＝19)；
●第4组(Tx-6)：Akp2-/-小鼠，每日SC用6mg/kg的sALP-Fc进行治疗(n＝17)；
●第5组(WT)：Akp2-/-小鼠的野生型同窝小鼠，用作参比动物并且并不接收注射(n＝35)。
在上午8:00和11:00之间进行注射，并且剂量体积设定为3.3mL/kg体重。基于在注射以前测得的每日体重来计算和调节所给予的实际体积。将赋形剂或sALP-Fc注射(SC)到肩胛区。所有治疗开始于出生后的第1天，并每日重复长达43天或直到尸体剖检时。
终结程序
在第44天，对于那些完成实验协议的动物，在最后一次注射以后24小时进行尸体剖检，或对于那些似乎接近病逝的动物则尽早进行尸体剖检。在异氟醚麻醉下通过双侧胸廓切开术使所有动物安乐死。尸体剖检包括大体病理检查，以及收集一片耳以再次确认Akp2-/-基因型。清洗骨样品，在2至8℃下在10％中性缓冲***中固定3天，然后转移到70％乙醇，供在2至8℃下贮存。利用卡尺来测量股骨和胫骨长度。
放射造影分析
借助于Faxitron MX-20DC4(Faxitron X-ray Corporation，Wheeling，IL)来获得放射造影图像，其中使用26kV的能量和10秒的暴露时间。由兽医放射学家以双盲方式来分类骨矿化的缺损。如果至少一个骨结构(包括次级骨化中心)不存在，则动物是“异常的”。
统计分析
所有数值表示为平均值±标准偏差。由于较小的样本量，对于所有参数，非参数分析是优选的。时序检验用来比较存活曲线。卡方检验用来比较在治疗之间正常和异常放射照片的分布。方差分析模型用来比较每天在组之间的平均体重，以及在研究结束时的平均骨长度。
剂量-反应分析
以下概念上的药效(PD)模型用来拟合剂量-反应数据，如表3中所描述的。
表3：用来拟合剂量-反应数据的药效模型
Figure BDA00002691453600361
E＝效应，C＝剂量，S＝斜率，γ＝S形因子(sigmoidicity factor)，Cmax最大剂量，Emax最大效应，E0＝在C＝0时的基线效应；ED50＝诱导50％的Emax的剂量
赤池弘次信息量(AIC)和施瓦茨-贝叶斯(SBC)准则用作拟合优度的度量以选择用于每个数据集的最好模型。当针对给定数据集比较若干模型时，在模型判别过程中选择与最小AIC和SBC相关联的模型。PD参数的相关系数(r2)和拟合的视觉评估(VAF)、绝对残差分布、变异系数也用于模型判别。
在已选择适当的模型以后，利用在WinNonlin 5.2中的预定加权方式(1/Y、1/Yhat、1/Y.Y和1/Yhat、Yhat)，重新运行拟合。和那些用来选择模型的相同的准则再次用于选择针对每个数据集的适当的加权方式。最终PD参数是利用最好加权方式产生自所选择的模型。利用WinNonlinTMEnterprise v5.2来进行药效(PD)分析。利用Microsoft Office(Excel)2003、和SigmaPlot v9.0.1来产生表和图。
利用全精度来进行所有分析。在可能的情况下，报道个别数据至3位有效数字。利用WinNonlin 5.2来确定PD参数和它们的95％置信区间。
结果
本研究的目的是定义在增加量的sALP-Fc(利用推注SC注射)和在43天以后的治疗反应之间的剂量反应关系。终点是生存、体重、胫骨和股骨的骨长度、和足的骨矿化缺损。
当和赋形剂比较时(p＜0.0001)(图8(a))，表示每个治疗组的小鼠的生存得到显著改善。当比较治疗组的存活曲线时，差异也是统计上显著的(p＜0.0001)。在赋形剂、Tx-1、和Tx-3组中，中位生存分别为19、25、和41天(图8(b))。在Tx-6组中，在完成研究以前，17只小鼠中仅4只死亡；因此，不能计算此组的中位生存。然而，在sALP-Fc日剂量和Akp2-/-小鼠的生存之间存在明显的关系。
图9示出体重变化。在开始治疗时，在每个治疗组的新生Akp2-/-小鼠和新生WT小鼠之间，平均每天体重(BW)并不显示统计差异。在研究结束时，在治疗Akp2-/-小鼠和WT小鼠之间，平均每日BW仍然是类似的。
图10示出小鼠的股骨/胫骨长度的变化。这些数据表明，在研究结束时，在每个治疗组的Akp2-/-小鼠和WT小鼠之间在胫骨和股骨的平均长度方面并不存在统计上显著的差异。赋形剂小鼠的死亡排除了年龄匹配的骨长度分析。
图11示出″正常″和″异常″足、肋廓、和下肢样品的代表性的放射照片。每个治疗组的放射造影结果，即，仅接受赋形剂的Akp2-/-与1、3、或6mg/kg/天sALP-Fc，汇总于表4。在这里，提供了正常和异常放射造影图像的分布，其中在括号中给出百分比。按照在赋形剂组中发现具有正常矿化的动物的基线数来校正每个治疗组的单个放射造影图像分布值。在赋形剂组中具有正常矿化的动物的数目被认为是基线值。从在给药组中发现的正常和异常动物的相应数目减去基线值。
表4：在接受赋形剂或1、3、或6mg/kg/天sALP-Fc的Akp2-/-小鼠的足的正常和异常放射造影图像之间的分布。
Figure BDA00002691453600381
通过评估不同剂量对放射造影图像分布(RID)药效终点的影响，检查了对sALP-Fc治疗的剂量反应。借助于数学和图形准则，S形Emax模型被确定为是用于拟合校正RID足数据集的最好模型。在整个模型拟合程序中使用了一致误差模型。
在sALP-Fc的日剂量和具有足的正常骨的小鼠的百分比之间存在明显的关系。估计，对于足，80％有效剂量是3.0mg/kg/天(图12)。
这些实施例说明，用sALP-Fc治疗的HPP小鼠经历治疗益处，其显著大于sALP的治疗益处。
参考文献
以下文献以引用方式结合于本文：
1.Ali et al.，“Isolation and characterization of calcifying matrix vesiclesfrom epiphyseal cartilage，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 67：1513-20，1970.
2.Anderson et al.，“Matrix vesicles in osteomalacic hypophosphatasiabone contain apatite-like mineral crystals，”Am.J.Pathol.151：1555-61，1997.
3.Anderson et al.，“The role of matrix vesicles in growth platedevelopment and biomineralization，”Frontiers in Bioscience 10：822-837，2005.
