CN103153308A - Trpa1受体拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的化合物及其药用盐、对映异构体或者它们的混合物，含有所述化合物、对映异构体或者其混合物的药物组合物，制备所述化合物、对映异构体或者其混合物的方法，所述化合物、对映异构体或者其混合物的用途，用于治疗疼痛和其它病症的含有所述化合物、对映异构体或者其混合物的药物，以及使用所述化合物、对映异构体或者其混合物治疗疼痛和其它病症的方法。
Figure DDA00003042276900011

Description

TRPA1受体拮抗剂
技术领域
本发明涉及离子通道的瞬时受体电位(TRP)家族的拮抗剂。本发明还提供了包含瞬时拮抗剂的组合物以及其治疗离子通道瞬时受体电位(TRP)家族介导的疾病的方法。具体地，本发明涉及用于治疗疼痛和其它特异性病症的非选择性阳离子通道TRPA1拮抗剂化合物。
背景技术
离子通道的瞬时受体电位(TRP)家族通常作为多重化学和物理刺激(温度、气味、味道和有毒化学品)的感受器。具体地，所述非选择性阳离子通道TRPA1(瞬时受体电位锚蛋白重复序列1)，最初克隆为锚蛋白样蛋白(Jaquemar et al 1999,J Biol Chem274:7325-7333)，其被多种刺激性和促疼痛化合物激活(Bandell et al 2004,Neuron41:849-857)。对于TRPA1作为药物靶标的最新评论已经由Rech et al.(Future Med.Chem.2010:843-838)和Baraldiet al(J.Med.Chem.2010,5085-2107)公开。TRPA1在外周神经***中的C纤维伤害性感受器的亚群中高度表达(Kobayashi et al 2005,J Comp Neurol493(4):596-606)。当激活的TRPA1容许阳离子(主要是Ca2+和Na+)由特别的细胞环境传导至细胞中，由此将膜电位去极化且影响初级传入中的钙稳态。去极化初级神经末梢导致动作电位开通以及由此在男性和啮齿动物试验模型中的增强的痛觉和痛觉过敏(Jiang and Gebhart 1998,Pain 77(3):305-13;Cervero and Laird 1996,Pain 68(1):13-23)。在芥子油中的刺激性成分异硫氰酸丙烯酯(AITC)浓度依赖性地激活在钠电流和钙内流的体外测量的TRPA1。此外，AITC也刺激了小直径传入神经纤维(Reeh 1986,Brain Res 384:42-50)且AITC的实际局部应用在男性中诱导疼痛和痛觉过敏(Namer et al 2005,Neuroreport16(9):955-959)。最近，将TRPA1敲除(KO)小鼠描述为具有丧失的AITC敏感性且展现出严重损伤的缓激肽疼痛响应信号传导(Kwan 2006,Neuron50(2):277-289;Bautista2006,Cell 124(6):1269-1282)。***，其为甲醇、水和甲醛的混合物，其为广泛使用的用于评价体内止痛化合物的啮齿动物模型。TRPA1被甲醛体外激活且最近显示了TRPA1KO小鼠几乎具有了它们对于取消的***/甲醛的响应(McNamara et al 2007,Proc NatlAcad Sci USA 104(33):13525-13530)。Hydra Biosciences专有的化合物(HC030031)为体外TRPA1拮抗剂且已经显示了以剂量依赖性方式减轻***诱导的疼痛行为(McNamara2007,Proc Natl Acad Sci USA104(33):13525-13530和WO2007/073505A2)。具有对TRPA1的体外作用的Abbott专有的化合物(US2009/0176883和McGaraughty et al.,Molecular Pain20106:14)显示出在大鼠骨关节炎疼痛模型中的体内作用，且众多Glenmark专有的化合物(US2009/0325987)显示出在若干体内疼痛模型中的体内作用。还显示出TRPA1突变引起FEPS(“Familial Episodic Pain Syndrome”,Kremeyer et al,Neuron2010,66:671-680)。因此表明TRPA1钙和钠内流的体外抑制将确定化合物用作为体内镇痛药的倾向。因此本发明的目标是提供新的、改善的且有效的镇痛药。
发明内容
本发明描述了非选择性阳离子通道TRPA1拮抗剂。所述的拮抗剂可用于治疗疼痛和其它病症。由TRPA1拮抗剂介导的医学病症包括哮喘、百日咳和尼古丁上瘾。
附图说明
图1显示了实施例6的化合物的X-射线粉末衍射(XRPD)图。
图2显示了化合物的VCD光谱。
具体实施方式
因此本发明提供了非选择性阳离子通道TRPA1的新的拮抗剂。所述新的拮抗剂可用于治疗疼痛等。由TRPA1拮抗剂介导的其它医学病症包括哮喘、百日咳和尼古丁上瘾。
在第一方面，本发明提供了式(I)的化合物、其药用盐、对映异构体或者它们的混合物：
Figure BDA00003042276700031
应该理解的是本发明的化合物含有一个手性中心，所述化合物可以对映异构体形式存在，且可分离为对映异构体形式，或者作为外消旋混合物形式。本发明包括式(I)的化合物的任何可能的对映异构体、外消旋化合物或者其混合物。本发明化合物的旋光形式可通过例如外消旋化合物的色谱分离、由旋光起始物质的合成或者不对称合成(根据本申请此后描述的操作)来制备。
本发明的一个实施方案为具有以下结构的式(I)的化合物的(R)对映异构体：
还应该理解的是本发明的化合物可以溶剂化物例如水合物以及非溶剂化物形式存在。还应该理解的是本发明涵盖式(I)的化合物的所有所述溶剂化物形式。
在本发明的范围内还包括式(I)的化合物的盐。一般而言，本发明化合物的药用盐可使用本领域熟知的标准操作来获得，例如通过使充分碱性的化合物例如烷基胺与适当的酸例如HCl或者乙酸反应得到生理学可接受的阴离子。也可通过如下制备相应的碱金属(诸如钠、钾或者锂)或者碱土金属(诸如钙)盐：将具有适当酸性质子的本发明化合物诸如羧酸或者苯酚用一当量的碱金属或者碱土金属氢氧化物或者醇盐(诸如乙醇化物或者甲醇化物)或者适当碱性的有机胺(诸如胆碱或者葡甲胺)在水性介质中处理，随后进行常规纯化技术处理。
在一个实施方案中，上述式(I)的化合物可转化为其药用盐或者溶剂化物，特别是酸加成盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲磺酸盐或者对甲苯磺酸盐。
认为本发明化合物用于疗法中，特别是用于治疗以下疾病的疗法中：哮喘、百日咳(持续咳嗽)、尼古丁上瘾以及各种疼痛病症包括但不限于急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛以及与癌症相关的疼痛。
在用于温血动物诸如人类中的疗法的用途中，本发明化合物可以常规药物组合物的形式通过包括下述的任何途径来给药：口服、肌内、皮下、局部、鼻内、腹膜内、胸腔内、静脉内、硬膜外、鞘内、经皮、脑室内给药以及通过注射至关节来给药。
在本发明的一个实施方案中，给药途径可为静脉内、局部、皮内或者肌内给药。
