CN103146600A - 防治烟草青枯病拮抗菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了防治烟草青枯病拮抗菌及其应用，该拮抗菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QJ-1和黑曲霉（Aspergillus niger）Ty-3；其中，QJ-1保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2012年7月5日，保藏号：CCTCC NO:M2012271；Ty-3保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年7月8日，保藏号：CCTCCNO:M2011241。本发明的拮抗菌蜡状芽孢杆菌QJ-1和黑曲霉Ty-3组合可制成菌剂，将菌剂与有机物料发酵制成的微生物有机肥能提供有效营养和功能菌，有效的防治烟草青枯病。

Description

防治烟草青枯病拮抗菌及其应用

技术领域

本发明涉及防治烟草青枯病拮抗菌，同时还涉及该拮抗菌在防治烟草土传病害方面的应用，属于生物防治领域。

背景技术

烟草青枯病是一类重要的烟草土传病害，它通常侵染烟草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。烟草青枯病是一种由布可氏杆菌（Ralstonia solanacearum）引起的***性侵染病，烟株一旦染病往往造成整株死亡，其危害往往是毁灭性的，因此常常给烟草生产造成重大经济损失。烟草青枯病病原菌主要随植物残体遗落于土壤中越冬，也能在种子内或田间其它寄主体内越冬，带菌的土壤、病残组织和含有病菌的有机肥料等是该病的主要初染源，病害的传播主要靠灌溉水、雨水、带病苗、农具、病土以及人畜的活动等。

目前，生产上主要采用抗病品种和作物轮作等农业措施来防治烟草土传病害病，但是由于抗病品种需要抗病基因多样化，并且受环境的影响比较大，防治效果不理想。作物轮作也是防治烟草青枯病的有效方法之一，但是由于我国人多地少，生产中正常的轮作措施无法实现。植物病理学家认为植物发病与寄主、病原菌和环境这三个因素有密切关系，当病原菌与易感寄主相遇在适宜的环境中，植物就开始发病，如果修改或根除这三者中的任何一个，就可以减轻或控制植物病害。

大量研究表明，烟田土壤中不仅存在引起烟草病害的微生物而且也存在多种多样的非致病性的、提高烟草生命力的有益微生物，因而烟草的生物防治以及生态防治日益受到重视。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌对植物的危害，生态防治则是通过向土壤引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多样性等措施，进而使土壤微生态达到平衡，最终通过土壤中不同生物之间的拮抗与竞争实现对土壤病害的防治。

发明内容

本发明的目的是提供防治烟草青枯病拮抗菌。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供防治烟草青枯病拮抗菌，所述的拮抗菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QJ-1和黑曲霉（Aspergillusniger）Ty-3；其中，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QJ-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2012年7月5日，保藏号：CCTCC NO:M2012271；黑曲霉（Aspergillusniger）Ty-3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2011年7月8日，保藏号：CCTCC NO:M2011241。

本发明防治烟草青枯病拮抗菌的筛选方法，包括以下步骤：

1）病原菌分离

选取烟草青枯病发病的烟株，对烟杆进行清洗、消毒，取烟杆上病斑，将感病部位维管束组织切块后放入牛肉膏蛋白胨细菌平板培养；待青枯病病原菌生长为菌丝时，挑取菌落纯化、培养，接种于牛肉膏蛋白胨斜面保存；

2）病原菌致病性鉴定

播撒烟草种子，待烟株生长至有维管束组织时，破坏烟草根部并将培养好的青枯病病原菌的菌悬液倒入根部，保持高温高湿，30d后观察发病情况；

3）土壤微生物的分离

取染病烟株根际周围的土壤，加入无菌水，震荡后静置，对土壤溶液进行浓度梯度稀释，取稀释溶液分别在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和孟加拉红培养基上均匀涂布，培养，挑取单菌落纯化并接种至相应的斜面培养基保存；

4）拮抗菌筛选

将培养的不同土壤微生物与青枯病的病原菌在NA培养基上进行对峙培养，判断有无拮抗作用；

5）拮抗作用测定

用无菌水洗出青枯病病原菌，制备菌悬液，并将菌悬液与NA培养基混合，放置凝固成平板，将对峙培养测出的具有拮抗作用的土壤微生物单个和两两混合接种在平板上培养，测定土壤微生物对病原菌的抑菌斑或抑菌带的大小；

6）对拮抗菌进行形态学观察；

7）对拮抗菌进行鉴定分类。

本发明的目的还在于提供防治烟草青枯病拮抗菌在微生物菌剂方面的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供防治烟草青枯病拮抗菌在微生物菌剂方面的应用。