4.Anderson et al.，“Sustained osteomalacia of long bones despite majorimprovement in other hypophosphatasia-related mineral deficits in tissuenonspecific alkaline phosphatase/nucleotide pyrophosphatasephosphodiesterase 1 double-deficient mice，”Am.J.Pathol.166：1711-1720，2005.
5.Anderson et al.，“Pyrophosphate stimulation of calcium uptake intocultured embryonic bones.Fine structure of matrix vesicles and their role incalcification，”Dev.Biol.34：211-227，1973.
6.Anderson et al.，“Impaired Calcification Around Matrix Vesicles ofGrowth Plate and Bone in Alkaline Phosphatase-Deficient Mice，”Am.J.Pathol.164：841-847，2004
7.Bernard，“Ultrastructural localization of alkaline phosphatase in initialintramembranous osteogenesis，”Clin.Orthop.218-25，1978.
8.DiMaura et al.，“Kinetic characterization of hypophosphatasiamutations with physiological substrates，”J.Bone Miner.Res.17：1383-1391，2002.
9.Farley et al.，“Effects of Tunicamycin，Mannosamine，and OtherInhibitors of Glycoprotein Processing on Skeletal Alkaline Phosphatase inHuman Osteoblast-Like Cells，”Calcified Tissue International 76：63-74，2005.
10.Fedde et al.，“Alkaline phosphatase knock-out小鼠recapitulate themetabolic and skeletal defects of infantile hypophosphatasia，”J.Bone Miner.Res.14：2015-2026，1999.
11.Greenberg et al.“A homoallelic Gly317-＞Asp mutation in ALPLcauses the perinatal(lethal)form of hypophosphatasia in Canadianmennonites，”Genomics 17：215-217，1993.
12.Harmey et al.，“Elevated skeletal osteopontin levels contribute to thehypophosphatasia phenotype in Akp2(-/-)mice，”J.Bone Miner.Res.21：1377-1386，2006.
13.Harmey et al.，“Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphateand Osteopontin by Akp2，Enppi，and Ank：An Integrated Model of thePathogenesis of Mineralization Disorders，”Am.J.Pathol.164：1199-1209，2004.
14.Hawrylak et al.，“The solubilization of tetrameric alkalinephosphatase from human liver and its conversion into various forms byphosphatidylinositol phospholipase C or proteolysis，”J.Biol.Chem.263：14368-14373，1988.
15.Henthom et al.，“Different missense mutations at thetissue-nonspecific alkaline phosphatase gene locus in autosomal recessivelyinherited forms of mild and severe hypophosphatasia，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9924-9928，1992.
16.Henthom et al.，“Missense mutations of the tissue-nonspecificalkaline phosphatase gene in hypophosphatasia，”Clin.Chem.38：2501-2505，1992.
17.Hessle et al.，“Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasmacell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bonemineralization，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9445-9449，2002.
18.Ikezawa，“Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-Anchored Proteins，”Biol.Pharm.Bull.25：409-417，2002.
19.Jansonius et al.，“Structure，evolution and action of vitaminB6-dependent enzymes，”Curr.Opin.Struct.Biol.8：759-769，1998.