当确定最适于特定患者的个体给药方案和剂量水平时，剂量将取决于给药途径、疾病的严重性、患者的年龄和体重以及主治医师通常所考虑的其它因素。
本发明提供了如前定义的式(I)的化合物或者其药用盐或者溶剂化物在制备用于疗法的药物中的用途。
在具体医学适应症中，本发明提供了式(I)的化合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途：哮喘、百日咳(持续咳嗽)、尼古丁上瘾以及各种疼痛病症诸如急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛以及与癌症相关的疼痛。
本发明还提供了式(I)的化合物，其用于治疗哮喘、百日咳(持续咳嗽)、尼古丁上瘾以及各种疼痛病症诸如急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛以及与癌症相关的疼痛。
本发明的另一方面为治疗患有如上讨论的任一种病症的受试者的方法，其中向需要上述治疗的患者给予有效量的上述式(I)的化合物或者其药用盐或者溶剂化物。
因此，本发明提供了治疗如上阐述的具体医学适应症的方法，其中向需要上述治疗的患者给予有效量的上述式(I)的化合物或者其药用盐或者溶剂化物。
本发明还提供了式(I)的化合物，其用作疗法中的药物。
在说明书的上下文中，术语"治疗"还包括"预防"，除非存在相反的特别说明。术语"治疗的"和"治疗性"应该如此理解。本发明上下文中的术语"治疗"还涵盖给予有效量的本发明化合物以缓和预先存在的疾病状态、急性或者慢性或者复发的病症。该定义还涵盖用于预防复发病症的预防性疗法以及用于慢性病症的持续疗法。
式(I)的化合物具有作为药物的活性，特别是作为TRPA1的抑制剂(拮抗剂)。更具体地，本发明的TRPA1抑制剂用于治疗特别是缓解各种疼痛病症诸如急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛以及与癌症相关的疼痛。
式(I)的化合物也可用于治疗眼部病症诸如视网膜病变、糖尿病性视网膜病和青光眼以及治疗与所述病症相关的疼痛。
式(I)的化合物也可用于眼部治疗或者用作为“控暴剂”诸如CS或者CR的抵消剂，以及用于治疗患有所述“控暴剂”效应的患者，其通过给予治疗有效量的式(I)的化合物来治疗。
对于上面提及的治疗用途，所给予的剂量当然取决于采用的化合物、给药方式、预期治疗和指出的病症而变化。本发明化合物的每日剂量的范围可为0.05mg/kg至100mg/kg。
式(I)的化合物及其药用盐可独立使用，但通常以药物组合物的形式给药，其中式(I)的化合物/盐(活性成分)与药用辅料、稀释剂或者载体缔合。用于选择和制备适当的药物制剂的常规方法描述于例如"Pharmaceuticals-TheScience of Dosage Form Designs",M.E.Aulton,Churchill Livingstone,1988中。
取决于给药方式，药物组合物优选包含0.05至99%w(重量百分数)的活性成分，更优选包含0.05至80%w、更优选包含0.10至70%w且甚至更优选包含0.10至50%w的活性成分，所有重量百分数基于总的组合物来计。
本发明还提供了药物组合物，包含如上定义的式(I)的化合物或者其药用盐以及药用辅料、稀释剂或者载体。
本发明还提供了用于制备本发明药物组合物的方法，其包括使如上定义的式(I)的化合物或者其药用盐与药用辅料、稀释剂或者载体混合。
药物组合物可以例如乳膏剂、溶液剂或者混悬剂的形式局部(例如皮肤)给药；或者全身给药，例如以片剂、胶囊剂、糖浆剂、粉末剂或者颗粒剂的形式通过口服给药；或者以溶液剂或者混悬剂的形式通过肠胃外给药；或者通过皮下给药；或者以栓剂的形式通过直肠给药；或者经皮给药。
对于口服给药，本发明化合物可与辅料或者载体混合，所述辅料或者载体例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇；淀粉，例如马铃薯淀粉、玉米淀粉或者支链淀粉；纤维素衍生物；粘合剂，例如明胶或者聚乙烯吡咯烷酮；和/或者润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、聚乙二醇、蜡、石蜡等，然后将其压制为片剂。如果需要包衣片剂，可将如上所述制备的片心使用浓缩糖溶液来包衣，所述浓缩糖溶液可含有例如***胶、明胶、滑石和二氧化钛。可选择地，所述片剂可使用溶于易挥发的有机溶剂中的适当聚合物来包衣。
对于制备软明胶胶囊剂，本发明化合物可与例如植物油或者聚乙二醇混合。硬明胶胶囊剂可使用对于片剂的如上提及的赋形剂而含有化合物颗粒。本发明化合物的液体或者半固体制剂也可填充至硬明胶胶囊剂中。
对于口服应用的液体制剂可为糖浆剂或者混悬剂的形式，例如含有本发明化合物的溶液剂，所述平衡为糖以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物。任选地，所述液体制剂可含有着色剂、矫味剂、糖精和/或者羧甲基纤维素作为增稠剂或者本领域技术人员已知的其它赋形剂。
本发明化合物也可与用于治疗上述病症的其它化合物组合给药。
在另外的实施方案中，本发明化合物或者包含式(I)的化合物的药物组合物或者制剂与选自下述的至少一种其它药物活性化合物共同、同时、先后或者分给药：
(i)抗抑郁药，包括例如阿戈美拉汀、阿米替林、阿莫沙平、丁氨苯丙酮、西酞普兰、氯米帕明、地昔帕明、多塞平、度洛西汀、百忧解(elzasonan)、依他普仑、氟伏沙明、氟西汀、吉哌隆、丙米嗪、伊沙匹隆、马普替林、去甲替林、萘法唑酮、帕罗西丁、苯乙肼、普罗替林、ramelteon、瑞波西汀、罗巴佐坦、舍曲林、***、thionisoxetine、反苯环丙胺、曲唑酮、曲米帕明、文拉法辛及它们的等价物以及药物活性异构体和代谢物；
(ii)非典型抗精神病药，包括例如喹硫平及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(iii)抗精神病药物，包括例如氨磺必利(amisulpride)、阿立哌唑(aripiprazole)、阿莫沙平(asenapine)、benzisoxidil、bifeprunox、卡马西平(carbamazepine)、氯氮平(clozapine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、debenzapine、双丙戊酸钠(divalproex)、度洛西汀(duloxetine)、艾司佐匹克隆(eszopiclone)、氟哌啶醇(haloperidol)、伊潘立酮(iloperidone)、拉莫三嗪(lamotrigine)、洛沙平(loxapine)、美索达嗪(mesoridazine)、奥氮平(olanzapine)、paliperidone、哌拉平(perlapine)、奋乃静(perphenazine)、吩噻嗪(phenothiazine)、苯基丁基哌啶(phenylbutlypiperdine)、匹莫齐特(pimozide)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、利培酮(risperidone)、舍吲哚(sertindole)、舒必利(sulpiride)、舒普罗酮(suproclone)、舒立克隆(suriclone)、硫利达嗪(thioridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、曲美托嗪(trimetozine)、丙戊酸盐(valproate)、丙戊酸(valproicacid)、佐匹克隆(zopiclone)、佐替平(zotepine)、齐拉西酮(ziprasidone)和这些药物的等同物及药物活性异构体和代谢物；