本发明防治烟草青枯病拮抗菌菌剂的生产方法：将纯化的拮抗菌QJ-1和Ty-3分别接种到NA培养基上，于32℃的培养箱中培养24h，取5mL无菌水倒斜面，轻轻振荡，然后准确吸取lmL菌悬液加入到装有150mL无菌NA液体培养基的250mL三角瓶中，放到32℃的水浴摇床震荡培养1d，然后将培养好的菌悬液按照质量分数10%的接种量分别加入到灭菌的麦麸中，32℃培养3d，风干即为QJ-1和Ty-3的单菌菌剂。单菌菌剂中QJ-1和Ty-3分别达到10⁸cfu/g，然后将两种单菌菌剂按质量1：1的比例混合，即为拮抗菌菌剂。

本发明的目的还在于提供防治烟草青枯病拮抗菌在微生物有机肥方面的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供防治烟草青枯病拮抗菌在微生物有机肥方面的应用。

本发明的防治烟草青枯病拮抗菌微生物有机肥的生产方法：按质量分数8～12%的添加量把菌剂加入腐熟有机肥均匀地混合，调节水分至50～60％，堆成50～80cm的堆垛，堆置5～7d即得。

本发明从改善土壤微生物方面着手，从原位土壤筛选拮抗菌，并研究了防治烟草青枯病拮抗菌在微生物菌剂和微生物有机肥中的应用。拮抗菌与有机肥料混合制得的微生物有机肥料能显著降低烟草青枯病，该肥料提供有效营养和功能菌，并使拮抗菌在土壤中迅速定殖，调节土壤微生态平衡抑制青枯病。通过向烟田施用这种功能性有机肥能够达到提高烟株自身抵御青枯病的能力，提高烟叶品质和减少化肥、农药用量的目的。

附图说明

图1为从原位土壤中分离得到的细菌菌株QJ-1的革兰氏染色；

图2为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-3；

图3为QJ-1和Ty-3混合与青枯病菌对峙生长1天；

图4为Ty-3孢子的显微形态图。

具体实施方式

烟草青枯病病原菌取自福建省邵武市烟区具有较典型病症的烟株，并取病株根际周围的土壤。

培养基的配制：

牛肉膏蛋白胨培养基：NaCl 5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂20g，加水定容至1L，pH7.4～7.6，121℃灭菌20min。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，pH7.4～7.6。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000mL，调pH，121℃灭菌20min。

孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100mL，氯霉素0.1g。上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min。

NA培养基：酵母浸膏12g，蔗糖20g，K₂HPO₄ 4g，琼脂20g，pH7.0～7.2，加水定容到1L，121℃灭菌20min。NA液体培养基与NA培养基的区别在于，NA液体培养基不加琼脂。

麦芽汁琼脂培养基（MEA）：麦芽汁150mL，琼脂3g，pH自然（约6.4），121℃灭菌20min。

实施例1、烟草青枯病拮抗菌的分离与筛选

1）病原菌分离

分离病菌前，先将烟杆冲洗干净，再用75%的酒精对烟杆和小刀消毒，接着在无菌条件下用小刀剖开烟株茎杆上的病斑，将感病部位维管束组织切成若干小块，用灭菌的镊子夹取烟块放入牛肉膏蛋白胨细菌平板培养皿中培养，每皿中放5块，重复3皿，培养温度为32℃，培养时间为48h。待青枯病烟块与培养基接触处长出白色流动性菌落并且向外分散细小菌体，接种于牛肉膏蛋白胨保存。

显微照片显示青枯病病原菌菌体杆状，两端钝圆，有鞭毛，无荚膜，革兰氏染色阴性。

2）致病性鉴定

选用烟草K326为试验品种。于盆钵内将烟草种子播种后，待烟株生长到有维管束组织时，将烟草的根部破坏并将培养好的青枯病病原菌稀释浓度梯度制成菌悬液，于烟草根围倒入50mL菌悬液，并保持高温高湿。30d后观察发病情况。

根据Koch氏法则，将青枯病发病烟株中分离的病原菌株接种到健康烟草植株上，以测定其致病性。将分离出的青枯病病原供试菌株接种20株健康烟草，经过30d后有15株烟草出现了青枯病症状。

3）土壤微生物的分离

取得青枯病烟株根际周围的土壤10g，放入90mL无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置20min，然后稀释至10^-4、10^-5和10^-6g/mL，分别吸取不同浓度的溶液0.1mL在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和孟加拉红培养基上均匀涂布，每种重复3皿，置于32℃温箱中培养48h后，挑取单菌落进行纯化并移入相应的斜面培养基上保存。