20.Johnson et al.，“Matrix vesicle plasma cell membrane glycoprotein-1regulates mineralization by murine osteoblastic MC3T3 cells，”J.Bone Miner.Res.14：883-892，1999.
21.Mahmood et al.，“Selection of the First-Time Dose in Humans：Comparison of Different Approaches Based on Interspecies Scaling ofClearance，”J.Chn.Pharmacol.43：692-697，2003.
22.Meyer，“Can biological calcification occur in the presence ofpyrophosphate？”Arch.Biochem.Biophys.231：1-8，1984.
23.Millan，“Mammalian Alkaline Phosphatases.From Biology toApplications in Medicine and Biotechnology，”Wiley-VCH Verlag GmbH &Co.，Weinheim，Germany 1-322，2006.
24.Morris et al.，“Immunolocalization of alkaline phosphatase inosteoblasts and matrix vesicles of human fetal bone，”Bone Miner.19：287-98，1992.
25.Murshed et al.，“Unique coexpression in osteoblasts of broadlyexpressed genes accounts for the spatial restriction of ECM mineralization tobone.Genes Dev.19：1093-1104，2005.
26.Nasu et al.，“Aberrant interchain disulfide bridge oftissue-nonspecific alkalinephosphatase with an Arg433Cys substitutionassociated with severe hypophosphatasia，”FEBS Journal 273：5612-5624，2006.
27.Narisawa et al.，“Inactivation of two mouse alkaline phosphatasegenes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia，”Developmental Dynamics 208：432-446，1997.
28.Narisawa et al.，“Abnormal vitamin B6 metabolism in alkalinephosphatase knock-out小鼠causes multiple abnormalities，but not theimpaired bone mineralization，”J.Pathol.193：125-133，2001.
29.Nishioka et al.，“Enhancement of drug delivery to bone：Characterization of human tissue-non specific alkaline phosphatase taggedwith an acidic oligopeptide，”Mol.Genet.Metab.88：244-255，2006.
30.Nosjean et al.，“Human tissue non-specific alkaline phosphatases：Sugar-moiety-induced enzymic and antigenic modulations and geneticaspects，”Biochem.J.321：297-303，1997.
31.Oda et al.“A General Method for Rapid纯化of Soluble Versions ofGlycosyhosphatidylinositol-Anchored Proteins Expressed in Insect Cells：AnApplication for Human Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase，”J.Biochem.126：694-699，1999.
32.Rezende et al.，“Inorganic pyrophosphate-phosphohydrolytic activityassociated with rat osseous plate alkaline phosphatase，”Cell.Mol.Biol.44：293-302，1998.
33.Urlaub et al.，“Deletion of the Diploid Dihydrofolate-ReductaseLocus from Cultured Mammalian-Cells，”Cell33：405-412，1983.
34.Waymire et al.，“Mice Lacking Tissue NonspecificAlkaline-Phosphatase Die from Seizures Due to Defective Metabolism ofVitamin-B-6，”Nature Genet.11：45-51，1995.
35.Weiss et al.“A missense mutation in the human liver/bone/kidneyalkaline phosphatase gene causing a lethal form of hypophosphatasia，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7666-9，1988.
36.Weninger et al.，“Biochemical and Morphological Effects of HumanHepatic Alkaline-Phosphatase in A Neonate with Hypophosphatasia，”Acta.Paediatrica Scandinavica 154-160，1989.