(iv)抗焦虑症药物，包括例如阿奈螺酮(alnespirone)、阿扎哌隆类(azapirones)、苯并二氮
Figure BDA00003042276700081
类(benzodiazepines)、巴比妥酸盐类(barbiturates)如阿地***(adinazolam)、阿普***(alprazolam)、半拉西泮(balezepam)、苯他西泮(bentazepam)、溴西泮(bromazepam)、溴替***(brotizolam)、丁螺环酮(buspirone)、氯硝西泮(clonazepam)、氯卓酸钾(clorazepate)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、环丙西泮(cyprazepam)、***(diazepam)、苯海拉明(diphenhydramine)、艾司***(estazolam)、非诺班(fenobam)、氟硝西泮(flunitrazepam)、氟西泮(flurazepam)、膦西泮(fosazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、氯甲西泮(lormetazepam)、甲丙氨酯(meprobamate)、咪达***(midazolam)、硝西泮(nitrazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、普拉西泮(prazepam)、夸西泮(quazepam)、瑞氯西泮(reclazepam)、曲卡唑酯(tracazolate)、曲匹泮(trepipam)、替马西泮(temazepam)、***仑(triazolam)、乌达西泮(uldazepam)、唑拉西泮(zolazepam)和这些药物的等同物及药物活性异构体和代谢物；
(v)抗惊厥剂药，包括例如卡马西平、氯硝西泮、乙琥胺、非尔氨酯、磷苯妥英、加巴喷丁、拉科酰胺(lacosamide)、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、***、苯妥英、普瑞巴林(pregabaline)、卢非酰胺、托吡酯、丙戊酸盐、vigabatrine、唑尼沙胺及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(vi)治疗阿尔茨海默氏病的药物，包括例如多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏、美金刚及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(vii)帕金森病治疗剂，包括例如丙炔***、左旋多巴、罗匹尼罗、普拉克索、MAOB抑制剂诸如司来吉兰和雷沙吉兰、comP抑制剂诸如托卡朋、A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、多巴胺激动剂、神经元一氧化氮合酶抑制剂，及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(viii)偏头痛治疗剂，包括例如阿莫曲坦、金刚烷胺、溴隐亭、布他比妥、卡麦角林、氯醛比林、氢化麦角胺、依来曲普坦、夫罗曲普坦、麦角乙脲、那拉曲坦、培高利特、苯噻啶(pizotiphen)、普拉克索、利扎曲普坦、罗匹尼罗、舒马普坦、佐米曲坦、佐米曲普坦(zomitriptan)及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(ix)中风治疗剂，包括例如使用如下的血栓溶解疗法：活化酶(activase)和去氨普酶、阿昔单抗、胞磷胆碱、氯吡格雷、依替巴肽、米诺环素及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(x)尿失禁治疗剂，包括例如达非那新(darafenacin)、黄酮哌酯(falvoxate)、奥昔布宁(oxybutynin)、丙哌维林(propiverine)、罗巴佐坦(robalzotan)、索非那新(solifenacin)、托特罗定(tolterodine)，以及这些药物的等同物及药物活性异构体和代谢物；
(xi)神经性疼痛治疗剂，包括例如利多卡因、辣椒辣素以及抗惊厥剂(诸如加巴喷丁、普瑞巴林)和抗抑郁药(诸如度洛西汀、文拉法辛、阿米替林、氯米帕明)及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(xii)伤害性疼痛治疗剂，诸如对乙酰氨基酚、NSAIDS和考昔类(coxibs)药物诸如塞来考昔、艾托考昔、罗美昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、双氯芬酸、洛索洛芬、萘普生、酮洛芬、布洛芬、纳布美通、美洛昔康、吡罗昔康以及阿片样药物诸如***、羟考酮、丁丙诺啡、曲马多及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(xiii)失眠治疗剂，包括例如阿戈美拉汀、阿洛巴比妥、阿洛米酮、异戊巴比妥、苯佐他明、仲丁巴比妥、卡普脲、水合氯醛、氯哌喹酮、氯乙双酯、环庚吡喹醇、乙氯维诺、依托咪酯、格鲁米特、哈拉西泮、羟嗪、甲氯喹酮、褪黑激素、甲苯比妥、甲喹酮、咪达氟、尼索氨酯、戊巴比妥、***、丙泊酚、ramelteon、咯来米特、三氯福司、司可巴比妥、扎来普隆、唑吡坦及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物；
(xiv)情绪稳定剂，包括例如卡马西平、双丙戊酸钠、加巴喷丁、拉莫三嗪、锂剂、奥氮平、喹硫平、丙戊酸盐、丙戊酸、维拉帕米及它们的等同物以及药物活性异构体和代谢物。
所述组合产品采用本申请所述的剂量范围内的本发明化合物以及认可的剂量范围和/或者在公开参考文献中所述的剂量内的其它一种或者多种药用活性化合物。
制备方法、试验操作
一般方法
使用的所有溶剂为分析等级且可商购得到的无水溶剂为反应所通常使用的。反应典型地在氮气或者氩气的惰性气氛下进行。
1H、19F和13C NMR光谱记录于配备有具有Z-梯度的5mm BBO探头的Varian Unity+400核磁共振波谱仪、或者配备有5mm BBI探头的Varian Gemini300核磁共振波谱仪、或者配备有具有Z-梯度的60μl双重反向流动探头的Bruker Avance 400核磁共振波谱仪、或者配备有Varian400ATB PFG探针的Varian Mercury Plus 400核磁共振波谱仪、或者配备有具有Z-梯度的4-核探头的Bruker DPX400核磁共振波谱仪或者配备有具有Z-梯度的5mmBBI探头的Bruker Avance 600核磁共振波谱仪上。除非在实施例中特别说明，否则光谱在400MHz(质子)、376MHz(19F)和100MHz记录(13C)。