经过平板稀释涂布分离，从土壤中共获得5种细菌、4种真菌和4种放线菌。将细菌分别编号为QJ-1到QJ-5，真菌编号为Ty-1到Ty-4，放线菌编号为QF-1到QF-4。细菌中QJ-1为革兰氏阳性菌，其余4株菌均为革兰氏阴性菌，QJ-1革兰氏染色照片如图1所示。Ty-3的菌落形态图如图2所示。

4）拮抗菌株的筛选

将分离得到的土壤微生物和青枯病病原菌在NA培养基上进行对峙培养。培养基涂布青枯病病原菌，中间接种分离得到的土壤微生物，两菌相距均为3mm，于2d后检查培养结果，根据菌落发展速度、菌落之间有无抑制带等来判断分离的土壤微生物对病原菌有无拮抗作用。

通过对峙培养，从分离得到的土壤微生物中筛选出3株对烟草青枯病病菌具有拮抗作用的菌株，分别为QJ-1、QJ-3和Ty-3。

5）拮抗作用测定

用无菌水洗出培养24h的青枯病的病原菌，制成菌悬液，吸取1mL的菌悬液于灭菌后的培养皿中，然后倒入45-50℃的的NA培养基15mL，放置2h凝固后成平板，将对峙培养测出的具有拮抗作用的土壤微生物单个和两两混合接种在平板上培养，每种重复3皿，于32℃下培养2d后观察病原菌的生长情况，并测定土壤微生物对病菌的抑菌斑或抑菌带的大小，其中QJ-1和Ty-3混合菌抑菌带最大，达到9mm，具有较好的抑制青枯病病原菌的作用，如图3所示。

6）拮抗机理

QJ-1和Ty-3对烟草青枯病病菌的拮抗机理：

QJ-1和Ty-3能产生某些代谢产物，该物质能有效抑制青枯病病原菌的生长，两者混合互相促进抑制病原菌物质的产生，增强抑菌能力。

实施例2、形态学观察

QJ-1菌初期菌落平展，乳白色，光滑，不透明。

Ty-3菌初期白色菌丝，后产生深棕色或黑褐色孢子，孢子丰富。

实施例3、拮抗菌的鉴定分类

经中科院微生物研究所鉴定结果为：

1、QJ-1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

1）细胞形态及理化试验结果

革兰氏阳性，细胞为杆状，细胞直径大于1μm，形成芽孢，芽孢不膨大；VP试验、甲基红试验、淀粉水解、分解酪素、水解明胶、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原反应、利用柠檬酸盐均呈阳性；产酸反应表现为：葡萄糖阳性，木糖、L-***糖、甘露醇、乳糖阴性。

2）16S rRNA基因序列测定结果

GCAGTCGAGC GATGGATTAA GAGCTTGCTC TTATGAAGTT AGCGGCGGAC

GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCCAT AAGACTGGGA TAACTCCGGG

AAACCGGGGC TAATACCGGA TAACATTTTG AACTGCATGG TTCGAAATTG

AAAGGCGGCT TCGGCTGCCA CTTATGGATG GACCCGCGTC GCATTAGCTA

GTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCAAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA

GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG

GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC GGAGCAACGC

CGCGTGAGTG ATGAAGGCTT TCGGGTCGTA AAACTCTGTT GTTAGGGAAG

AACAAGTGCT AGTTGAATAA GCTGGCACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA

GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC

GTTATCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGCGCG CGCAGGTGGT TTCTTAAGTC

TGATGTGAAA GCCCACGGCT CAACCGTGGA GGGTCATTGG AAACTGGGAG

ACTTGAGTGC AGAAGAGGAA AGTGGAATTC CATGTGTAGC GGTGAAATGC

GTAGAGATAT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTTTC TGGTCTGTAA

CTGACACTGA GGCGCGAAAG CGTGGGGAGC AAACAGGATT AGATACCCTG

GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGAGG GTTTCCGCCC

TTTAGTGCTG AAGTTAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGCCG

CAAGGCTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC

ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC

CTCTGAAAAC CCTAGAGATA GGGCTTCTCC TTCGGGAGCA GAGTGACAGG

TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC

GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CATCATTAAG TTGGGCACTC

TAAGGTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT

CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGACGGTAC

AAAGAGCTGC AAGACCGCGA GGTGGAGCTA ATCTCATAAA ACCGTTCTCA

GTTCGGATTG TAGGCTGCAA CTCGCCTACA TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA

ATCGCGGATC AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC

CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGG TGGGGTAACC

TTTTCAAAAT

3）gyrB基因序列测定结果

TGACGGCGGC GGTTATAAAG TTTCTGGTGG TTTGCATGGT GTTGGGGCAT

CTGTAGTAAA TGCTCTATCA ACAGAACTAG AGGTATTTGT ACATCGTGAA

GGTAAAATCC ATTATCAAAA ATACGAAAGA GGTATTCCAG TTGCGGATTT

AAAAGTCATT GGTGACACAG ATCAAACAGG AACGATAACT CGATTTAAAC

CAGATCCAGA AATTTTTCAG GAAACAACAG TATACGAATT CGATACGCTA

GCAACTCGTA TGCGTGAATT AGCATTTTAA ATCGTAATAT TAAATTGACG

ATTGAAGATA AACGTGAACA TAAGCAAAAG AAAGAATTCC ATTACGAAGG

TGGAATTAAA TCATATGTTG AGCATTTAAA CCGCTCAAAA CAACCAATCC

ATGAAGAACC TGTATATGTA GAAGGATCAA AAGATGGTAT TCAAGTTGAG

GTTTCCTTAC AGTATAACGA AGGATATACA AATAATATTT ACTCATTTAC

GAATAACATT CATACGTATG AAGGTGGAAC ACATGAAGTA GGTTTTAAAA

CAGCTTTAAC TCGTGTGATT AACGATTACG GTCGTAAAAA TAGTATTTTA

AAAGATGCAG ACAGTAACTT AACTGGCGAG GATGTTCGTG AAGGTTTAAC

TGCAATCGTA TCAATTAAAC ATCCAAATCC ACAATTTGAA GGACAAACGA

AGACGAAACT TGGGAATAGT GAAGCGAGAA CGATTACAGA GTCTGTGTTT

TCAGAGGCAT TTGAAAAGTT CTTACTAGAA AACCCAAACG TTGCACGAAA

AATTGTGGAA AAAGGTACGA TGGCAGCACG TGCGCGTGTT GCAGCGAAAA

AAGCACGTGA ATTAACACGC CGTAAGAGTG CGTTAGAAGT TTCAAGCTTA

CCTGGTAAAT TAGCAGATTG CTCTTCAAAA GATCCAGCAA TTAGCGAAAT

TTATATTGTA GAGGGTGATT CTGCCGGCGG ATCAGCAAAG CAAGGTCGTG

ACCGTCACTT CCAGGCGATT TTACCGCTAA AGGGTAAAAT TATTAACGTT

GAAAAAGCAA GATTAGATAA AATTTTATCT AACGATGAAG TGCGTACAAT

TATTACTGCA ATTGGTACGA ACATTGGCGG AGATTTTGAT ATTGAGAAAG

CTCGTTATCA TAAAGTTATT ATTATGACGG ACGCCGACGT CGACGGCTCG

CACATCCG

4）发酵条件

种子培养基为NA液体培养基，发酵初始pH为7.5，250mL三角瓶装瓶量为150mL，32℃摇床转数为150r/min，发酵时间为24h，以质量分数10%的接种量接种到麸皮中培养72h后，自然晾干至水分含量小于30%。

2、Ty-3为黑曲霉（Aspergillus niger）

1）菌落形态及显微特征

麦芽汁琼脂培养基（MEA）上菌落生长快，25℃黑暗条件下7天菌落直径50～63mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头深褐色至黑褐色，初期球形，后期裂开为几个柱状结构；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。

分生孢子梗高大，宽6～15μm，壁光滑，直或弯曲；顶囊球形，直径22～30μm，全部表面可育；产孢结构双层；分生孢子近球形，浅到褐色，壁粗糙或具小刺，3.0～4.8μm。未见有性孢子如图4所示。

2）rRNA基因序列测序结果：

（包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2区全序列及28S rRNA序列片段）

GATCCGAGGTCACCTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCCACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC

4）发酵条件

种子培养基为NA液体培养基，发酵初始pH为7.5，250mL三角瓶装瓶量为150mL，32℃摇床转数为150r/min，发酵时间为24h，以质量分数10%的接种量接种到麸皮中培养72h后，自然晾干至水分含量小于30%。