37.Whyte，“Hypophosphatasia and the Role of Alkaline-Phosphatase inSkeletal Mineralization，”Endocrine Reviews 15：439-461，1994.
38.Whyte，“Alkaline Phosphatase：Placental and Tissue-nonspecificIsoenzymes hydrolyze Phosphoethanolamine，Inorganic Pyrophosphate，andPyridoxal 5′-phosphate，”J.Clin.Invest.95：1440-1445，1995.
39.Whyte，“Hypophosphatasia，”In The Metabolic and Molecular Basesof Disease，edn 8th，pp 5313-5329.Eds CL Scriver，AL Beaudet，WS Sly，DVaIIe & B Vogelstein.New York：McGraw-Hill Book Company，2001.
40.Whyte，“HyPophosphatasia.Nature′s window on alkaline phosphatasefunction in man，”In Principle of Bone Biology，edn Second，pp 1229-1248.Eds JP Bilezikian，LG Raisz & GA Rodan.London：Academic Press.2002.
41.Whyte et al.，“Marrow cell transplantation for infantilehypophosphatasia，”J.Bone Miner.Res.18：624-636，2003.
42.Whyte et al.，“Markedly Increased CirculatingPyridoxal-5′-Phosphate Levels in Hypophosphatasia-Alkaline-PhosphataseActs in Vitamin-B6 Metabolism，”J.Clin.Invest.76：752-756，1985.
43.Whyte et al.，“Enzyme replacement therapy for infantilehypophosphatasia attempted by intravenous infusions of alkalinephosphatase-rich Paget plasma：results in three additional patients，”J.Pediatr.105：926-933，1984.
44.Whyte et al.，“Infantile hypophosphatasia：enzyme replacementtherapy by intravenous infusion of alkaline phosphatase-rich plasma frompatients with Paget bone disease，”J.Pediatr.101：379-386，1982.
45.Zurutuza et al.，“Correlations of genotype and phenotype inhypophosphatasia，”Human Molecular Genetics 8：1039-1046，1999.
46.Beertsen et al.，“Root development in mice lacking functional tissuenon-specific alkaline phosphatase gene：Inhibition of acellular cementumformation，”J.Dent.Res.78：1221-1229，1999.
其它实施方式
在本说明书中提及的所有出版物、专利申请、和专利以引用方式结合于本文。
虽然已结合具体实施方式描述了本发明，但应当理解，它能够进一步改进。因此，本申请旨在涵盖整体上遵循本发明的原理的本发明的任何变动、应用、或改变，其包括本领域内的已知或习惯做法但偏离本发明揭露的内容。
Figure IDA00003027657100011
Figure IDA00003027657100021
Figure IDA00003027657100031
Figure IDA00003027657100041
Figure IDA00003027657100051
Figure IDA00003027657100061
Figure IDA00003027657100071
Figure IDA00003027657100081
Figure IDA00003027657100091
Figure IDA00003027657100101
Figure IDA00003027657100111
Figure IDA00003027657100121
Figure IDA00003027657100131
Figure IDA00003027657100141
Figure IDA00003027657100151
Figure IDA00003027657100161
Figure IDA00003027657100171
Figure IDA00003027657100181
Figure IDA00003027657100191
Figure IDA00003027657100201
Figure IDA00003027657100211
Figure IDA00003027657100221
Figure IDA00003027657100231
Figure IDA00003027657100241
Figure IDA00003027657100251
Figure IDA00003027657100281
Figure IDA00003027657100291
Figure IDA00003027657100321
Figure IDA00003027657100351
Figure IDA00003027657100361
Figure IDA00003027657100371
Figure IDA00003027657100391
Figure IDA00003027657100401
Figure IDA00003027657100411
Figure IDA00003027657100431
Figure IDA00003027657100441
Figure IDA00003027657100451
Figure IDA00003027657100461
Figure IDA00003027657100471