可选择地，1H和13C NMR光谱在400MHz(质子)以及100MHz(13C)记录于配备有Varian 400ATB PFG探针的Varian Mercury Plus 400核磁共振波谱仪上。
使用下述参考信号：DMSO-d6的中间线δ2.50(1H),δ39.51(13C)；CD3OD的中间线δ3.31(1H)或者δ49.15(13C)；CDCl3δ7.26(1H)以及CDCl3的中间线δ77.16(13C)(除非另作说明)。核磁共振光谱由低场至高场报道。可选择地，所有氘代溶剂通常含有0.03%至0.05%v/v四甲基甲硅烷，其用作为参考信号(针对1H和13C设置在δ0.00)。
质谱记录于Waters LCMS上，其包括Alliance2795(LC)、Waters PDA2996和ZQ单四极质谱仪或者Waters Micromass ZQ检测器(120°C)。所述质谱仪配备有以正离子或负离子模式操作的电喷射离子源(ESI)。毛细管电压为3kV且锥孔电压为30V。质谱仪在m/z100-700或者m/z100-1000之间扫描，扫描时间为0.3s。在由ScantecLab获得的Waters X-Terra MS C8(3.5μm,50或者100mm x2.1mm i.d.)或者ACE3AQ(100mm x2.1mm i.d.)上进行分离。流速分别调节为1.0或者0.3mL/min。柱温设置为40°C。应用线性梯度，使用中性或者酸性流动相***，起始于100%A(A:95:5 10mMNH4OAc:MeCN，或者95:5 8mM HCOOH:MeCN)，结束于100%B(MeCN)。
质谱也记录于Waters LCMS上，其包括Alliance2690分离模块、Waters2487 Dual 1吸光度检测器(220和254nm)以及Waters ZQ单四极质谱仪。所述质谱仪配备有以正离子或负离子模式操作的电喷射离子源(ESI)。毛细管电压为3kV且锥孔电压为30V。质谱仪在m/z 97-800之间扫描，扫描时间为0.3或者0.8s。在Chromolith Performance RP-18e(100x4.6mm)上进行分离。应用线性梯度，起始于95%A(A:0.1%HCOOH(aq.))，结束于100% B(MeCN)，5分钟。流速：2.0mL/min。
可选择地，Ultra Pressure(UP)LCMS分析在Waters Acquity UPLC***上进行，其包括Acquity自动进样器、Acquity样品组织器、Acquity柱管理器、Acquity二元溶剂管理器、Acquity UPLC PDA检测器和Waters SQ检测器。所述质谱仪配备有以正离子或负离子模式操作的电喷射离子源(ESI)。毛细管电压为3kV且锥孔电压为30V。质谱仪在m/z100-600之间扫描，扫描时间为0.105s二极管阵列检测器在200-400nm扫描。柱管理器的温度设置为60°C。在Acquity柱(UPLC BEH,C181.7μM)上进行分离，流速为0.5mL/min。应用线性梯度，起始于100%A(A:10mM NH4OAc在5%MeCN中的溶液)，1.3分钟后结束于100%B(B:MeCN)，然后100%B，0.6分钟。ESpos/ESneg,m/z100-600。
化合物鉴定也在由Agilent Technologies提供的GC-MS***上进行，其包括6890N G1530N GC、G2614A自动进样器、G2613A注射器和G2589N质谱仪。使用的柱为VF-5MS,ID0.25mm x30m,0.25μm(Varian Inc.)。采用线性温度梯度，起始于70°C(保持1分钟)且结束于300°C(保持1分钟)，25°C/min。所述质谱仪配备有化学电离(CI)离子源且反应气体为甲烷。质谱仪在m/z50-500之间扫描且扫描速度设置为3.21次扫描/s。溶剂延迟设置为0分钟至2.0分钟。
HPLC分析在Agilent HP1000***上进行，其包括G1379A微真空脱气器、G1312A二元泵、G1367A Well板自动进样器、G1316A恒温柱隔室和G1315B二极管阵列检测器。柱：X-Terra MS,Waters,3.0x100mm,3.5μm。柱温设置为40°C且流速设置为1.0mL/min。所述二极管阵列检测器在210-300nm扫描，步宽和峰高分别设置为2nm和0.05分钟。应用线性梯度，起始于100% A(A:95:510mM NH4OAc:MeCN)且结束于100%B(B:MeCN)，4分钟。
HPLC分析也在Gynkotek P580HPG上进行，其包括梯度泵以及配备有Chromolith Performance RP柱(C18,100mm x4.6mm)的Gynkotek UVD 170SUV-vis.-检测器。柱温设置为25°C。应用线性梯度，使用MeCN/0.1三氟乙酸在MilliQ水中的溶液，由10%至100%MeCN在5分钟内进行。流速：3mL/min。
手性纯度分析在SFC Berger Analytix***上进行，其具有Agilent 1100PDA检测器。柱温设置为50°C。采用等度条件，EtOH和CO2的混合物，流速为2.0mL/min。PDA在190-600nm扫描且采用220nm用于纯度确定。
手性HPLC分析可选择地在Gilson手性***柱上进行：Chiralpak AD-H;4.6*250mm;5μm流动相：100%EtOH，流速：0.8mL/min。使用PDR-手性激光旋光计确定旋光度。
微波加热在单模微波腔中进行，其在2450MHz产生持续辐射。
薄层色谱(TLC)在Merck TLC-板(硅胶60F254)上进行且UV显示出斑点。
快速色谱法在CombiCompanionTM上进行，使用RediSepTM正相快速柱或者使用Merck硅胶60(0.040-0.063mm)。快速色谱法所使用的典型溶剂为氯仿/甲醇混合物、二氯甲烷/甲醇混合物、庚烷/乙酸乙酯混合物、氯仿/甲醇/氨水(aq.)混合物以及二氯甲烷/甲醇/NH3(aq.)混合物。
制备性色谱法在Waters自动纯化HPLC上进行，其具有二极管阵列检测器。柱：XTerra MS C8,19x300mm,10μm。MeCN/(95:5 0.1MNH4OAc:MeCN)的狭窄梯度以20mL/min的流速使用。
纯化也在半制备性Shimadzu LC-8A HPLC上进行，其具有配备有Waters
Figure BDA00003042276700122
柱(C18,5μm,100mm x19mm)的Shimadzu SPD-10A UV-vis.-检测器。MeCN/0.1%三氟乙酸在MilliQ水中的溶液的狭窄梯度在10mL/min的流速使用。
可选择地，纯化在制备性Gilson 281(Gilson Pump 322)HPLC上进行，其具有配备有Waters Sunfire柱(150mmx21.2mm)的Gilson 156UV-检测器。MeCN/0.1%甲酸在水中的溶液的狭窄梯度在15mL/min的流速使用。