实施例4、拮抗菌菌剂的生产

将纯化的拮抗菌QJ-1和Ty-3分别接种到NA斜面培养基上，于32℃的培养箱中培养24h，取5mL无菌水倒斜面，轻轻振荡，然后准确吸取lmL菌悬液加入到装有150mL无菌NA液体培养基的250mL三角瓶中，放到32℃的水浴摇床震荡培养1d，然后将培养好的菌悬液按照质量分数10%的接种量分别加入到灭菌的麦麸中，32℃培养3d，风干即为QJ-1和Ty-3的单菌菌剂。单菌菌剂中QJ-1和Ty-3分别达到10⁸cfu/g，然后将两种单菌菌剂按质量1：1的比例混合，即为拮抗菌菌剂。

实施例5、微生物有机肥的生产

按质量分数10%的接种量把拮抗菌菌剂加入腐熟有机肥中均匀地混合，调节水分至50-60％，堆成80cm的堆垛，堆置5d后即得。

腐熟有机肥的制备方法：畜禽粪便调节水分至50-60％，堆成1.1m高，每天翻堆，堆肥温度逐渐升高，当温度下降至接近室温时，发酵结束，即为腐熟的有机肥。

实验例1、防治烟草青枯病效果分析

1、2012年在福建省邵武市烟区进行大田试验

1）施肥时期：

本发明通过两次施用微生物有机肥达到抑制青枯病的目的。第一次，将微生物有机肥以基肥形式施入，使土壤中有益菌在烟株生长的前期就能够大量增加，从而抑制病原菌在土壤中的生长，使其数量大大减少。第二次，在当地青枯病即将发生时以追肥（高浓度菌肥:水=1:10）的形式施入，利用有益菌的大量繁殖来抵抗青枯病菌的生长和繁殖。

2）供试土壤及区组设计：

土壤为砂质壤土，地势平坦，排灌方便，基础肥力为：有机质40.6g/kg、碱解氮198.5mg/kg、速效磷（P₂O₅）20.52mg/kg、速效钾(K₂O)80.43mg/kg，pH为5.52。供试烤烟品种为K326。采用漂浮育苗技术育苗，用膜下小苗移栽技术移栽，移栽后按优质烟生产技术规范要求进行管理。每个处理三个重复，各小区的栽培技术措施、管理操作要求基本保持一致。

试验共设置四个处理：

处理A：对照，当地常规施肥与管理；

处理B：微生物有机肥以基肥（250g/株）形式施入；

处理C：微生物有机肥以基肥（200g/株）＋追肥（灌根50g/株）形式施入；

处理D：微生物有机肥以追肥（灌根50g/株）形式施入。

3）调查测定项目

在当地青枯病发病期间，观察记录不同处理青枯病初发病的日期、发病率及发病速度并计算病情指数，从发病开始，每周记录一次；病情分级标准按全国烟草行业烟草病害调查分级标准Yc/T39—1996进行，青枯病调查方法：0级，全株无病；1级，茎部偶有退绿条斑，或(和)以下叶片或顶叶轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；2级，茎部有明显黑色条斑但未达烟株顶部，或(和)病侧半数以上或部分腰叶以上叶片凋萎；3级，茎部黑色条斑到达烟株顶部，或(和)病侧叶片全部凋萎，或全株大部分叶片凋萎；4级，病株枯死。病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/T40-1996计算：

福建省邵武市烟区大田试验结果如表1所示。从表1中可以看出，施用本发明的微生物有机肥，烟草青枯病的发病率减少了98%以上，病情指数明显下降，说明本发明的微生物有机肥具有良好的防治烟草青枯病的效果。

表1 2012年福建邵武市大田试验防治青枯病效果

处理	A	B	C	D
					发病率	71.95%	3.11%	1.21%	4.34%
病情指数	33.83%	0.98%	0.67%	1.34%

实验例2、烟草的烟叶产量和质量分析

将实验例1中2012年福建邵武市大田试验的烟草进行烟叶产量和质量分析，结果如表2。

表2 2012年福建邵武市大田试验的烟草烟叶产量和质量分析

从表2中可以看出，施用本发明的微生物有机肥后，烟草烟叶的质量和产量均有较大的提高。

Claims (4)

1.防治烟草青枯病拮抗菌，其特征在于，所述的拮抗菌为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)QJ-1和黑曲霉（Aspergillus niger）Ty-3；其中，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QJ-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2012年7月5日，保藏号：CCTCCNO:M2012271。

2.根据权利要求1所述的防治烟草青枯病拮抗菌，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergillusniger）Ty-3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2011年7月8日，保藏号：CCTCC NO:M2011241。

3.防治烟草青枯病拮抗菌在微生物菌剂方面的应用。

4.防治烟草青枯病拮抗菌在微生物有机肥方面的应用。

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