Claims (60)

1.一种治疗主体的基质矿化障碍的方法，所述方法包括给予所述主体治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X的多肽；以及
(b)药用赋形剂，
其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及所述多肽并不包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多肽不包含长于两个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述多肽不包含骨靶向部分。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含SEQ ID NO：15的氨基酸残基23-508。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列由SEQID NO：15的氨基酸残基23-512组成。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含SEQ ID NO：16的氨基酸残基18-498。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列由SEQID NO：16的氨基酸残基18-502组成。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述sALP的氨基酸序列由SEQID NO：5组成。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述Fc包含CH2域、CH3域和铰链区。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述Fc是免疫球蛋白的恒定域，所述免疫球蛋白选自由IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3和IgG-4组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述免疫球蛋白是IgG-1。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述Fc的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Fc的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述Fc的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：3具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述Fc的氨基酸序列包含SEQID NO：3。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述Fc的氨基酸序列由SEQ IDNO：3组成。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，Z不存在。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，Y是两个氨基酸的残基。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，Y是亮氨酸-赖氨酸。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，X不存在。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述多肽的氨基酸序列由SEQID NO：4组成。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述多肽被聚乙二醇化。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述多肽被糖基化。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物包含所述多肽的二聚物。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述药用赋形剂包括盐水。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，冷冻干燥所述药物组合物。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，以皮下、静脉内、口服、鼻、肌内、舌下、鞘内、或皮内途径给予所述药物组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，皮下给予所述药物组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，包括以约0.5mg/kg/天至约10mg/kg/天的剂量将所述药物组合物给予所述主体。
39.根据权利要求38所述的方法，包括以约2mg/kg/天至约3mg/kg/天的剂量将所述药物组合物给予所述主体。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，包括将所述药物组合物给予所述主体，一周一至七次。
41.根据权利要求40所述的方法，包括将所述药物组合物给予所述主体，一周三次。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，所述基质矿化障碍是低磷酸酯酶症。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述基质矿化障碍是婴儿低磷酸酯酶症(HPP)、童年期HPP、围产期HPP、成年HPP、或牙齿型低碱性磷酸酯酶症。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，给予治疗有效量的所述药物组合物来治疗低磷酸酯酶症(HPP)表型，所述低磷酸酯酶症(HPP)表型选自由以下组成的组：HPP相关的癫痫发作、乳牙的过早缺失、不完全骨矿化、无机焦磷酸盐(PPi)升高的血和/或尿水平、磷酸乙醇胺(PEA)升高的血和/或尿水平、吡哆醛5′-磷酸(PLP)升高的血和/或尿水平、不适当的体重增加、佝偻病、骨痛、焦磷酸钙二水合物晶体沉积、不发育、发育不全、和牙骨质的发育不良。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述不完全骨矿化是不完全股骨矿化、不完全胫骨矿化、不完全跖骨矿化、或不完全肋骨矿化。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中，所述主体是人。
47.一种药物组合物，包含：
(a)多肽，所述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；以及
(b)药用赋形剂，
其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及所述多肽并不包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被配制成用于治疗主体的基质矿化障碍。
49.一种治疗主体的基质矿化障碍的方法，所述方法包括给予所述主体治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；以及
(b)药用赋形剂，
其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及所述分离的核酸不编码包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区的氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，以慢病毒载体，将所述分离的核酸给予所述主体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，以约0.1mg至约10mg的剂量，将所述分离的核酸给予所述主体。
52.一种药物组合物，配制成用于治疗主体的基质矿化障碍，所述药物组合物包含：
(a)编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含结构Z-sALP-Y-Fc-X或结构Z-Fc-Y-sALP-X；以及
(b)药用赋形剂，
其中sALP是碱性磷酸酶的胞外域；X、Y、和Z各自不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；以及所述分离的核酸不编码包含长于三个连续天冬氨酸或谷氨酸残基的聚天冬氨酸或聚谷氨酸区的氨基酸序列。
53.根据权利要求52所述的药物组合物，包含重组表达载体，所述重组表达载体包含所述分离的核酸。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中，所述重组表达载体是慢病毒载体。
55.一种用权利要求54所述的载体转化或转染的分离的重组宿主细胞。
56.一种生产权利要求47所述的多肽的方法，包括在培养基中在适合进行所述多肽的表达的条件下培养权利要求55所述的宿主细胞以及从所述培养基中回收所述多肽。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述宿主细胞是L细胞、C127细胞、3T3细胞、CHO细胞、BHK细胞、或COS-7细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述宿主细胞是CHO细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHO-DG44细胞。
60.一种试剂盒，包括：
(a)根据权利要求47-48或52-54中任一项所述的药物组合物，以及
(b)将所述药物组合物给予主体以治疗基质矿化障碍的说明书。
CN201180032899XA 2010-04-30 2011-04-29 用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒 Pending CN103153344A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32987710P 2010-04-30 2010-04-30
US61/329,877 2010-04-30
PCT/CA2011/050258 WO2011134084A1 (en) 2010-04-30 2011-04-29 Methods, compositions, and kits for the treatment of matrix mineralization disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103153344A true CN103153344A (zh) 2013-06-12