手性制备性色谱法在SFC Berger Multigram***上进行，其具有KnauerK-2501 UV检测器。柱温设置为35°C。采用EtOH和CO2的混合物的等度条件，流速为50.0mL/min。UV检测器在220nm扫描。UV信号确定馏分收集。
化合物已经使用ACD/命名,版本10.06,来自Advanced ChemistryDevelopment,Inc.(ACD/Labs),Toronto ON,Canada,www.acdlabs.com的软件或者Lexichem,版本1.4,来自OpenEye的软件来命名。
缩写：
Figure BDA00003042276700131
Figure BDA00003042276700141
起始物质
实施例1
1-(甲氧基(甲基)氨基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA00003042276700142
方法1
向2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酸(CAS 102185-35-3, 500mg,2.16mmol)在DCM(5mL)中的溶液中加入EDCI(CAS 25952-53-8,497mg,2.59mmol)并在室温搅拌10分钟。加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(CAS6638-79-5,253mg,2.59mmol)和DIPEA(0.429mL,2.59mmol)在DCM(5mL)中的溶液并将反应混合物在室温搅拌过周末。将混合物用DCM(30mL)稀释并用饱和NaHCO3水溶液(50mL)萃取。将有机相用水洗涤，之后经MgSO4干燥并滤过。将溶剂真空除去得到1-(甲氧基(甲基)氨基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(466 mg, 79%)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.98(s,9H)1.43(s,9H)2.19–2.28(m,1H)3.21(s,3H)3.78(s,3H) 4.66(d,1H)。GC-MS(未保护的氨基酸)m/z130,Rt:5.82分钟。
方法2
向清洁且干燥过的10L反应器中在Tj25°C加入N-boc-叔丁基甘氨酸(N-Boc-叔-亮氨酸,CAS 102185-35-3)(188g;0.77mol;1.00当量)和DCM(6.25L;35vol)，得到精细淤浆。在搅拌下加入一份1,1’-羰基咪唑(208.7g;1.3当量)，在气体排出下约1小时后得到澄清的淡绿色溶液。通过GC监测反应且在室温保持1小时后，在Tj25°C加入第二批1,1’-羰基咪唑(32.1g;0.2当量)并将反应混合物静置过夜。向澄清的反应物中加入N,O-二甲基羟胺(153.7g;2.0当量)，随后加入TEA(215mL;2.0当量)。Tj设置为50°C且反应转化由GC分析进行监测。将第二批N,O-二甲基羟胺(26.9g;0.35当量)和TEA(37mL;0.35当量)加至混合物中并将反应混合物在Tj50°C(Ti41°C)静置48小时，转化率为98.7%。将反应混合物(约pH8)冷却并在Ti20°C将水(2.82L;15vol)加至反应器中并将所得的混合物搅拌10分钟。回收有机层并用水(2x2.82L;2x15vol)、NaHCO3(2x2.3L;2x12vol)洗涤两次且最后用水(2x1.88L;2x10vol)洗涤两次。将有机层在40°C真空浓缩，得到黄色残留油状物，将其与甲苯(250mL)共蒸发，得到295g油性产物，且静置过夜。出现结晶混合物。将混合物滤过(P3烧结滤片；100mm直径)，用甲苯(75mL)洗涤并干燥，得到138g白色结晶物质。得到第二批产物(158g)，溶于热正庚烷(250mL)中，用外部冰水浴冷却，得到56g淡色物质。分析分别得出第一批产物96.8%w/w以及第二批产物72%w/w。总收率(194g)基于NMR测定为82%。
实施例2a
1-(4-氯苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA00003042276700151
将1-(甲氧基(甲基)氨基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(实施例1,466mg,1.70mmol)溶于无水THF(10mL)中。然后在室温逐滴加入(4-氯苯基)溴化镁(CAS873-77-8,1.0M在THF中的溶液,6.79mL,6.79mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用NH4Cl淬灭并用EtOAc(2x50mL)萃取。将合并的有机相用水洗涤一次，经MgSO4干燥并滤过。除去溶剂后，将产物经硅胶柱纯化(用庚烷:EtOAc 10-20%洗脱)得到1-(4-氯苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(137mg,25%)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm0.93(s,9H)1.44(s,9H)5.12(d,1H)5.40(d,1H)7.46(d,2H)7.95(d,2H)。MS(ESI)m/z 325.8[M+H]+。
实施例2b
1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA00003042276700152
向干燥且清洁过的10L冰冷反应器中加入4-溴苄腈(321g;1.74mol;2.5当量)和THF(995mL;5.0vol)。将搅拌的混合物在氮气气氛下惰化并冷却(Tj-20°C)。向冷却的混合物在Ti-13°C在氮气气氛下加入Turbo格氏试剂(来自Chemetall的Turbo格氏试剂，相当于iPrMgCl/LiCl 14% w/w在THF中的溶液;1.81L;2.5当量)，同时在1小时14分钟内将温度保持低于约-10°C。将反应中间体在约0°C静置3小时，转化率为>97%(分析性样品，用15%w/waq NH4Cl淬灭)。将混合物冷却至Ti-20°C并将1-(甲氧基(甲基)氨基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(191g;0.70mol;1.0当量)在THF(496mL;2.6vol)中的溶液在约-10°C至-6°C(放热反应)加至反应器中且保持28分钟。将容器用THF(221mL;1.3L)淋洗，将反应混合物温热至20°C且静置过夜，转化率为约90%(HPLC)。将混合物冷却至0°C(Tj–10)并在30分钟内逐滴加入酒石酸钾钠(罗谢尔盐)(153g;1.05当量)在水(10vol)中的溶液，保持温度在0至10°C，得到橙色淤浆。Tj设置为40°C并在Ti30°C停止搅拌并分离各相。回收红色有机层并将黄色淤浆样水相在Tj30°C用iPrOAc(2x1.91L;2x10vol)萃取两次。合并有机层(7.5L)并在Tj30°C用盐水混合物(3+3vol;5+5vol;3+3vol;)洗涤三次。将洗涤的有机层在Tj60°C真空浓缩为约1.5L的体积且稀释(iPrOAc)为2L。产物溶液无需进一步纯化而直接用于下一步(实施例3,方法2)。
实施例3
4-(2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)苄腈盐酸盐
Figure BDA00003042276700161
方法1
将1-(4-氯苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(实施例2a,2.30g,7.06mmol)和Zn(CN)2(0.87g,7.4mmol)在氮气下溶于DMF(20mL)中。加入Pd(PPh3)4(0.86g,0.74mmol)并将混合物在130°C加热过夜。将混合物冷却至室温，用水稀释并用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。将产物经硅胶柱(EtOAc:己烷1:10)纯化得到1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(961mg,43%)。
在0°C将1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(961mg,3.04mmol)溶于1.25M HCl在MeOH中的溶液中并将混合物在室温搅拌8小时。除去溶剂并将残留物真空干燥得到4-(2-氨基-3,3-二甲基-丁酰基)-苄腈盐酸盐(110mg,93%)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δppm1.02(s,9H)5.05(s,1H)7.96(d,2H)8.20(d,2H)。MS(ESI)m/z 217.1[M+H]+
方法2
在Tj65°C向清洁且干燥的10L反应器中加入丙-2-醇(573mL)和HCl在丙-2-醇中的溶液(5M;696mL;5当量)。在Ti53°C在9分钟内向混合物中分批加入(约150mL)来自上一步(如上所述的实施例2b)的1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯溶液(在加入约600mL后产物开始沉淀析出)。将淤浆搅拌1小时并分析，得到完全转化(GC)。将精细晶状淤浆冷却(Tj0°C)并静置过夜。
将产物在玻璃滤器(2个滤器;P3烧结滤片;130mm直径)上真空分离(在约3小时内缓慢滤过)。将产物在每个滤器中与冷的(0°C)丙-2-醇(496mL;2.6vol)和iPrOAc(650mL;3.4vol)的混合物以及MeTHF(2x425mL;2x3vol)进行置换洗涤。将产物在40°C真空干燥过周末，得到135g白色精细晶状盐酸盐。分析得到HPLC纯度为99.5面积-%(254nm)以及NMR测定为94%w/w。历时两个阶段的收率基于NMR测定为72%。
实施例4
1-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪
Figure BDA00003042276700171
向清洁且干燥的1/2L圆底烧瓶中加入2-氯-6-甲基吡啶(80g;620mmol;1.0当量)和哌嗪(400g;7.40当量)。将混合物使用外部油浴(Tj154°C)加热并进行磁力搅拌。在约6小时反应时间后，认为反应完成(GC分析)并冷却至室温。向冷的混合物中加入甲苯(475mL;6vol)和水(633mL;8vol)，得到两个澄清的相。回收水相并用甲苯(150mL)萃取。合并甲苯层，用盐水(17.5%w/w;150mL)洗涤并真空浓缩得到油状残留物(估计量为88g游离碱)。在室温在1L反应器中将游离碱在MeTHF(790mL;10vol)中的溶液加至HCl水溶液(1N;396mL;5当量)中。回收黄色水相并用外部冰水浴冷却并用NaOH(5M;95mL)碱化为pH>11。将碱性水相用MeTHF(792mL;10vol)萃取，回收水相并将有机层真空浓缩且通过共沸蒸馏干燥。将含有干燥的MeTHF产物的层(470mL;5vol)用外部冰水浴冷却，得到不透明溶液。向溶液中缓慢加入HCl在丙-2-醇(310mL,3.0当量)中的溶液并将灰白色产物沉淀析出。将得到的淤浆在玻璃滤器(P3烧结滤片，100mm直径)上分离，用冰冷的MeTHF(100mL)洗涤。将产物在40°C真空干燥得到101g二盐酸盐(65%)。纯度通过GC确定，得到96.7面积-%，且NMR测定为71.5%w/w(碱)。收率基于NMR测定为75%。
最终化合物
实施例5
N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺
Figure BDA00003042276700181
方法1
将4-(2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)苄腈盐酸盐(实施例3,50mg,0.23mmol)加至CDI(112mg,0.69mmol)和TEA(0.035mL,0.25mmol)在MeCN(5mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌90分钟，之后加入1-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪(CAS 55745-89-6,205mg,1.16mmol)。将混合物搅拌1小时并将溶剂减压蒸发。将产物溶于甲醇中，滤过并经制备性HPLC纯化，得到N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(36.3mg,37%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm0.94(s,9H)2–40(s,3H)3.48-3–68(m,8H)5.25-5–31(m,1H)5.33-5.39(m,1H)6.43(d,1H)6.53(d,1H)7.40(dd,1H)7.78(m,2H)8.14(m,2H)。MS(ESI)m/z 418.3[M-H]-
方法2
在室温在1分钟内将碳酸二(三氯甲基)酯(60.6mg,0.20mmol)分批加至4-(2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)苄腈盐酸盐(实施例3,129mg,0.51mmol)和TEA(0.285mL,2.04mmol)在DCM(2mL)中的溶液中。搅拌20分钟后，逐滴加入1-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪(CAS55745-89-6,90mg,0.51mmol)和TEA(0.142mL,1.02mmol)在DCM(2mL)中的溶液并将反应混合物搅拌90分钟。除去挥发物，之后将反应混合物用MeOH稀释，滤过并经制备性HPLC纯化。收集馏分并冷冻干燥得到N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(76mg,36%)。