Family

ID=44860717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180032899XA Pending CN103153344A (zh) 2010-04-30 2011-04-29 用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9988620B2 (zh)
EP (1) EP2563406A4 (zh)
JP (1) JP5986986B2 (zh)
KR (1) KR20130118203A (zh)
CN (1) CN103153344A (zh)
AU (1) AU2011245005A1 (zh)
BR (1) BR112012027765A2 (zh)
CA (1) CA2797865A1 (zh)
CO (1) CO6660466A2 (zh)
EA (1) EA201291138A1 (zh)
IL (1) IL222695A0 (zh)
MX (1) MX2012012643A (zh)
SG (1) SG185079A1 (zh)
WO (1) WO2011134084A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107405390A (zh) * 2014-12-05 2017-11-28 阿雷克森制药公司 用重组碱性磷酸酶治疗癫痫
CN108350440A (zh) * 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
CN109061129A (zh) * 2018-06-08 2018-12-21 中山大学附属口腔医院 钛表面纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液
CN109152820A (zh) * 2016-04-01 2019-01-04 阿雷克森制药公司 用碱性磷酸酶治疗肌肉无力
CN110719786A (zh) * 2017-03-31 2020-01-21 阿雷克森制药公司 用于治疗成人和青少年的低磷酸酯酶症(hpp)的方法
CN111778228A (zh) * 2014-01-24 2020-10-16 安-法玛公司 嵌合型碱性磷酸酶样蛋白

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005235635B2 (en) 2004-04-21 2010-11-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
US20070081984A1 (en) 2005-10-11 2007-04-12 Shunji Tomatsu Compositions and methods for treating hypophosphatasia
EP2563406A4 (en) 2010-04-30 2013-11-13 Alexion Pharma Internat Sarl METHOD, COMPOSITIONS AND KITS FOR TREATING MATRIX MINERALIZATION DISORDERS
AU2011350066A1 (en) 2010-12-27 2013-07-11 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
JP6868561B2 (ja) * 2015-01-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法
EP3355904A4 (en) * 2015-09-28 2019-06-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA
US11400140B2 (en) 2015-10-30 2022-08-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
EP3592372A4 (en) * 2017-03-09 2021-01-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. GLYCOPROTEIN MANUFACTURING PROCESS
BR112020007820A2 (pt) * 2017-10-26 2020-10-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. formulações compreendendo glucocerebrosidase e isofagomina
WO2019139891A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Synthetic Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders
CA3094173A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Synthetic Biologics, Inc. Intestinal alkaline phosphatase formulations
WO2019183209A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Synthetic Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
AU2020398898A1 (en) * 2019-12-09 2022-07-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
AU2021337652A1 (en) * 2020-09-04 2023-03-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating bone mineralization disorders
WO2022173987A1 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138131A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Enobia Pharma Inc. Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU662155B2 (en) 1991-05-10 1995-08-24 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Targeted delivery of bone growth factors
WO1995005455A1 (en) 1993-08-13 1995-02-23 Rijksuniversiteit Te Groningen Pharmaceutical composition comprising phosphatase or a derivative thereof
JPH0870875A (ja) 1994-09-05 1996-03-19 Tosoh Corp 組換えアルカリフォスファタ−ゼ融合タンパク質
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
WO1998035703A2 (en) 1997-02-14 1998-08-20 The Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for delivery of therapeutic agents to bone tissue employing conjugates of negatively charged peptide oligomers with therapeutic agents
CA2245903A1 (en) 1998-09-28 2000-03-28 Mcgill University Use of pex in the treatment of metabolic bone diseases
CA2262056A1 (en) 1999-02-24 2000-08-24 Guy Boileau Composition, methods and reagents for the synthesis of a soluble form of human pex
AU772074B2 (en) 1999-04-28 2004-04-08 Vectramed, Inc. Enzymatically activated polymeric drug conjugates
JP2000327583A (ja) 1999-05-17 2000-11-28 Medei Sci Puraningu:Kk 骨指向性ホルモン誘導体
ES2284545T3 (es) 1999-11-16 2007-11-16 Genzyme Corporation Vectores y transgenes con elementos reguladores para la administracion de genes del higado.
WO2001044257A1 (en) 1999-12-17 2001-06-21 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Proton pump inhibitors
ATE341631T1 (de) 2000-08-23 2006-10-15 Enobia Pharma Inc Methode und zusammensetzung zur förderung von osteogenese
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
WO2002092020A2 (en) 2001-03-23 2002-11-21 The Burnham Institute Compositions and methods for modulating bone mineral deposition
US7888372B2 (en) 2001-03-23 2011-02-15 National Institutes Of Health (Nih) Compositions and methods for modulating bone mineral deposition
DE60233047D1 (de) 2001-05-14 2009-09-03 Gbp Ip Llc Lentivirale vektoren kodierend für gerinnungsfaktoren für die gentherapie
US20030158132A1 (en) 2002-01-22 2003-08-21 Genvec, Inc. Method for enhancing bone density or formation
CA2433479A1 (en) 2002-07-22 2004-01-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugate of a tissue non-specific alkaline phosphatase and dextran, process for its production and use thereof
JP2007501021A (ja) 2003-05-30 2007-01-25 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 遺伝子操作された定常領域を含む、抗体および融合タンパク質
US7431915B2 (en) 2003-10-31 2008-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
AU2004282984B2 (en) 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
AU2005235635B2 (en) 2004-04-21 2010-11-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
US20070081986A1 (en) 2005-10-07 2007-04-12 Shunji Tomatsu Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids
US7863238B2 (en) 2004-06-10 2011-01-04 Saint Louis University Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids
US20070081984A1 (en) 2005-10-11 2007-04-12 Shunji Tomatsu Compositions and methods for treating hypophosphatasia
US7972593B2 (en) 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone
US20090142347A1 (en) 2004-09-29 2009-06-04 The Burnham Institute For Medical Research Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP): a Therapeutic Target for Arterial Calcification
JP2008521575A (ja) 2004-12-01 2008-06-26 ジェンザイム・コーポレイション 肝臓を標的とした遺伝物質の送達方法
US20070042957A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Type v phosphodiesterase inhibitors and natriuretic polypeptides
US7803901B2 (en) 2005-09-16 2010-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polypeptides with natriuresis activity
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
US8784833B2 (en) * 2006-06-27 2014-07-22 Saint Louis University Prenatal enzyme replacement therapy for hypophosphatasia
JP2010501026A (ja) 2006-06-30 2010-01-14 インターフェース バイオロジクス，インコーポレーテッド 生体応答性ポリマー
US7825093B2 (en) 2006-10-25 2010-11-02 Amgen Inc. Methods of using OSK1 peptide analogs
US20080181903A1 (en) 2006-12-21 2008-07-31 Pdl Biopharma, Inc. Conjugate of natriuretic peptide and antibody constant region
EP2162464A1 (en) 2007-06-06 2010-03-17 Boehringer Ingelheim International GmbH Natriuretic fusion proteins
CA2696113A1 (en) 2007-08-10 2009-04-02 Burnham Institute For Medical Research Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (tnap) activators and uses thereof
EP2187953A2 (en) 2007-09-11 2010-05-26 Mondobiotech Laboratories AG Use of a peptide as a therapeutic agent
EP3363453A1 (en) * 2008-06-26 2018-08-22 Acceleron Pharma Inc. Soluble actriia as activin-actriia antagonist for use in treating anemia or bone-related disorders
CA2758581C (en) 2009-05-20 2022-06-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Variants of c-type natriuretic peptide
EP2563406A4 (en) 2010-04-30 2013-11-13 Alexion Pharma Internat Sarl METHOD, COMPOSITIONS AND KITS FOR TREATING MATRIX MINERALIZATION DISORDERS