1H NMR(500MHz,MeOD)δppm0.99(s,9H)2.36(s,3H)3.53(m,8H)5.30(m,1H)6.34(m,1H)6.57(t,3H)7.44(dd,1H)7.88(m,2H)8.17(m,2H)。MS(ESI)m/z 420.2[M+H]+
方法3
向清洁且干燥的10L反应器中在Tj22°C加入CDI(153.7g;0.74mol;1.5当量)，随后加入DMF(1L;8.0vol)，得到澄清的淡黄色溶液。向上述溶液中在Tj22°C在30分钟内加入10份预先制备的4-(2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)苄腈x HCl(实施例3，由方法2制备;135g;0.50mol;1.0当量)、DMF(1L;8.0vol)和TEA(127g;1.26mol)的混悬液/溶液。将温度升高至25°C并将所得的混合物搅拌30分钟。采集(GC)IPC得到起始物质向咪唑脲中间体的完全转化。Tj设置为5°C并在<10°C将TEA(247.5g;5当量)加至反应混合物中。在33分钟内向混合物中分批加入1-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪x2HCl(实施例4;184g;1.50当量)，保持内部温度<30°C。将反应混合物在Tj25°C搅拌另外的30分钟并采集IPC，得到99.5%的转化(HPLC)。将混合物冷却(Tj5°C)并静置过夜。在5°C在8分钟内向混合物中分批加入NH4Cl(285g;10当量)在水(2.0L;15vol)中的溶液。Tj设置为25°C并向所得的混合物中加入甲苯(2.26L;16.7vol)。将有机相回收并将水相用甲苯(2.26L;16.7vol)萃取一次。合并有机相，用水(500mL;3.7vol)洗涤并用2xHCl(30% w/w;127mL;2当量)在水(2.5L;18.5vol)中的溶液萃取两次。将酸性水相用甲苯(1.1L;8.1vol)洗涤。回收有机层并将水相重新加至反应器中并加入EtOAc(2.3L;17vol)。在25°C向混合物中在搅拌下加入预先制备的NaHCO3(249g;5.9当量)在水(pH8)中的溶液。回收碱性水相，用EtOAc(2.2L;16vol)洗涤，合并有机相并用盐水(400mL)洗涤且将溶液在Tj15°C静置过夜。将有机层(4L)在40°C真空浓缩为约一半体积，与SiO2(约250g)混合并除去溶剂得到硅胶粉末柱头。将硅胶柱头置于预先用EtOAc填充的硅胶柱(120mmx400mm；约4kg SiO2 40-60目筛)上。快速色谱法操作使用约20L EtOAc作为洗脱剂并将操作经TLC监测。TLC分析后收集馏分(约250mL)并在40°C真空浓缩。将得到的产物在40°C真空干燥得到191.5g纯的白色物质。分析得到HPLC纯度为99.7面积-%(254nm)且测定为98.5% w/w。残留溶剂为EtOAc 0.1%w/w。该物质(180g)用于制备预期的对映异构体即N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺。收率基于NMR测定为90%(计算值)。
实施例6
(R)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺
Figure BDA00003042276700201
方法1
将来自实施例5的19mg外消旋化合物经手性色谱法分离得到((R)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺)(5.6mg,30%)。
手性纯度100%，Rt4.42分钟，基于以下***：SFC Berger Analytix，柱：Chiralcel OD-H;4.6*250mm;5μm,流动相：20%EtOH;80%CO2,流速：2mL/min。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm0.93(s,9H)2.29(s,3H)3.43(m,8H)5.11(d,1H)6.52(d,1H)6.59(m,2H)7.42(dd,1H)7.98(d,2H)8.14(d,2H)。MS(ESI)m/z 420.3[M+H]+
方法2
手性制备性色谱法用于制备实施例6，使用高压制备性色谱***。
将外消旋化合物溶于乙醇(25g/L加料溶液)中。固定相为Chiralcel OD(20微米)且流动相为异己烷/乙醇90:10。分离在25°C的温度进行，每次注射时将30mL的填料(0.75g)载至柱上。每15分钟叠加注射以增加分离的效率(流速为120mLs/min)。使用320nm的UV检测波长。收集单一馏分(第一洗脱峰)，周期性地将采集的馏分在HPLC上分析，使用以下条件：ChiralcelOD-H;4.6*250mm;5μm,流动相60:40的异己烷/IPA 1ml/min RT≈8.3分钟。最终手性纯度为100%。收率≈45%。
实施例7
(S)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺
Figure BDA00003042276700211
将来自实施例5的19mg外消旋化合物经手性色谱法分离得到(S)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(4.2mg,22%)。
手性纯度为99.8%，Rt6.34分钟，基于以下***：SFC Berger Analytix,柱：Chiralcel OD-H;4.6*250mm;5μm,流动相：20% EtOH;80% CO2,流速：2mL/min。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm0.94(s,9H)2.29(s,3H)3.42(m,8H)5.12(d,1H)6.52(d,1H)6.60(dd,2H)7.42(dd,1H)7.99(m,2H)8.15(m,2H)。MS(ESI)m/z 420.3[M+H]+
固态表征
(R)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(实施例6)
X-射线粉末衍射(XRPD)图在PANalytical X′Pert PRO MPD θ-θ***上采集，使用长的精细焦点CuKα-辐射，X-射线波长为
Figure BDA00003042276700212
45kV和40mA。使用程序控制的散射狭缝以及程序控制的防散射狭缝，得到10mm的辐射波长。入射光以及衍射光路使用0.02弧度Soller狭缝。入射光路使用20mm固定屏且将镍滤器置于PIXcel-检测器前方(使用255个活性通道)。在平硅零背景板上使用刮铲准备薄平展样品。将板置于试样架上并在测量过程中在水平位置旋转。衍射图在2°2θ和40°2θ之间在连续扫描模式中采集。在2和40°2θ之间扫描的总时间为约10分钟。
(R)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺的衍射图显示于图1中。
振动圆二色性
计算光谱模拟:
在Maestro图形接口(Inc.)内，使用MacroModel，对S对映异构体片段(II)进行用于低能量几何学的Monte Carlo分子力学搜索。使用5kcal/摩尔的最低能量构象异构体范围内的所有构象异构体作为Gaussian03范围内的密度泛函理论(DFT)最小化的起始点。
对于每个构象异构体，确定优选的结构、谐波振动频率/强度、VCD转动强度和STP的自由能(包括零点能)。在这些计算中，B3PW91广义梯度近似值(GGA)交换-关联密度泛函与6-31G*基组组合使用。产生对于每个构象异构体的VCD光谱的模拟且拟合为劳仑士线形(12cm-1谱线宽度)，且计算的光谱为Boltzmann-加权的以允许在模拟和试验光谱之间的直接比较。
VCD试验:
通过将～8mg样品溶于～0.15mL CDCl3中来获得试验光谱。使用双重来源、双重PEM、VCD扫描规程(使用BioTools ChiralIR仪器)，以4cm-1的分辨率在0.1mm BaF2细胞中进行分析。仪器并入双重光测弹性的调节组件以在具有λ/4滞后的37.024kHz的极化调节(对于获取以1300cm-1为中心的光谱区域是最优的)。使用具有30μs时间常数的锁定扩增以及20kHz高通和4kHz低通滤波器。
VCD结果:
图2显示4个光谱。光谱(1)为试验采集的实施例6的光谱。光谱(2)为(R)对映异构体VCD光谱的计算评估，其通过将片段(II)的从头开始计算(ab-initio)的光谱进行倒转来获得。光谱(3)相应于实施例7的试验VCD光谱。光谱(4)为片段(II)的计算光谱，其为(S)-对映异构体。
图2中的光谱1和2提供了作为(R)对映异构体的实施例6的指定。光谱3和4的类似比较表明了实施例7作为(S)对映异构体存在。
生物学评价
确定生物活性的测定
该测定设计为通过监测在全细胞中的细胞内Ca2+水平来检测作用于hTRPA1的化合物。为此，已经设计了针对TRPA1活性的双重加入步骤FLIPR(荧光成像板读取器)测定。简言之，表达TRPA1的HEK293细胞生长于384孔微量滴定板(microtitre plate)中并载入Fluo-4，其为一种报道细胞内钙变化的荧光探针。通过测量在测定缓冲剂中的基线信号、随后施用EC80-浓度的TRPA1-激动剂锌来测定TRPA1通道活性。随后通过TRPA1通道的钙内流作为细胞质内钙增加来检测，其由此也报道作为Fluo-4荧光的增加。通过在加入锌之前5分钟加入化合物来评估测试化合物的活性。TRPA1阻断剂(拮抗剂)抑制由锌加入引起的钙内流且因此未发生Fluo-4荧光的增加。TRPA1开启剂(激动剂)本身引起钙内流且在加入化合物后立即检测到Fluo-4荧光的增加。
在该测定中，TRPA1在HEK293细胞系中的表达受控于诱导型启动子。因此，可以通过比较来自锌刺激物对诱导型和非诱导型细胞的信号来确定TRPA1信号的特异性。
TRPA1被众多引起疼痛的刺激物激活。锌为基本的生物学痕量元素，其刺激在小鼠中在TRPA1-依赖性物质中的伤害性感觉神经元。锌通过独特的机制激活TRPA1，所述机制要求通过TRPA1通道的锌内流以及随后的经特异性细胞内半胱氨酸和组氨酸残基的激活。
将hTRPA1-HEK293-TREx细胞接种于聚-D-赖氨酸包衣板中且在细胞培养基中生长为融合单层细胞。在试验前，弃去培养基并在室温向细胞中载入在测定缓冲剂中的fluo-4NW(分子探针)达1小时。将化合物加至细胞板中并在不含Ca2+的测定缓冲剂中预先孵育5分钟。随后将在含有Ca2+的测定缓冲剂中的200mM Zn2+加至细胞中并使用具有470-495nm的波长的激发LED-组以及具有515-575nm的波长的发射滤波器测量原始荧光计数。典型的测定条件为：测试化合物：30μM至0.001μM，或者在阳性对照和阴性对照中为零；测定缓冲剂pH7.4:含有或者不含有Ca2+和Mg2+的HBSS、10mMHepes、1mM葡萄糖、0.4% NaHCO3、激动剂：200μM氯化锌。将待测试的化合物在100%DMSO中稀释且在试验前在测定缓冲剂中进一步稀释50倍。
在该测定中，100%活性定义为在不存在测试化合物的情况下由200μMZn2+引起的峰值荧光水平。IC50表示需要抑制50%应答时的测试化合物浓度。
对于示例性化合物而言，该测定的数据显示于下表。效能表示为IC50(相对于在钙缓冲剂中的平均信号而言的50%抑制所需的浓度)且所指出的值为至少两个独立试验的平均值。
表1：针对最终化合物的IC50值
实施例         平均IC50(μM)
5(外消旋化合物)   0.2
6(R-对映异构体)   0.06
7(S-对映异构体)   6.8

Claims (10)

1.式(I)的化合物N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺或者其药用盐、对映异构体或者它们的混合物
Figure FDA00003042276600011
2.权利要求1的化合物，其为具有下式的(R)-N-(1-(4-氰基苯基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺或者其药用盐：
Figure FDA00003042276600012
3.权利要求2的化合物或者其药用盐，用作疗法中的药物。
4.权利要求2的化合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途：哮喘、百日咳、尼古丁上瘾、各种疼痛病症诸如急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛和与癌症相关的疼痛。
5.权利要求2的化合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
6.药物组合物，包含权利要求2的化合物以及药用载体。
7.治疗需要所述疗法的受试者中的哮喘、百日咳、尼古丁上瘾、各种疼痛病症诸如急性和慢性疼痛障碍包括但不限于广泛疼痛、局部疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、中枢性疼痛、中枢和外周神经性疼痛、中枢和外周神经源性疼痛、中枢和外周神经痛、慢性腱炎、腰背痛、术后痛、外周神经病、内脏痛、骨盆痛、异常性疼痛、痛性感觉缺失、灼性神经痛、感觉迟钝、纤维肌痛、痛觉过敏、感觉过敏、痛觉过度、局部缺血性疼痛、坐骨疼痛、与膀胱炎相关的疼痛包括但不限于间质性膀胱炎、与多发性硬化相关的疼痛、与关节炎相关的疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、与类风湿性关节炎相关的疼痛和与癌症相关的疼痛的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求2的化合物的步骤。
8.治疗需要所述疗法的受试者中的疼痛的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求2的化合物的步骤。
9.权利要求2的化合物在用于眼部治疗或者用作为“控暴剂”诸如CS或者CR的拮抗剂中的用途。
10.抵消“控暴剂”诸如CS或者CR的效应的方法，包括向患有所述效应的受试者给予治疗有效量的权利要求2的化合物。
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