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138131A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Enobia Pharma Inc. Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111778228A (zh) * 2014-01-24 2020-10-16 安-法玛公司 嵌合型碱性磷酸酶样蛋白
CN107405390A (zh) * 2014-12-05 2017-11-28 阿雷克森制药公司 用重组碱性磷酸酶治疗癫痫
CN108350440A (zh) * 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
CN109152820A (zh) * 2016-04-01 2019-01-04 阿雷克森制药公司 用碱性磷酸酶治疗肌肉无力
CN110719786A (zh) * 2017-03-31 2020-01-21 阿雷克森制药公司 用于治疗成人和青少年的低磷酸酯酶症(hpp)的方法
CN109061129A (zh) * 2018-06-08 2018-12-21 中山大学附属口腔医院 钛表面纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液
CN109061129B (zh) * 2018-06-08 2022-11-29 中山大学附属口腔医院 钛表面纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液

Also Published As

Publication number Publication date
EP2563406A4 (en) 2013-11-13
IL222695A0 (en) 2012-12-31
BR112012027765A2 (pt) 2019-09-24
MX2012012643A (es) 2013-01-22
AU2011245005A1 (en) 2012-11-22
JP5986986B2 (ja) 2016-09-06
KR20130118203A (ko) 2013-10-29
JP2013525379A (ja) 2013-06-20
US9988620B2 (en) 2018-06-05
WO2011134084A1 (en) 2011-11-03
CA2797865A1 (en) 2011-11-03
WO2011134084A8 (en) 2012-12-06
US20130108635A1 (en) 2013-05-02
EA201291138A1 (ru) 2013-05-30
EP2563406A1 (en) 2013-03-06
SG185079A1 (en) 2012-12-28
CO6660466A2 (es) 2013-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103153344A (zh) 用于治疗基质矿化障碍的方法、组合物、和试剂盒
EP2662448B1 (en) Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof
US11224638B2 (en) Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
EP2348114B1 (en) Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
Rowe The chicken or the egg: PHEX, FGF23 and SIBLINGs unscrambled
Wilson et al. Glycosaminoglycan-mediated loss of cathepsin K collagenolytic activity in MPS I contributes to osteoclast and growth plate abnormalities
CN104145015A (zh) 靶向的溶酶体酶化合物
CN103479994A (zh) Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
JP2023504208A (ja) アルカリホスファターゼポリペプチド及びその使用方法
PT1018559E (pt) Enzimas fosfodiesterases
EP2059122B1 (en) Methods and compositions related to apobec-1 expression
Yang et al. Identification and characterization of a novel heparan sulfate-binding domain in Activin A longest variants and implications for function
JP2018538008A (ja) リソソーム酵素の取り込みを中和する抗体または他の因子の検出のための細胞ベースアッセイ
CN116710122A (zh) Enpp1缺乏症和abcc6缺乏症的治疗
AU2013203875A1 (en) Bone Targeted Alkaline Phosphatase, Kits and Methods of Use Thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: RENASCENCE HOLDING PRIVATE LIMITED COMPANY

Free format text: FORMER OWNER: ALEXION PHARMACEUTICAL INTERNATIONAL SARL

Effective date: 20140126

Owner name: RENASCENCE PHARMACEUTICAL HOLDING CORP.

Free format text: FORMER OWNER: RENASCENCE HOLDING PRIVATE LIMITED COMPANY

Effective date: 20140126

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140126

Address after: Bermuda Hamilton

Applicant after: UPS Pharmaceutical Holdings Ltd.

Address before: Amsterdam, The Netherlands

Applicant before: Credit Holdings Pte. Ltd.

Effective date of registration: 20140126

Address after: Amsterdam, The Netherlands

Applicant after: Credit Holdings Pte. Ltd.

Address before: Lausanne

Applicant before: ENOBIA PHARMA Inc.

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130612